BAB III
ISOLASI FRAGMEN cDNA DARI GEN PENYANDI AKTIN
DARI Melastoma malabathricum L.
Abstrak
Melastoma malabathricum L. adalah tumbuhan akumulator aluminium (Al) yang
dapat tumbuh baik pada tanah asam dengan kelarutan Al yang tinggi, sehingga dapat digunakan sebagai tanaman model untuk toleransi terhadap cekaman aluminium dan asam. Ekspresi gen-gen yang diinduksi oleh aluminium pada tanaman M. malabathricum memerlukan gen kontrol internal. Aktin adalah termasuk gen housekeeping yang biasa digunakan sebagai kontrol internal. Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengklon fragmen cDNA MmACT yang menyandi aktin dari M. malabathricum. RNA total telah berhasil diisolasi dan dijadikan sebagai cetakan untuk sintesis cDNA total melalui transkripsi balik. Empat fragment cDNA yang menyandi aktin dari M. malabathricum telah berhasil diisolasi dan disisipkan ke dalam plasmid pGEM-T Easy. Keempat fragmen ini selanjutnya dinamakan fragmen MmACT1, MmACT2, MmACT3, dan
MmACT4. Analisis urutan nukleotida menunjukkan bahwa fragmen MmACT1 dan MmACT2 berukuran 617 pb, dan fragmen MmACT3 dan MmACT4 berukuran 735 pb.
Antar keempat fragmen cDNA MmACT ini memiliki kemiripan nukleotida sekitar 78%-99%, dan kemiripan asam amino sekitar 98% - 100%. Analisis hubungan filogenetik berdasarkan urutan asam amino menunjukkan bahwa pada ketidakmiripan 1% MmACT1,
MmACT2, MmACT3 mengelompok dengan ACT5 Populus trichocarpha, sementara MmACT4 mengelompok dengan ACT9 P. trichocarpa dan ACT1 Gossypium hirsutum,
dan kedua kelompok ini terpisah dengan aktin dari tumbuhan monokotil. Keempat fragmen MmACT ini telah didaftarkan di bank data GenBank/EMBL/DDBJ dengan nomor aksesi AB500686, AB500687, AB500688, and AB500689.
Abstract
Melastoma malabathricum is accumulator plant of aluminum (Al) which can grow
well in acidic soil with high Al solubility, thereby it can be used as a model plant for tolerance to aluminum and acid stresses. Analysis of the expression of genes induced by Al in M. malabathricum requires internal control genes. Actin is belong to housekeeping
genes commonly used as an internal control. This study aimed to isolate and clone the
cDNA fragment of MmACT encoding for actin of M. malabathricum. Total RNA was isolated and used as template for cDNA synthesis by reverse transcription. Four cDNA fragments encoding for actin from M. malabathricum have been isolated and inserted into plasmid pGEM-T Easy. Four of cDNAs clones were isolated, and were called MmACT1,
MmACT2, MmACT3, and MmACT4. The size of MmACT1 and MmACT2 is 617 bp,
whereas MmACT3 and MmACT4 is 735 bp. Comparing among these four actin cDNA showed that they are about 78%-99% similarities based on nucleotide sequence and about 98%-100% similarities based on amino acid sequence. Analysis of phylogenetic relationship based on amino acid sequence showed that at 1% dissimilarity the
MmACT1, MmACT2, MmACT3 and the ACT5 Populus trichocarpha are clustered in one
group, while the MmACT4 is grouped with ACT9 P. trichocarpa and ACT1 Gossypium
hirsutum, and these two groups are separated with actin group of monocotyl plants. The
sequence of MmACT cDNAs was registered in GenBank / EMBL / DDBJ database with accession numbers AB500686, AB500687, AB500688, and AB500689.
Keywords: actin gene, cDNA, cloning, internal control gene, Melastoma
Pendahuluan
Aktin adalah protein yang sangat penting bagi sel eukariotik. Protein ini berperan penting dalam membentuk jaringan yang memberikan dukungan mekanik sel, menentukan bentuk sel, pergerakan sel, dan juga pembelahan sel (Vantard & Blanchoin 2002; Blessing et al. 2004). Aktin juga penting dalam morfogenesis sel pada tumbuhan, sebagai komponen dinding sel, terlibat dalam pertumbuhan rambut akar, sel trikom, tabung pollen, perpanjangan sel dan apikal meristem (Gilliland et al. 2003).
