UJI SITOTOKSISITAS ELLAGIC ACID DALAM EKSTRAK KULIT DAN BIJI DELIMA DENGAN TIGA VARIASI PELARUT PADA VERO CELL
LINE (PENGEMBANGAN TERAPI DIABETES MELITUS TIPE 2)
SKRIPSI
Untuk Memenuhi Persyaratan Gelar Sarjana Kedokteran
SURYANINGTYAS MARGI UTAMI G0014225
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET
ii
PENGESAHAN
Uji Sitotoksisitas Ellagic Acid dalam Ekstrak Kulit dan Biji Delima dengan Tiga Variasi Pelarut pada Vero Cell Line (Pengembangan Terapi
Diabetes Melitus Tipe 2)
Suryaningtyas Margi Utami, NIM: G0014225, Tahun: 2017
Telah diuji dan sudah disahkan dihadapan Dewan Penguji Skripsi
Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret
Pembimbing Utama
Nama : Dono Indarto, dr., M. Biotech., St., Ph.D., St.AIFM (………)
NIP : 196701041996011001
Pembimbing Pendamping
Nama : Ratih Dewi Yudhani, dr., M.Sc. (………) NIP : 198407072009122002
Penguji Utama
Nama : Yuliana Heri Suselo, dr., M.Sc. (………)
NIP : 198007182006042001
Surakarta, ...
Ketua Tim Skripsi Kepala Program Studi
iii
PERNYATAAN
Dengan ini menyatakan bahwa dalam skripsi ini tidak terdapat karya yang pernah
diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, dan
sepanjang pengetahuan saya tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah
ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam
naskah dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Surakarta, Desember 2017
Suryaningtyas Margi Utami
iv ABSTRAK
Suryaningtyas Margi Utami, G0014225, 2017. Uji Sitotoksisitas Ellagic Acid
dalam Ekstrak Kulit dan Biji Delima dengan Tiga Variasi Pelarut pada Vero Cell Line (Pengembangan Terapi Diabetes Melitus Tipe 2). Skripsi. Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret, Surakarta.
Latar Belakang: Sodium Glucose Co-transporter 2 (SGLT2) inhibitor
merupakan salah satu terapi alternatif untuk pasien DM tipe 2 yang tidak responsif terhadap terapi standar. SGLT2 adalah protein transporter yang berperan mereabsorbsi 90% glukosa di tubulus ginjal. Penelitian in silico melaporkan bahwa ellagic acid dari buah delima berpotensi sebagai SGLT2 inhibitor. Sebagai dasar pengembangan potensi SGLT2 inhibitor dari ellagic acid diperlukan penelitian tentang sitotoksisitas ellagic acid pada sel normal. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui tingkat sitotoksisitas ekstrak ellagic acid dengan tiga variasi pelarut terhadap sel Vero.
Metode Penelitian: Penelitian ini merupakan penelitian eksperimen laboratorium dengan post test only control group design. Kulit dan biji delima diekstrak menggunakan etanol, dietil eter, dan air (KEDA dan BEDA), metanol dan air (KMA dan BMA), serta etil asetat (KEa dan BEa). Kontrol positif menggunakan dapagliflozin. Uji LC-MS/MS digunakan untuk menentukan konsentrasi ellagic acid dalam masing-masing ekstrak dan uji 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid (MTT) digunakan untuk menentukan sitotoksisitas masing – masing ekstrak terhadap sel Vero dengan delapan dosis berbeda mulai dari 0,98 sampai 125 ppm. Analisis probit kemudian digunakan untuk menentukan IC50.
Hasil Penelitian: Konsentrasi ellagic acid dalam ekstrak kulit dan biji delima berkisar antara 1,34-1,68 ppm dengan konsentrasi tertinggi pada KMA dan terendah pada BMA. Ekstrak KEDA memiliki nilai IC50 terendah (527 µM) dan ekstrak BMA memiliki nilai IC50 tertinggi (231 mM). Ekstrak KMA dan KEa memiliki konsentrasi ellagic acid paling tinggi, tetapi hanya ekstrak KEa yang memiliki IC50 setara dengan konsentrasi ellagic acid di dalamnya. Ekstrak KEa dan BEa memiliki konsentrasi ellagic acid yang berbeda (1,55 dan 1,42 ppm), tetapi memiliki nilai IC50 yang hampir sama (648 dan 644 µM). KEDA dan BEDA memiliki konsentrasi ellagic acid yang sama (1,4 ppm) tetapi hanya KEDA yang memiliki IC50 mendekati IC50 dapagliflozin (406 µM).
