4 Lampiran 1
RINGKASAN PENGKAJIAN KEAMANAN PAKAN CANOLA PRG EVENT MS8
I. PENDAHULUAN
Canola PRG event MS8 merupakan produk rekayasa genetik dari PT Bayer Indonesia yang sejak tanggal 1 Agustus 2018 penelitian dan pengembangan terkait produk ini secara global kepemilikannya dialihkan ke PT BASF Indonesia.
Sehubungan dengan adanya permohonan dari PT Bayer Indonesia untuk melakukan pengkajian keamanan pakan Canola PRG event MS8 sebelum diedarkan dengan surat No. 003/BCS-Seeds/GM/VI/2018 tanggal 6 Juni 2018 dan surat dari PT BASF Indonesia No. SP 326/AP/XI/2018 tanggal 6 November 2018 tentang konfirmasi penerimaan kepemilikan event dari PT Bayer Indonesia, serta Surat Penugasan Pengkajian Keamanan Pakan Canola PRG event MS8 No. B-125/KKH PRG/12/2020 tanggal 30 Desember 2020 dari Ketua KKH PRG, TTKH PRG Bidang Keamanan Pakan telah melakukan pengkajian keamanan pakan terhadap Canola PRG event MS8. Pelaksanaan pengkajian dilakukan berdasarkan Peraturan Pemerintah Republik Indonesia No. 21 Tahun 2005 tentang Keamanan Pakan PRG, Peraturan Menteri Pertanian No.
36/Permentan/LB.070/8/2016 Tahun 2016 tentang Pengkajian Keamanan Pakan PRG, dan Keputusan Kepala Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian No. 466.2/Kpts/OT.210/H/11/2016 Tahun 2016 tentang Pedoman Teknis Tata Cara dan Mekanisme Pengkajian Keamanan Pakan PRG.
Canola PRG event MS8 mengandung dua gen sisipan, yaitu gen bar dan gen barnase. Gen bar mengode protein phosphinothricin acetyltransferase (PAT) yang memberikan sifat toleransi terhadap herbisida amonium glufosinat, yang merupakan bahan aktif herbisida phosphinothricin yang digunakan dalam pengendalian gulma pada tanaman canola. Ekspresi gen bar yang disisipkan di dalam Canola PRG event MS8 mencegah amonium glufosinat yang menimbulkan fitotoksik terhadap tanaman canola. Sementara, gen barnase mengode enzim barnase yang menghambat aktivitas enzim ribonuclease (RNase) yang menyebabkan tanaman jantan steril (male sterility).
Canola PRG event MS8 telah memperoleh sertifikat aman pangan di 10 negara, yaitu Kanada (1997), Amerika Serikat (1998), Jepang (2001), Australia dan Selandia Baru (2002), Korea Selatan dan Uni Eropa (2013), Taiwan (2015), Filipina (2018), dan Indonesia (berdasarkan Surat Keputusan Kepala Badan Pengawasan Obat dan Makanan No. HK 02.02.1.5.01.21.62 Tahun 2020).
Canola PRG event MS8 telah memperoleh sertifikat aman pakan di 7 negara, yaitu Kanada (1996), Amerika Serikat (1999), Jepang (2003), Uni Eropa (2007),
5
Filipina (2018), Korea Selatan (2012), dan Taiwan (berdasarkan sertifikat No.
GMF20170076 yang dikeluarkan oleh Ministry of The Council of Agriculture pada tahun 2017).
Canola PRG event MS8 juga telah memperoleh sertifikat aman lingkungan di 5 negara, yaitu Kanada (1996), Amerika Serikat (1999), Jepang (2006), dan Australia dan Selandia Baru (2003).
Berdasarkan Peraturan Menteri Pertanian No. 36/Permentan/LB.070/8/2016 Tahun 2016 tentang Pengkajian Keamanan Pakan PRG dan Keputusan Kepala Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian No.