Gen aktin termasuk housekeeping gene (Tu et al. 2007; Chen et al. 2010), yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan. Sifat gen yang seperti ini menjadikan gen aktin digunakan sebagai kontrol internal pada analisis ekspresi, khususnya analisis ekspresi gen dengan metode qRT-PCR (quantitative real time polymerase chain
reaction) yang merupakan metode analisis ekspresi yang berkembang saat ini.
Gen aktin telah digunakan sebagai kontrol ekspresi gen pada kentang (Nicot et
al. 2005), kedelai (Jan et al. 2008), dan padi (Zhang et al. 2009). Aktin termasuk
salah satu kontrol internal yang paling stabil pada uji ekspresi gen di daun dan akar pada tanaman Cichorium intybus (Maroufi et al. 2010) dan akar tanaman
Eucommia ulmoides Oliver (Chen et al. 2010).
Melastoma malabathricum adalah tumbuhan yang dapat tumbuh dengan
baik pada tanah asam dengan konsentrasi aluminium (Al) yang tinggi (Watanabe
et al. 1998; Watanabe et al. 2002). Tumbuhan ini sangat toleran terhadap
cekaman asam dan Al, sehingga sangat baik digunakan sebagai tanaman model untuk toleransi terhadap asam dan Al. Untuk mempelajari ekspresi gen-gen pada M. malabathricum, informasi housekeeping gen-gene dari tumbuhan tersebut sangat dibutuhkan sebagai kontrol internal. Sampai saat ini informasi tersebut belum ada. Sementara itu, beberapa gen dari M. malabathricum yang diduga terlibat dalam toleransi tumbuhan tersebut terhadap cekaman asam dan Al seperti, multidrug resistance associated protein (Suharsono et al. 2008),
metallothionein type 2 (Mt2) (Suharsono et al. 2009), dan H+-ATPase membran plasma (Muzuni et al. 2010) belum dipelajari ekspresinya. Penelitian ini
Bahan dan Metode Penelitian Bahan Penelitian
Bahan tanaman yang digunakan adalah daun tumbuhan M. malabathricum yang tumbuh di lahan asam Jasinga Bogor Jawa Barat.
Fragmen cDNA yang menyandi aktin M. malabathricum diisolasi dengan PCR menggunakan degenerate primer untuk aktin tumbuhan (McDowell 1996) yaitu PlAc46S (5’-ATGGTNGGNATGGGNCARAA-3’) sebagai forward primer, dan PlAc245N (5’-GTDATNACYTGNCCRTCNGG-3’) dan PlAc284N (5’-ATRTCNACRTCRCAYITCATDAT-3’) sebagai reverse primer. Plasmid pGEM-T Easy (3015 pb) (Promega) digunakan sebagai vektor pengklonan. E. coli DH5α digunakan sebagai inang dari plasmid rekombinan.