Simpulan: Ellagic acid dalam ekstrak delima tidak toksik terhadap sel Vero. Pelarut etil asetat meningkatkan sitotoksisitas ellagic acid terhadap sel Vero. Pelarut terbaik untuk ekstraksi delima adalah kombinasi etanol, dietil eter, dan air.
v ABSTRACT
Suryaningtyas Margi Utami, G0014225, 2017. Cytotoxicity Test of Ellagic Acid in Pomegranate Peels and Seeds Extract with Three Variation of Solvents on Vero Cell Line (Type 2 Diabetes Mellitus Treatment Development). Mini Thesis. Faculty of Medicine, Sebelas Maret University, Surakarta.
Background: Sodium Glucose Co-transporter 2 (SGLT2) inhibitor is one of the alternative therapies for patients with type 2 DM who are unresponsive to the standard therapy. SGLT2 is a protein transporter that reabsorb 90% glucose in the renal tubules. In silico study found that ellagic acid in pomegranate is potential as SGLT2 inhibitor. As a basis for developing the potential of SGLT2 inhibitors from ellagic acid a study of the cytotoxicity of ellagic acid in normal cells is needed. The aim of this study to determine the cytotoxicity level of ellagic acid extract with three variations of solvent to Vero cells.
Methods: This study was an experimental laboratory with post-test only control group design. Pomegranate peels and seeds were extracted using ethanol, diethyl ether, and water (KEDA and BEDA), methanol and water (KMA and BMA), and ethyl acetate (KEa and BEa). The positive control using dapagliflozine. The LC-MS/MS test was used to determine the concentration of ellagic acid in each extract and the 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid (MTT) test was used to determine the cytotoxicity of each extract on Vero cells with eight different doses ranging from 0.98 to 125 ppm. The probit analysis was used to determine IC50.
Results : The concentration of ellagic acid in pomegranate peels and seeds extract ranged from 1.34 to 1.68 ppm with the highest concentration in KMA and the lowest in BMA. KEDA extract had the lowest IC50 value (527 μM) and BMA extract had the highest IC50 value (231 mM). KMA and KEa extracts had the highest concentrations of ellagic acid but only the IC50 of KEa extracts that equivalent to the concentrations of ellagic acid. KEa and BEa extracts had different concentrations of ellagic acid (1.55 and 1.42 ppm), but had similar IC50 values (648 and 644 μM). KEDA and BEDA had the same concentration of ellagic acid (1.4 ppm) but only KEDA had IC50 approaching the IC50 of dapagliflozine (406 μM).
Conclusion : Ellagic acid in pomegranate extract is not toxic to Vero cells. The ethyl acetate solvent increases the cytotoxicity of ellagic acid against Vero cells. The best solvent for pomegranate extraction is a combination of ethanol, diethyl ether, and water.
vi PRAKATA
Alhamdulillahirobbil’aalaamiin, puji syukur kehadirat Allah SWT, yang telah memberikan kenikmatan dan kemudahan kepada peneliti sehingga peneliti dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Uji Sitotoksisitas Ellagic Acid dalam Ekstrak Kulit dan Biji Delima dengan Tiga Variasi Pelarut pada Vero Cell Line (Pengembangan Terapi Diabetes Melitus Tipe 2)”. Peneliti menyadari bahwa skripsi ini tidak dapat terselesaikan tanpa adanya bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan penuh rasa hormat peneliti mengucapkan terima kasih yang dalam kepada:
1. Prof. Dr. Hartono, dr., M.Si., selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret
2. Sinu Andhi Jusup, dr., M.Kes., selaku Kepala Program Studi Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret.
3. Kusmadewi Eka Damayanti, dr., M.Gizi, selaku Ketua Tim Skripsi FK UNS beserta staf Bapak Nardi yang telah memberikan arahan dalam penyusunan skripsi ini.