466.2/Kpts/OT.210/H/11/2016 Tahun 2016 tentang Pedoman Teknis Tata Cara dan Mekanisme Pengkajian Keamanan Pakan PRG, TTKH PRG Bidang Keamanan Pakan telah melakukan pengkajian keamanan pakan Canola PRG event MS8 berdasarkan informasi genetik dan informasi keamanan pakan sebagaimana diuraikan berikut ini.
II. INFORMASI GENETIK II.1 Elemen Genetik
Canola PRG event MS8 mengandung kaset gen bar dan gen barnase. Gen bar mengode enzim PAT dan memberikan sifat toleransi terhadap herbisida amonium glufosinat (Thompson et al., 1987) dengan promotor pSsuAt dan terminator 3´g7, sedangkan gen barnase mengode enzim barnase yang menghambat aktivitas enzim RNase yang menyebabkan tanaman jantan steril (male sterility) dengan promotor pTa29 dan terminator 3’nos (Hartley, 1988).
Analisis Southern Blot menunjukkan bahwa Canola PRG event MS8 mengandung masing-masing satu kopi sisipan gen bar dan gen barnase serta tidak terdeteksinya sekuen backbone dari plasmid pTHW107 (Back, 2014).
II.2 Sumber Gen Sisipan
Sumber gen sisipan Canola PRG event MS8, yaitu gen bar berasal dari Streptomyces hygroscopicus, promotor pSsuAt berasal dari Arabidopsis thaliana, dan terminator 3´g7 berasal dari Agrobacterium tumefaciens (Dhaese et al., 1983; Krebbers et al., 1988; Thompson et al., 1987).
Gen barnase berasal Bacillus amyloliquifaciens (Hartley, 1988) dengan promotor pTa29 yang berasal dari tembakau (Nicotiana tabacum) dan terminator 3’nos berasal dari gen nopaline synthase dari A. tumefaciens (Depicker et al., 1982).
II.3 Sistem Transformasi
Canola PRG event MS8 dirakit menggunakan plasmid pTHW107 melalui metode transformasi yang dimediasi oleh A. tumefaciens dengan eksplan hipokotil
6
canola genotipe Drakkar. Plasmid pTHW107 membawa dua kaset, yaitu kaset barnase berisi gen barnase dengan promotor pTa29 dan terminator 3’nos, dan kaset bar berisi gen bar dengan promotor pSsuAt dan terminator 3´g7 (De Block et al., 1989; Verhaeghe, 2012). Setelah induksi embriogenesis somatik dan regenerasi ke planlet dan seterusnya, seleksi dilakukan dengan penyemprotan herbisida amonium glufosinat. Tanaman yang hidup ditransfer ke rumah kaca untuk pembungaan, pengaturan benih, dan karakterisasi lebih lanjut.
II.4 Stabilitas Genetik
Hasil analisis Southern Blot Canola PRG event MS8 menunjukkan bahwa T-DNA stabil sampai lima generasi (BC3) dan diwariskan mengikuti hukum Mendel (Back, 2014; De Both dan Huybrechts, 1998; Mertens, 2014; Weston, 1998).
Berdasarkan hasil kajian informasi genetik dapat disimpulkan bahwa:
a. Canola PRG event MS8 mengandung masing-masing satu kopi sisipan gen bar dan gen barnase, serta tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid transformasi pTHW107;
b. gen bar dan gen barnase pada Canola PRG event MS8 stabil sampai lima generasi (BC3) dan diwariskan mengikuti hukum Mendel.
III. INFORMASI KEAMANAN PAKAN III.1 Kesepadanan Substansial
Pengkajian kesepadanan substansial biji Canola PRG event MS8 dan biji canola non-PRG (varietas Drakkar) dilakukan berdasarkan dokumen study report No.