Metode Penelitian
Isolasi RNA Total. Isolasi RNA mengikuti metode CTAB (Suharsono et
al. 2008) yang dimodifikasi. Daun sebanyak 0.1 g digerus dengan bantuan
nitrogen cair di dalam mortar sampai menjadi tepung. Hasil gerusan dimasukkan ke tabung 1.5 ml yang telah berisi 500 µl buffer ekstraksi (2 % CTAB, 2% PVP 40000, 100 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl dan 1% β-mercapto ethanol), kemudian divortex dan diinkubasikan pada suhu 65oC selama 10 menit. Sebelum ditambahkan 1 x volume kloroform:isoamil alkohol (24:1), suspensi didinginkan terlebih dahulu. Campuran kemudian divortex dan disentrifugasi pada kecepatan 18000 x g (TOMY MX-205) pada suhu 4oC selama 10 menit. Cairan bagian atas dipindahkan ke tabung 1.5 ml yang baru, ditambahkan 0.25 volume 10 M LiCl dan diinkubasi pada suhu -30oC selama 2.5 jam. Campuran disentrifugasi pada 18000 x g pada suhu 4oC selama 15 menit. Cairan dibuang, dan endapan RNA total disuspensikan dalam 500 µl TE (10 mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA) dan ditambahkan 1 x volume phenol pH 9, divortek dan disentrifugasi pada 18000 x g pada suhu 20oC selama 10 menit. Cairan bagian atas yang mengandung RNA total diambil, dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml dan diekstraksi kembali dengan 1 x volume fenol:kloroform:isoamilalkohol (25:24:1), divortek dan disentrifugasi pada kecepatan 18000 x g suhu 4oC selama 10 menit. Cairan bagian atas diambil, dipindahkan ke tabung 1.5 ml yang baru, kemudian ditambah dengan 0.25 volume 10 M LiCl dan diinkubasi pada suhu 30oC selama 2.5 jam. Cairan disentrifugasi pada kecepatan 18000 x g, suhu
4oC selama 15 menit. Endapan RNA total dibilas dengan 500 µl alkohol 70% dan disentrifugasi pada 18000 x g suhu 4oC selama 5 menit. Endapan RNA total dikeringkan dengan vaccum dryer, dan disuspensikan di dalam dH2O. Kualitas
dan kuantitas RNA ditentukan dengan spektrometer UV pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Keutuhan RNA total dianalisis dengan elektroforesis pada gel agarose 1% di dalam larutan penyangga TAE 1x. Visualisasi RNA total dilakukan di atas UV transiluminator GelDoc (Labquip) setelah diwarnai dengan EtBr (0.5 µg/ml) selama 15 menit dan dibilas dengan air.
Sintesis cDNA Total. Sintesis cDNA total dilakukan dengan mencampurkan 1 µg RNA total, 10 pmol oligo(dT), dan ditambah dH2O untuk
volume total reaksi 20 µl, kemudian inkubasi di 65oC selama 5 menit dan 4oC selama 5 menit. Selanjutnya, ke dalam campuran ditambahkan 1x RT buffer, 1mM dNTP, 40 U RNAse inhibitor, dan 100 U enzim ReverTraAce (Toyobo). Campuran diinkubasi 42oC selama 30 menit, 99oC 5 menit, dan 4oC 5 menit.
Isolasi Fragmen cDNA MmACT. Fragmen cDNA MmACT diisolasi dengan PCR menggunakan degenerate primer untuk aktin tumbuhan (McDowell 1996) yaitu PlAc46S sebagai forward primer, dan PlAc245N dan PlAc284N sebagai reverse primer. Komposisi PCR untuk amplifikasi cDNA MmACT adalah 1µl cDNA, 1x buffer taq, 4 mM dNTP mix, 10 pmol primer forward, 10 pmol primer reverse, 2U enzim Taq DNA polymerase (Toyobo), dan dH2O dengan
volume reaksi 20 µl. PCR dilakukan pada kondisi pra PCR pada suhu 94oC selama 5 menit, denaturasi pada 94oC selama 30 detik, penempelan primer pada 52oC selama 30 detik, dan pemanjangan pada 72oC selama 1 menit, dengan 30 siklus, dan pasca PCR pada 72oC selama 5 menit, diikuti dengan 15oC selama 10 menit.
Pengklonan Fragmen cDNA MmACT. Fragmen MmACT diligasikan dengan pGEM-T Easy (Promega Inc.) dengan mencampur 1 µl hasil PCR, 25 ng pGEM-T Easy, 1.5 U T4 DNA ligase, 2.5 µl 2x rapid buffer ligasi, dan dH2O dalam volume total 5 µl, dan diinkubasi 1 jam dalam suhu ruang. Hasil ligasi diintroduksikan ke dalam E.coli galur DH5α mengikuti prosedur Suharsono (2002).