4. Prof. Dr. Achmad Arman Subijanto, dr., M.S. selaku dosen pembimbing akademik.
5. Dono Indarto, dr., M. Biotech., St., Ph.D., St., AIFM. selaku pembimbing utama dan Ratih Dewi Yudhani, dr., M.Sc. selaku pembimbing pendamping yang telah menyediakan waktu untuk membimbing dan memberikan nasihat hingga terselesaikannya skripsi ini. 6. Yuliana Heri Suselo, dr., M.Sc. selaku penguji utama yang telah
memberikan kritik dan saran yang membangun dalam penyusunan skripsi ini.
7. Keluarga tercinta, Ayahanda Mukhtahudin, Ibunda Riyati, dan adik Sulaksono Aji Damarjati serta keluarga besar yang telah memberi banyak inspirasi, motivasi, semangat, dan doa hingga skripsi ini dapat terselesaikan.
8. Para staf Laboratorium Kimia Fakultas Farmasi UMS dan Laboratorium Parasitologi UGM yang telah memberikan arahan dan bantuan selama peneliti melakukan pengambilan data.
9. Sahabat sahabat peneliti terutama Bias yang telah menjadi teman berjuang selama penelitian, Mbak Adit, Mbak Mila, Mbak Ifah, Calvaria, kelompok A4, keluarga Kastrat de Geneeskunde, Penumbra, LKMI, dan Kesuma Fakultas Kedokteran UNS yang telah membantu serta memberi motivasi dan doa kepada peneliti.
10.Semua pihak yang secara langsung maupun tidak langsung membantu proses penyelesaian skripsi.
Penulis menyadari bahwa tulisan ini masih jauh dari kata sempurna, namun dengan sepenuh hati peneliti berharap skripsi ini dapat bemanfaat bagi pembaca.
Surakarta, Desember 2017
vii DAFTAR ISI
Halaman
JUDUL ... i
PENGESAHAN ... ii
PERNYATAAN ... iii
ABSTRAK ... iv
ABSTRACT ... v
PRAKATA ... vi
DAFTAR ISI ... vii
DAFTAR TABEL ... ix
DAFTAR GAMBAR ... x
DAFTAR SINGKATAN ... xi
DAFTAR LAMPIRAN ... xiii
BAB I. PENDAHULUAN ... 1
A. Latar Belakang Masalah ... 1
B. Rumusan Masalah ... 4
C. Tujuan Penelitian ... 4
D. Manfaat Penelitian ... 5
BAB II. LANDASAN TEORI ... 6
A. Tinjauan Pustaka ... 6
1. Diabetes Melitus Tipe 2... 6
2. Konsumsi Glukosa Sel Ginjal pada DM Tipe 2 ... 13
3. Ellagic Acid dalam Ekstrak Delima (Punica granatum) ... 15
4. Uji Kromatografi Ellagic Acid ... 19
5. Uji Sitotoksisitas ... 24
6. Sel Vero ... 26
7. Macam – macam Pelarut ... 27
B. Kerangka Pemikiran ... 29
C. Hipotesis Penelitian ... 30
viii
A. Jenis dan Desain Penelitian ... 31
B. Lokasi Penelitian ... 31
C. Sampel Penelitian ... 31
D. Teknik Sampling ... 31
E. Rancangan Penelitian ... 32
F. Identifikasi Variabel Penelitian ... 33
G. Definisi Operasional Variabel Penelitian ... 34
H. Alat dan Bahan ... 35
I. Dosis ... 36
J. Cara Kerja ... 36
K. Alur Penelitian ... 40
L. Teknik Analisis Data ... 41
BAB IV. HASIL PENELITIAN ... 42
A. Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry ... 42
B. Uji Sitotoksisitas Ellagic Acid dalam Ekstrak Kulit dan Biji Delima ... 49
BAB V. PEMBAHASAN ... 57
A. Analisis Hasil ... 58
B. Keterbatasan Penelitian ... 65
BAB VI. PENUTUP ... 66
A. Simpulan ... 66
B. Saran ... 66
DAFTAR PUSTAKA ... 67
ix
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1 SGLT2 inhibitor dalam tahap pengembangan atau telah