02 B 004, Bayer CropScience, GmbH (Oberdörfer, 2003). Penelitian dilakukan di Covance Laboratories, Inc. (3301 Kinsman Boulevard, Madison, WI 53704, AS).
Laboratorium ini telah menerapkan Good Laboratory Practices (GLP). Penilaian komposisi kimia dilakukan sesuai dengan dokumen konsensus OECD tentang senyawa untuk varietas canola baru (OECD, 2001).
Bahan yang digunakan untuk uji kesepadanan substansial adalah biji yang diperoleh dari tanaman Canola PRG event MS8 dan canola non-PRG hibrida sebagai kontrol. Percobaan penanaman canola dilakukan pada tahun 2001 dan 2002 di 10 lokasi berbeda di Belgia, Eropa Utara, yaitu (1) Herzele, (2) Dikkele, (3) Zwalm, (4) Salles-Chimay, (5) Massemen, (6) Macon-Chima, (7) Velzeke), (8) Estampuis, (9) Smetlede, dan (10) Borsbeke. Di setiap lokasi, canola ditanam mengikuti rancangan Randomized Complete Block. Sesuai dengan perlakuannya, ada tanaman yang memperoleh perlakuan herbisida amonium glufosinat.
Analisis pada sampel biji canola meliputi proksimat (kadar air, abu, karbohidrat, protein, dan lemak), serat, 9 jenis mineral (kalsium, fosfor, kalium, magnesium, natrium, besi, mangan, tembaga, dan seng), vitamin E (alfa-tokoferol, beta-
7
tokoferol, gama-tokoferol, dan total-tokoferol), 18 jenis asam amino (arginin, asam aspartat, sistein, asam glutamat, glisin, histidin, isoleusin, leusin, fenilalanin, prolin, tirosin, valin, alanin, lisin, metionin, serin, treonin, dan triptofan), 13 jenis asam lemak (asam palmitat, asam stearat, asam arakidat, asam bahenat, asam lignoserat, asam palmitoleat, asam heptadesenoat, asam oleat, asam eikosanoat, asam linoleat, asam linolenat, asam dokosapentaenoat, dan asam dokosaheksaenoat), dan zat antigizi (asam fitat dan glukosinolat).
Hasil analisis komposisi biji canola menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata pada komposisi proksimat, serat, asam amino, asam lemak, vitamin E, dan antigizi antara Canola PRG event MS8 dan canola kontrol (non-PRG).
Semua nilai pengamatan masuk ke dalam kisaran komposisi kimia canola pada umumnya (OECD, 2001; OECD, 2011).
Berdasarkan pengkajian kesepadanan substansial dapat disimpulkan bahwa biji Canola PRG event MS8 sepadan dengan biji Canola non-PRG (kontrol).
III.2 Toksisitas
Kajian toksisitas dilakukan terhadap protein PAT/bar dan protein Barnase melalui studi bioinformatika, uji kecernaan protein secara in vitro, dan uji toksisitas oral akut.
III.2.1 Studi bioinformatika protein PAT/bar (protein PAT yang dikode oleh gen Bar) dan protein Barnase
Studi bioinformatika dilakukan dengan membandingkan homologi sekuen asam amino protein PAT/bar dengan toksin-toksin yang telah diketahui secara umum.
Pencarian kesamaan sekuen protein PAT/bar dan Barnase dilakukan terhadap sekuen protein yang terdapat dalam basis data NCBI non-redundant yang terdiri atas Genebank CDS, PDB, Uniprot_Swissprot, PIR Protein Sequence Database (PIR-PSD), dan PRF/SEQDB. Analisis dilakukan dengan program FASTA dengan nilai ambang batas E value sebesar 0,1.
Selanjutnya, dilakukan pencarian kesamaan toksin PAT terhadap 49.681 toksin berdasarkan basis data Bayer Toxin Database (BCS) tahun 2017 dengan program FASTA dengan ambang batas E value sebesar 10. Hasil analisis menunjukkan bahwa protein PAT/bar tidak mempunyai kesamaan sekuen asam amino dengan toksin yang telah diketahui (Capt, 2017).