Seleksi E.coli yang Mengandung Vektor Rekombinan. E. coli galur DH5α yang mengandung pGEMT-Easy rekombinan diseleksi menggunakan antibiotik ampisilin dan seleksi biru putih. Konfirmasi koloni putih mengandung
vektor rekombinan yang tersisipi fragmen MmACT dilakukan menggunakan PCR koloni dan memotong plasmid rekombinan dengan enzim EcoR1 (Promega Inc.).
Pengurutan DNA dan Analisis Urutan DNA. Pengurutan DNA dilakukan dengan menggunakan automatid DNA sequencer (ABI Prism 3700 squencer, Perkin Elmer, USA). Analisis kesejajaran cDNA MmACT dilakukan menggunakan program BLAST (Altschul et al. 1997). Analisis phylogenetik dilakukan dengan menggunakan program MEGA4 (Tamura et al. 2007).
Hasil dan Pembahasan Isolasi RNA Total
RNA total telah berhasil diisolasi dari daun muda tanaman M.malabathricum. Berdasarkan pengukuran spektrofotometer, rasio OD260/OD280 dari RNA total adalah 1.91 yang menunjukkan bahwa RNA total yang diisolasi mempunyai kemurnian yang tinggi. Elektroforesis RNA total untuk analisis keutuhannya menunjukkan adanya 2 pita RNA yang dominan (Gambar 4). Kedua pita ini adalah RNA ribosomal (rRNA) 28S dan 18S. Hasil ini menunjukkan bahwa RNA total yang diisolasi ini mempunyai keutuhan yang tinggi sehingga sangat baik digunakan sebagai cetakan (template) untuk sintesis cDNA total.
Gambar 4. RNA total dari daun M. malabathricum. Isolasi Fragmen cDNA MmACT Melalui PCR
PCR dengan cDNA total sebagai cetakan dan primer degenerate PlAc46S dan PlAc245N menghasilkan fragmen cDNA berukuran sekitar 600 pb dan dengan primer PlAc46S dan PlAc284N menghasilkan 750 pb (Gambar 5). Fragmen ini selanjutnya dinamakan fragmen MmACT (aktin M. malabathricum).
PCR dgn primer reverse PIAc245N menghasilkan fragmen cDNA yang lebih pendek (600 pb) dibanding primer reverse PIAc284N (750 pb), menunjukkan bahwa letak primer PIAc245 N lebih ke arah hulu (ujung 5’) dibanding primer PIAc284N. Hasil ini sesuai dengan posisi primer yang
digunakan pada struktur umum gen aktin Arabidopsis thaliana, yang menunjukkan bahwa primer PIAc254N berada lebih ke arah hulu dari primer PIAc284N (McDowell et al. 1996).
Gambar 5. Fragmen MmACT hasil PCR menggunakan primer PlAc46S dan PlAc245N (1), dan primer PlAc46S dan PlAc284N (2).
Pengklonan Fragmen MmACT ke dalam Plasmid pGEM-T Easy
Fragmen cDNA kandidat MmACT yang berukuran sekitar 600 pb dan 750 pb telah diligasikan dengan plasmid pGEM-T Easy di tengah gen lacZ dan hasil ligasi telah diintroduksikan ke dalam E.coli galur DH5α, dan diseleksi di media seleksi yang mengandung ampisilin, X-gal dan IPTG. E.coli yang tumbuh di media seleksi mengandung plasmid, koloni yang berwarna putih mengandung plasmid rekombinan, dan koloni yang berwarna biru mengandung plasmid non-rekombinan. Adanya sisipan fragmen MmACT di tengah lacZ menyebabkan gen
lacZ yang menyandi β-galactosidase (β-gal) yang berfungsi mengubah substrat X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna biru, tidak diekspresikan sehingga E.coli yang mengandung plasmid rekombinan menjadi berwarna putih.
Empat koloni putih, yaitu masing-masing dua koloni dari klon rekombinan yang tersisipi fragmen 600 pb dan dua koloni dari klon rekombinan yang tersisipi 750 pb dikonfirmasi dengan PCR . PCR terhadap koloni putih menghasilkan fragmen DNA yang berukuran 600 pb dan 750 pb (Gambar 6). Hasil ini menunjukkan bahwa koloni putih mengandung fragmen MmACT. Untuk memastikan bahwa fragmen MmACT tersisip di dalam plasmid pGEM-T Easy, DNA plasmid telah diisolasi dari koloni putih.