disetujui ... 12
Tabel 2.2 Perbedaan karakteristik SGLT1 dan SGLT2 ... 14 Tabel 4.1 Peak area dan konsentrasi senyawa ellagic acid di dalam
standar dan sampel ... 46
Tabel 4.2 Konversi dosis ekstrak kulit dan biji delima menjadi dosis
ellagic acid ... 50
x
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1 Transpor glukosa pada tubulus proksimal ginjal ... 14
Gambar 2.2 Struktur dua dimensi ellagic acid ... 15
Gambar 2.3 Skema pembentukan ellagic acid ... 16
Gambar 2.4 Buah delima (Punica granatum) ... 17
Gambar 2.5 Instrumentasi TLC ... 20
Gambar 2.6 Uji TLC ekstrak delima ... 21
Gambar 2.7 Instrumen HPLC ... 22
Gambar 2.8 Instrumentasi LC-MS ... 23
Gambar 2.9 Komponen tandem mass spectrometer ... 24
Gambar 2.10 Sel Vero pada fase kultur awal (24 jam) ... 26
Gambar 2.11 Kerangka pemikiran ... 29
Gambar 3.1 Skema rancangan penelitian ... 32
Gambar 3.2 Perhitungan sel menggunakan hemositometer ... 38
Gambar 3.3 Pemetaan well-plate... 39
Gambar 3.4 Alur penelitian ... 40
Gambar 4.1 Peak area ellagic acid pada senyawa standar ... 44
Gambar 4.2 Peak areaellagic acid dalam ekstrak kulit dan biji delima .. 45
Gambar 4.3 Grafik konsentrasi senyawa ellagic acid dalam ekstrak kulit dan biji delima ... 47
Gambar 4.4 Kromatogram ekstrak kulit dan biji delima ... 48
Gambar 4.5 Gambaran sel Vero secara mikroskopis ... 51
Gambar 4.6 Persentase proliferasi sel dosis 125 ppm ... 52
xi
DAFTAR SINGKATAN
AMPK : Adenosin Monophosphat Kinase
BEa : fraksi etil asetat biji delima
BEDA : ekstrak etanol, dietil eter, air biji delima
BMA : ekstrak metanol, air biji delima
DM : Diabetes Melitus
DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO : Dimethyl Sulfoxide
DPP-IV : Dipeptidyl Peptidase IV
EA : Ellagic Acid
FGF23 : Fibrobblast Growth Factor 23
GLP-1 : Glucagon Like Peptide 1
HPLC : High Performance Liquid Chromatography
KATP : ATP –sensitive potassium
KEa : fraksi etil asetat kulit delima
KEDA : ekstrak etanol, dietil eter, air kulit delima
KKn1 : Kelompok kontrol negatif 1
KKn2 : Kelompok kontrol negatif 2
KKp : Kelompok kontrol positif
KMA : ekstrak metanol, air kulit delima
LAF : Laminar Flow
LC – MS/MS : Liquid Chromatography – tandem Mass Spectrometry
xii Mr : massa molekul relatif
MTT : 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid
OAD : Obat Anti Diabetes
OCT-1 : Organic Cation Transporter-1
PBS : Phosphate BufferSaline
PPAR-γ : Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-γ
ppm : part per million
PTH : Parathormon
Riskesdas : Riset Kesehatan Dasar
RXR : Retinoid X Receptor
SGLT : Sodium Glucose Co-transporter
TLC : Thin Layer Chromatography
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Surat Ijin Penelitian ... 74
Lampiran 2. Peak Area Ellagic Acid ... 76
Lampiran 3. Kromatogram Ekstrak Kulit dan Biji Delima ... 79
Lampiran 4. Nilai Absorbansi Sel Vero pada Uji Sitotoksisitas ... 85
Lampiran 5. Grafik Persentase Proliferasi Sel Vero pada Uji Sitotoksisitas 87 Lampiran 6. Analisis Probit Ekstrak Kulit dan Biji Delima ... 90