Pencarian kesamaan toksin Barnase terhadap 24.496 toksin berdasarkan basis data BCS tahun 2016 versi 16.1. Hasil analisis menunjukkan bahwa protein Barnase tidak mempunyai kesamaan sekuen asam amino dengan toksin yang telah diketahui (Oberdörfer, 2003).
8
III.2.2 Uji kecernaan in vitro protein PAT/bar dan protein Barnase Analisis kadar protein PAT/bar dan protein Barnase pada biji Canola PRG event MS8 dilakukan dengan metode Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) berdasarkan study report No. 02 B 004, Bayer CropScience (Oberdörfer, 2003).
Kedua protein tersebut ditemukan dalam jumlah yang sangat kecil, yaitu 0,419–
0,885 μg/g berat kering untuk protein PAT/bar dan di bawah limit of detection (LOD = 0,00750 μg/g berat basah) untuk protein Barnase.
Oleh karena kadarnya yang sangat kecil pada Canola, pada pengujian kecernaan protein, baik protein PAT/bar maupun protein Barnase, keduanya diproduksi pada bakteri Escherichia coli masing-masing dengan kemurnian 65,82% untuk protein PAT/bar dan 97,00% untuk protein Barnase. Hasil analisis menunjukkan bahwa protein PAT/bar dan protein Barnase yang dihasilkan oleh bakteri E. coli ekuivalen dengan protein PAT/bar dan protein Barnase yang dihasilkan oleh Canola PRG event MS8 (Mertens, 2012; Moens, 2012).
Analisis kecernaan protein PAT/bar (konsentrasi 1,244 mg/ml) dan protein Barnase (konsentrasi 0,95 mg/ml) dilakukan melalui uji simulasi cairan lambung (Simulated Gastric Fluid/SGF) dan simulasi cairan usus (Simulated Intestinal Fluid/SIF) pada rentang waktu 60 menit pada suhu 37°C, sesuai protokol standar Internasional Life Sciences Institute (ILSI) (Thomas et al., 2004). Hasil pencernaan protein selanjutnya dievaluasi dengan metode SDS-PAGE dan Western Blot.
Pengujian SGF protein PAT/bar dilakukan berdasarkan study report No. SA 09045, Bayer SAS, Crop Science Division (Rascle, 2009), sedangkan untuk protein Barnase berdasarkan study report No. SA 11361, Bayer SAS, Crop Science Division (Lautraite, 2012). Pengujian dilakukan dengan menginkubasi protein PAT/bar dan protein Barnase dalam SGF yang mengandung enzim pepsin pada pH 1,2 selama interval waktu 0; 0,5; 2; 5; 10; 20; 30; 60 menit.
Sebagai kontrol digunakan protein horseradish peroxidase (HRP) dan ovalbumin (OVA) yang masing-masing diketahui dapat dicerna secara cepat dan lambat.
Pengujian SIF protein PAT/bar dilakukan berdasarkan study report No. SA 09046, Bayer SAS, Crop Science Division (Rascle, 2016), sedangkan untuk protein Barnase berdasarkan study report No. SA 11362, Bayer SAS, Crop Science Division (Rouquie, 2016). Protein PAT/bar dan protein Barnase diinkubasi dalam SIF yang mengandung enzim pankreatin pada pH 7,5 selama interval waktu 0; 0,5; 2; 5; 10; 20; 30; 60 menit.
Hasil pengujian kecernaan SGF menunjukkan bahwa >90% protein PAT/bar dan protein Barnase telah tercerna dalam waktu 30 detik. Hasil pengujian kecernaan SIF menunjukkan bahwa >90% protein PAT/bar telah tercerna dalam waktu 30 detik, sedangkan protein Barnase tercerna secara lamban dan belum terdegradasi sempurna dalam waktu 60 menit.