Pemotongan terhadap DNA plasmid rekombinan dengan enzim EcoR1 yang mengapit daerah penyisipan menghasilkan dua fragmen yaitu fragmen DNA berukuran 3000 pb dan 600 pb untuk klon rekombinan yang tersisipi fragmen cDNA 600 pb, dan untuk plasmid yang tersisipi fragmen cDNA berukuran 750 pb, menghasilkan fragmen DNA 3000 pb dan 750 pb. Fragmen DNA berukuran 3000 pb adalah vector pGM-T Easy, sementara pita yang berukuran 600 pb dan 750 pb merupakan fragmen MmACT (Gambar 7). Hasil ini menunjukkan bahwa keempat fragmen MmACT telah berhasil disisipkan ke dalam pGEM-T Easy.
Gambar 7. Verifikasi DNA plasmid rekombinan target 600 pb (1 & 2) dan 750 pb (3 & 4) dengan enzim restriksi EcoR1.
Analisis Fragmen MmACT
Pengurutan DNA terhadap ke empat fragmen MmACT menghasilkan urutan DNA (sequence) yang berbeda antara satu sisipan dengan sisipan lainnya. Hal ini terjadi karena primer yang digunakan untuk isolasi MmACT adalah primer degenerate yang memungkinkan menghasilkan fragmen DNA yang urutan nukleotidanya berbeda. Selain itu, aktin juga disandi oleh famili gen pada tanaman (Li et al. 2005; Feng et al.2006). Famili gen aktin pada A.
thaliana, terdiri dari 10 gen yang berbeda, delapan diantaranya adalah gen
fungsional dan dua gen adalah pseudogen (McDowell et al. 1996). 15 gen aktin (GhACT) pada kapas telah berhasil diisolasi (Li et al. 2005).
Keempat sisipan yang berbeda ini selanjutnya disebut MmACT1, MmACT2,
MmACT3, dan MmACT4. Pengurutan nukleotida fragmen MmACT1 dan MmACT2 menghasilkan 617 pb dan menyandikan 192 asam amino, sementara MmACT3 dan MmACT4 berukuran 735 pb dan menyandikan 231 asam amino.
nukleotida (Tabel 1), dan antar keempat MmACT memiliki kemiripan asam amino sekitar 98%-100%.
Tabel 1. Persentase (%) kemiripan nukleotida antar cDNA MmACT
cDNA MmACT1 MmACT2 MmACT3
MmACT1 100
MmACT2 99 100
MmACT3 89 89 100
MmACT4 78 78 80
Analisis kesejajaran lokal berdasarkan urutan nukleotida MmACT menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) menunjukkan bahwa fragmen MmACT1 dan MmACT2 memiliki kemiripan 83% dengan bagian aktin 7 Populus trichocarpa, MmACT3 memiliki kemiripan 83% dengan aktin 5 P. trichocarpa (XM_002316253), dan MmACT4 memiliki kemiripan 87% dengan aktin 9 P. trichocarpa (XM_002331844).
Adanya kesamaan yang tinggi (83%%-87%) fragmen MmACT dengan urutan nukleotida gen aktin tanaman lain yang telah lebih dahulu diisolasi (bank data) menunjukkan bahwa fragmen MmACT yang telah diisolasi dari
M.malabathricum adalah kandidat gen aktin. Keempat fragmen MmACT ini telah
didaftarkan di bank data GenBank/EMBL/DDBJ, masing-masing dengan nomor aksesi AB500686, AB500687, AB500688, dan AB500689 (Lampiran 1). Keempat fragmen gen aktin ini adalah gen aktin yang pertama diisolasi dari M.
malabathricum. Gen aktin ini sangat penting untuk analisis ekspresi gen dari
tanaman M. malabathricum, khususnya untuk analisis ekspresi gen secara kuantitatif. Analisis ekspresi gen secara kuantitatif dengan qRT-PCR memerlukan gen referensi sebagai kontrol internal. Gen aktin umum digunakan sebagai kontrol internal untuk analisis qRT-PCR pada kentang (Nicot et al. 2005), kedelai (Jan et al. 2008), padi (Zhang et al. 2009), dan C. intybus (Maroufi
et al. 2010). Analisis ekspresi semua gen dari tanaman M. malabathricum dapat
menggunakan keempat gen MmACT ini.