9
Disimpulkan bahwa protein PAT/bar dan protein Barnase dapat terdegradasi dengan cepat di dalam lambung. Pencernaan di dalam usus halus menunjukkan protein PAT/bar dapat terdegradasi dengan cepat, sedangkan protein Barnase terdegradasi secara lamban.
III.2.3 Uji toksisitas oral akut protein PAT/bar dan protein Barnase Materi uji yang digunakan pada uji toksisitas oral akut untuk Canola PRG event MS8 adalah protein rekombinan PAT/bar dengan kemurnian 98% dan protein Barnase dengan kemurnian 100%. Kedua protein tersebut merupakan protein rekombinan yang dihasilkan dari E. coli.
Kajian toksisitas oral akut terhadap protein PAT/bar dilakukan berdasarkan dokumen study report No. SA 13239 (Blanck, 2014). Pengujian dilakukan dengan menggunakan 40 ekor hewan coba mencit C57BL/6J yang berasal dari Charles River Laboratories (Saint Germain sur l’Arbresle, Prancis) yang diaklimatisasi selama 6 hari.
Mencit berumur 8 minggu dengan kisaran bobot badan 17,4 g sampai 19,6 g (jantan) dan 13,7 g sampai 15,7 g (betina) yang dibagi menjadi 2 kelompok.
Setiap kelompok terdiri atas 10 ekor jantan dan 10 ekor betina. Kelompok kontrol diberi larutan pembawa (PBS), dan kelompok perlakuan diberi protein PAT/bar secara oral dengan dosis tunggal 2.000 mg/kg BB. Pengamatan dilakukan selama 14 hari terhadap kelainan gejala klinis, jumlah konsumsi pakan, kenaikan bobot badan, dan kematian. Setelah itu, dilakukan nekropsi untuk melihat perubahan makroskopik berupa kerusakan organ dalam.
Hasil yang diperoleh dari uji toksisitas oral akut terhadap protein PAT/bar menunjukkan tidak ada kelainan gejala klinis, perbedaan jumlah konsumsi pakan, perbedaan kenaikan bobot badan, dan kematian mencit pada kelompok kontrol dan perlakuan. Pada pemeriksaan makroskopik juga tidak ditemukan adanya perubahan makroskopik pada organ dalam mencit.
Kajian toksisitas oral akut terhadap protein Barnase dilakukan berdasarkan dokumen study report No. SA 14025 (Totis, 2014). Pengujian dilakukan menggunakan 24 ekor hewan coba mencit C57BL/6J berasal dari Charles River Laboratories (Saint Germain sur l’Arbresle, Prancis). Mencit berumur 8 minggu dibagi menjadi 2 kelompok, yaitu kelompok kontrol dan perlakuan masing- masing 6 ekor jantan dan 6 ekor betina. Bobot badan mencit jantan berkisar antara 18,4 g dan 20,3 g dan mencit betina berkisar antara 13,6 g dan 17,1 g.
Mencit pada kelompok kontrol dicekok dengan larutan pembawa Na2CO3 50mM (pH 9,6), sedangkan mencit pada kelompok perlakuan dicekok protein Barnase dengan dosis 2.000 mg/kg BB. Pengamatan dilakukan selama 14 hari terhadap kelainan gejala klinis, jumlah konsumsi pakan, kenaikan bobot badan, dan kematian. Semua mencit diterminasi pada hari ke-15 dengan inhalasi isoflurane dan dilakukan nekropsi untuk melihat adanya perubahan makroskopik pada organ dalam mencit.
10
Hasil yang diperoleh dari uji toksisitas oral akut terhadap protein Barnase menunjukkan tidak ada kelainan gejala klinis, perbedaan jumlah konsumsi pakan, perbedaan kenaikan bobot badan, dan kematian mencit pada kelompok kontrol dan perlakuan. Pada pemeriksaan makroskopik juga tidak ditemukan adanya perubahan pada organ dalam mencit.
Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa pemberian protein PAT/bar dan protein Barnase secara oral masing-masing dengan dosis 2.000 mg/kg BB tidak menyebabkan toksisitas pada mencit.
Berdasarkan uji toksisitas protein PAT/bar dan protein Barnase untuk Canola PRG event MS8 yang dilakukan melalui studi bioinformatika, uji kecernaan in vitro, dan toksisitas oral akut, dapat disimpulkan:
a. tidak ada kemiripan antara protein PAT/bar dan protein Barnase dengan protein toksin yang telah diketahui;
b. protein PAT/bar dan protein Barnase cepat tercerna;
c. protein PAT/bar dan protein Barnase tidak bersifat toksik.
III.3 Studi Pakan
Tujuan dilakukannya studi pakan pada broiler ialah menunjukkan bahwa ransum yang mengandung Canola PRG event MS8 tidak memberikan efek negatif dibanding dengan ransum yang mengandung canola non-PRG. Studi pakan dilakukan di Springborn Smithers Laboratories (North Carolina, AS) (Stafford, 2005) berdasarkan persyaratan Good Laboratory Practice Regulations yang berlaku (Japan MAFF, 2000; OECD, 1997; US EPA, 1989).
Penelitian dilakukan selama 42 hari menggunakan ayam broiler Ross #708 umur 0 hari (Rose Hill Poultry, Pittsboro, North Carolina, AS). Sepuluh ekor ayam broiler secara acak, campuran jantan dan betina, dimasukkan dalam satu kandang. Ulangan sebanyak 14 sehingga setiap perlakuan menggunakan 140 ekor ayam broiler. Perlakuan ransum yang diberikan, yaitu (1) canola konvensional, (2) Canola PRG event MS8 yang tidak disemprot, dan (3) Canola PRG event MS8 yang disemprot. Dengan demikian, jumlah total ayam broiler yang digunakan sebanyak 420 ekor. Formulasi ransum dilakukan oleh Akey Mills, North American Nutrition Companies (Lewisburg, Ohio, AS) untuk fase pertumbuhan, starter (0–7 hari), grower (8–21 hari), dan finisher (22–42 hari).
Setiap formula mengandung 10% canola. Ransum dan air minum diberikan secara ad libitum selama penelitian. Penimbangan dan pemeriksaan dilakukan setiap minggu. Pemeriksaan kondisi fisik umum, toksisitas, perilaku abnormal, dan kematian dilakukan setiap hari.
Parameter yang diamati, yaitu kesehatan ayam broiler, ketahanan hidup, pertambahan bobot badan, konsumsi pakan, konversi pakan, berat karkas dan bagian-bagiannya (dada, paha, kaki bawah, dan sayap). Penimbangan bobot badan dilakukan pada awal penelitian, diikuti dengan penimbangan berikutnya pada hari ke-7, ke-21, ke-35, dan ke-42.
11
Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan terhadap daya hidup, pertambahan bobot badan, konversi pakan, persentase karkas dan bagian- bagiannya, pada ayam broiler yang diberi ransum mengandung Canola PRG event MS8 dan canola non-PRG. Dengan kata lain, konsumsi Canola PRG event MS8 tidak berpengaruh terhadap nutrisi, kesehatan dan pertumbuhan ayam boiler secara umum.
IV. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil pengkajian tentang informasi genetik, kesepadanan substansial, dan toksisitas, disimpulkan hal-hal sebagai berikut:
1. Canola PRG event MS8 mengandung masing-masing satu kopi sisipan gen bar dan gen barnase, tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid pTHW107, stabil sampai lima generasi (BC3), dan diwariskan mengikuti hukum Mendel.