Analisis kesejajaran lokal berdasarkan urutan asam amino menunjukkan bahwa asam amino MmACT memiliki kemiripan yang tinggi dengan aktin P.
trichocarpa, bahkan MmACT4 memiliki kemiripan 100% dengan bagian gen aktin
tanaman lain, analisis filogenetik yang berdasarkan pada urutan asam amino telah dilakukan (Gambar 8).
Gambar 8. Hubungan filogenetik antara aktin Melastoma malabathricum (Mm),
Populus trichocarpa (Pt), Gossypium hirsutum (Gh), Arabidopsis thaliana (At), Oryza sativa (Os), Zea mays (Zm) dan Musa acuminate
AAA Group (Ma). Angka menunjukkan ketidakmiripan .
Analisis hubungan filogenetik menunjukkan bahwa pada ketidakmiripan sekitar 1% MmACT1, MmACT2, dan MmACT3 mengelompok dengan ACT5 P.
trichocarpa dan terpisah dengan MmACT4 yang mengelompok dengan ACT9 P. trichocarpha dan ACT1 Gossypium hirsutum. Gen aktin tumbuhan monokotil,
yaitu Oryza sativa, Zea mays, dan Musa acuminate AAA Group mengelompok dan terpisah dari tumbuhan dikotil. Sementara gen aktin A. thaliana mengelompok dengan yang lain pada ketidakmiripan lebih dari 2%. Hasil ini semakin menguatkan bahwa fragmen cDNA yang diisolasi dari M. malabathricum adalah fragmen gen aktin.
Berdasarkan struktur umum gen aktin pada A. thaliana (McDowell et al. 1996), maka MmACT yang diisolasi dalam penelitian ini terletak di daerah antara ekson 2 dan ekson 3 (Gambar 9). Posisi MmACT di antara ekson 2 dan ekson 3 ini sangat penting dalam mendesain primer aktin yang digunakan untuk verifikasi keberhasilan cDNA yang bebas dari kontaminasi DNA genom (Muzuni et al. 2010). Sepasang primer yang didesain berdasarkan dua daerah ekson yang berbeda yang mengapit daerah intron dapat digunakan untuk mengetahui keberhasilan sintesis dan kemurnian cDNA. Amplifikasi dengan cetakan cDNA
yang murni menghasilkan ukuran yang berbeda dibandingkan dengan menggunakan cetakan cDNA yang terkontaminasi oleh DNA genom. cDNA yang murni akan menghasilkan fragmen DNA aktin yang ukurannya lebih pendek dibandingkan dengan cDNA yang terkontaminasi DNA genom, karena hasil amplifikasi cDNA yang murni tidak mengandung intron.
Gambar 9. Posisi fragmen MmACT dalam struktur umum gen aktin A. thaliana (McDowell et al. 1996).
Simpulan
Empat fragmen cDNA aktin dari M. malabathricum yang berhasil diisolasi berukuran 617 pb (MmACT1, MmACT2) dan 735 pb (MmACT3, MmACT4). Keempat fragmen cDNA MmACT ini memiliki kemiripan nukleotida sekitar 78%-99% , dan kemiripan asam amino sekitar 98% - 100%. Analisis hubungan filogenetik berdasarkan urutan asam amino aktin menunjukkan bahwa keempat fragmen MmACT ini mengelompok dengan ACT P. tricocharpa. Fragmen
MmACT terletak diantara ekson 2 dan ekson 3 pada struktur umum gen aktin A.thaliana. Keempat fragmen MmACT ini telah didaftarkan di bank data
GenBank/EMBL/DDBJ dengan nomor aksesi AB500686, AB500687, AB500688, dan AB500689.