2. Canola PRG event MS8 sepadan secara substansial dengan canola non-PRG dan tidak bersifat toksik.
3. TTKH PRG Bidang Keamanan Pakan menilai bahwa Canola PRG event MS8 yang diajukan adalah aman untuk dikonsumsi sebagai bahan pakan.
4. Apabila di kemudian hari ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuai dengan data keamanan pakan yang diperoleh hingga saat ini, status keamanan pakan Canola PRG event MS8 perlu dikaji ulang.
5. Apabila setelah ditetapkan aman pakan kemudian Canola PRG event MS8 terbukti menimbulkan dampak negatif terhadap kesehatan ternak, pemohon wajib melakukan tindakan pengendalian dan penanggulangan, serta menarik Canola PRG event MS8 dari peredaran.
6. Canola PRG event MS8 tidak boleh dibudidayakan di Indonesia sebelum memperoleh sertifikat keamanan lingkungan.
DAFTAR PUSTAKA
Back, P. 2014. Confirmation of the absence of vector backbone sequences in Brassica napus MS8. Study report number: BBS13-0443. Bayer CropScience NV, BioScience, Ghent, Belgium.
Blanck, M. 2014. PAT/bar protein acute toxicity by oral gavage in mice. Study number: SA 13239. Test facility: Bayer S.A.S. Bayer Crop Science, 355 rue Dostoïevski, CS 90153, Valbonne, 06906, Sophia Antipolis Cedex, France.
Capt, A. 2017. PAT/bar protein amino acid sequence homology search with known alergens and known toxins. Bayer SAS, Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski, CS 90153, Valbonne, 06906 Sophia Antipolis Cedex, France.
De Block, M., De Brouwer, D., and Tenning, P. 1989. Transformation of Brassica napus and Brassica oleracea using Agrobacterium tumefaciens and the expression of the bar and neo genes in the transgenic plants.
Plant Physiology, 91(2):694–701.
12
De Both, G. and Huybrechts, I. 1998. Phenotypical characterization of the male sterile MS8 and fertility restorer RF3 oilseed rape line in the greenhouse.
Plant Genetic Systems NV, Jozef Plateaustraat 22, B-9000, Ghent, Belgium.
Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., and Goodman, H.M. 1982.
Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Journal of Molecular and Applied Genetics, 561–573.
Dhaese, P., De Greve, H., Gielen, J., Seurinck, J., van Montagu, M., and Schell, J. 1983. Identification of sequences involved in the polyadenylation of higher plant nuclear transcripts using Agrobacterium T-DNA genes as models. The EMBO Journal, 3:419-426.
Hartley, R.W. 1988. Barnase and barstar expression of its cloned inhibitor permits expression of a cloned ribonuclease. Journal of Molecular Biology, 202:913–915.
Japan MAFF. 2000. Notification on good laboratory practices standards for toxicology studies on agriculture, forestry and fisheries (MAFF) in Japan.
Ref. No. 11-Nousan-6283 (1 October 1999). Modified notification 12- Nousan-8628 (6 December 2000). Japan Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries.
Krebbers, E., Seurinck, J., Herdies, L., Cashmore, A., and Timko, M. 1988. Four genes in two diverged subfamilies encode the ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit polypeptides of Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology, 11:745–759.
Lautraite, S. 2012. Barnase protein: in vitro digestibility study in human simulated gastric fluid at pH 1.2. Study report number: SA 11361. Bayer SAS, Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski, CS 90153, Valbonne 06906, Sophia Antipolis Cedex, France.
Mertens, K. 2012. Comparison of the PAT/bar protein expressed in Brassica napus transformation event MS8 and the PAT/bar protein batch no.
NB010905P44P2. Company report. Study number: BBS12-006. Test facility: Bayer CropScience NV, Regulatory Science, Protein and Product Characterization, Technologiepark 38, B-9052, Ghent, Belgium.
Mertens, K. 2014. Detailed insert characterization of Brassica napus transformation event MS8 by southern blot analysis. Bayer CropScience NV, BioScience, Ghent, Belgium.
Moens, S. 2012. Barnase protein produced in E. coli. Study number: BBS11- 008. Bayer CropScience NV, Regulatory Science, Protein and Product Characterization, Technologiepark 38, B-9052 Ghent, Belgium.
Oberdörfer, R. 2003. Nutritional impact assessment report on glufosinate tolerant SeedLink oilseed rape event Ms8Rf3. Study report number: 02 B 004. Bayer CropScience GmbH, Residues, Operator and Consumer Safety, D-65926 Frankfurt, Germany.
Oberdörfer, R. 2008. Nutritional impact assessment report on glufosinate tolerant SeedLink oilseed rape event Ms8Rf3. Report number: 02 B 004, Bayer Crop Science AG, BioAnalytics, Frankfurt, Germany.
OECD. 1997. Good laboratory practice in the testing of chemicals. Organization for Economic Cooperation and Development, Paris, France.
13
OECD. 2001. Report of the OECD workshop on nutritional assessment of novel food and feeds.
OECD. 2011. Revised consensus document on compositional considerations for new varieties of low erucic acid rapeseed (Canola): key food and feed nutrients, antinutrients and toxicants.
Rascle, J.B. 2009. PAT/bar protein: in vitro digestibility study in human simulated gastric fluid. Study report number: SA 09045. Bayer SAS, Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski, CS 90153, Valbonne, 06906 Sophia Antipolis Cedex, France.
Rascle, J.B. 2016. PAT/bar protein: in vitro digestibility study in human simulated intestinal fluid. Study report number: SA 09046. Bayer SAS, Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906 Sophia Antipolis Cedex, France.
Rouquie, D. 2016. Barnase protein – in vitro digestibility study in human simulated intestinal fluid. Study report number: SA 11362. Bayer SAS Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906 Sophia Antipolis Cedex, France.
Stafford, J.M. 2005. Broiler chicken feeding study with Ms8/Rf3 rapeseed. Study number: 13798.4103. Bayer CropScience, Alfred Nobel Str. 50, 40789 Monheim, Germany.
Thomas, K., Aalbers, M., Bannon, G.A., Bartels, M., Dearman, R.J., Esdaile, D.J., Fu, T.J., Glatt, C.M., Hadfield, N., Hatzos, C., Hefle, S.L., Heylings, J.R., Goodman, R.E., Henry, B., Herouet, C., Holsapple, M., Ladics, G.S., Landry, T.D., MacIntosh, S.C., Rice, E.A., Privalle, L.S., Steiner, H.Y., Teshima, R., Van Ree, R., Woolhiser, M., and Zawodny, J. 2004. A multi- laboratory evaluation of a common in vitro pepsin digestion assay protocol used in assessing the safety of novel proteins. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 39:87–98.
Thompson, C.J., Moval, N.R., Tizard, R., Crameri, R., Davies, J.E., Lauwereys, M., and Botterman, J. 1987. Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. The EMBO Journal, 6(9):2519–2523.
Totis, M. 2014. Barnase protein. Acute toxicity study by oral gavage in mice.
Study number: SA 14025. Test facility: Bayer SAS, Bayer CropScience, 355, rue Dostoïevski, CS 90153, Valbonne, 06906 Sophia Antipolis Cedex, France.
US EPA. 1989. Good laboratory practice standards; final rule (40CFR, part 160). Federal Insecticide, Fungicide and Rodenticide Act (FIFRA). United States Environment Practice Agency, US Environmental Protection Agency, Washington, D.C., USA.
Verhaeghe, S. 2012. Description of vector pTHW107. Bayer CropScience NV, BioScience, Ghent, Belgium.
Weston, B. 1998. Evaluation of the stability of MS8, RF3, MS8RF3 in Brassica napus cv. Drakkar (SOSR) under different environmental conditions. Bayer CropScience NV, BioScience, Ghent, Belgium.
