1
Kekhususan Anti Aging Medicine
Program Ilmu Biomedik Pasca Sarjana Fakultas Kedokteran Universitas Udayana
E-mail : haekal.anshari@gmail. com
Diterima : 29 September 2017 Disetujui : 16 Oktober 2017 Diterbitkan : 25 Oktober 2017
Pemberian Ekstrak Biji Kakao (
Theobroma cacao L
)
Menghambat Penurunan Kadar
Nitric Oxide
(No) dan
Jumlah Sel Endotel Korpus Kavernosa Tikus
(
Rattus norvegicus
) Jantan Wistar Diabetes
Haekal Yassier Anshari1
ABSTRAK
Kondisi hiperglikemia pada diabetes melitus merupakan salah satu faktor risiko disfungsi ereksi sebagai akibat dari disfungsi endotel melalui mekanisme autooksidasi glukosa, glikasi protein, dan aktivasi jalur metabolisme poliol yang selanjutnya mempercepat pembentukan senyawa oksigen reaktif. Kakao kaya kandungan antioksidan flavonoids yang dapat menyebabkan penurunan atau pencegahan terjadinya stres oksidatif dan disfungsi endotel sehingga menghambat penurunan sintesa, pelepasan, dan aktivitas Nitric Oxide (NO). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk membuktikan pemberian ekstrak biji kakao (Theobroma cacao L.) dapat menghambat penurunan Nitric Oxide (NO) dan jumlah sel endotel korpus kavernosa tikus wistar jantan diabetes. Penelitian eksperimental, completely randomized post test only control group design menggunakan 36 ekor tikus putih (Rattus norvegicus) jantan, dewasa (berumur 10 minggu)
sebagai sampel, yang terbagi menjadi 2 (dua) kelompok masing-masing berjumlah 18 ekor tikus, yaitu kelompok kontrol negatif P0 (aquabides) dan kelompok perlakuan P1 (ekstrak biji kakao dosis 280 mg/200 gram berat badan tikus). Hasil penelitian menunjukkan rerata kadar Nitric Oxide (NO) kelompok yang diberi aquades adalah 0,074±0,004 nmol/ nl dan kelompok yang diberi ekstrak biji kakao dosis 280 mg/200 gram berat badan tikus adalah 0,137±0,008 nmol/ nl (p<0,01). Rerata jumlah sel endotelkelompok yang diberi aquades adalah 39,00±1,847 sel dan kelompok yang diberi ekstrak biji kakao dosis 280 mg/200 gram berat badan tikus adalah 78,78±7,369 sel (p<0,01). Dapat disimpulkan bahwa pemberian ekstrak biji kakao (Theobroma cacao L.) dapat menghambat penurunan Nitric Oxide (NO) dan jumlah sel endotel korpus kavernosa tikus wistar jantan diabetes.
Kata kunci :nitric oxide (NO), sel endotel, ekstrak biji kakao
PENDAHULUAN
Diabetes melitus mempunyai efek langsung dan tidak langsung pada fungsi seksual, efek langsung berhubungan dengan perubahan vaskular yang terjadi pada diabetes. Diabetes melitus dengan kadar gula yang tidak terkontrol secara perlahan merusak sistem vaskular dan syaraf. Kerusakan vaskular akan mengurangi dan menghambat aliran darah sehingga suplai dan regulasi pada organ dan sel endotel jaringan erektil pada penis terganggu dan mengakibatkan disfungsi ereksi.
Insiden terjadinya disfungsi ereksi meningkat pada pria dengan diabetes melitus dibandingkan dengan populasi umum. Sekitar 30%-90% pria dengan diabetes melitus akan menderita disfungsi ereksi (Cho et al., 2005; Kapoor et al., 2007). Studi-studi sebelumnya melaporkan prevalensi berkisar antara 20-70% (Penson et al., 2004).
Relaksasi jaringan erektil pada korpus kavernosa memerlukan nitric oxide (NO) melalui mekanisme neurotransmiter nonadrenergic noncholinergic
(NANC) dan endotel. Patofisiologi disfungsi ereksi
pada diabetes melitus merupakan suatu bagian besar dari disfungsi atau ketidakmampuan sel endotel dalam menghasilkan komponen relaksasi pembuluh darah (NO) dan mempertahankan vasodilatasi dan homeostasis vaskular (Bivalacqua
et al., 2003).
Glukosa darah yang meningkat atau hiperglikemia pada diabetes melitus, baik secara akut ataupun kronis akan menyebabkan pembentukan senyawa oksigen reaktif (reactive oxygen species / ROS) yang merupakan awal kerusakan yang dikenal sebagai stres oksidatif melalui mekanisme autooksidasi glukosa, glikasi protein, dan aktivasi jalur metabolisme poliol-sorbitol (Vinna et al., 2000; Beckman et al., 2001; Beisswenger et al., 2001; Ahmed et al., 2005). Stres oksidatif merupakan pemicu disfungsi endotel yang ditandai dengan penurunan sintesis, pelepasan, dan aktivitas NO. Selain itu senyawa oksigen reaktif juga meningkatkan modifikasi lipid, DNA, dan protein pada berbagai jaringan sehingga menyebabkan kerusakan di berbagai jaringan termasuk sel endotel (Lavi et al., 2008).
Stres oksidatif yang disebabkan oleh radikal bebas berlebih dapat diredam dengan penggunaan antioksidan, baik antioksidan sintetis maupun alami. Antioksidan diperlukan tubuh untuk menetralisir radikal bebas. Fungsi utama antioksidan adalah untuk menghentikan atau memutus reaksi rantai radikal bebas yang terdapat dalam tubuh (Borak, 2009).
Kakao (Theobroma cacao L.) merupakan salah satu sumber antioksidan alami yang banyak dibudidayakan di Indonesia serta memiliki harga jual yang relatif terjangkau. Kakao kaya akan kandungan flavonoid baik bentuk monomer (epicatechin dan catechin), oligomer (procyanidins,
B1, B2, dan C1), dan polimer (procyanidins). Kandungan flavonoid pada kakao secara kualitatif tidak berbeda berdasarkan sumber dan proses fermentasinya namun secara kuantitatif berbeda disebabkan oleh perbedaan iklim tempat tumbuhnya tanaman kakao (Panduan Lengkap Budi Daya Kakao, 2004).
Kakao pada penelitian ini diperoleh dari perkebunan di daerah Tabanan, Bali yang diekstrak di Laboratorium Teknologi Pangan Universitas Udayana dan didapatkan kandungan flavonoid sebanyak 210,26 mg/100g QE. Kandungan flavonoid yang tinggi pada ekstrak biji kakao (Theobroma Cacao L.) menjadikan ekstrak biji kakao sebagai antioksidan yang potensial dalam menetralisir radikal bebas dalam tubuh dan mencegah terjadinya degradasi NO yang distimulasi oleh stress oksidatif. Penelitian pada tikus hiperkolesterolemia yang diberikan bubuk kakao menunjukkan penurunan kadar kolesterol total, LDL, Trigliserida dan malondialdehide (MDA) disertai peningkatan kadar antioksidan
glutathione (GSH) hepar (Lecumberri et al., 2007). Konsumsi makanan yang kaya kandungan flavonoid yang di ekstrak dari kakao dapat menurunkan resiko penyakit kardiovaskuler melalui aktivitas antioksidan dan telah terbukti memiliki manfaat untuk kesehatan jantung dan pembuluh darah, memperbaiki resistensi insulin, dan stroke (Mao et al., 2003; Kenny et al.,2004).
Manfaat biji kakao telah banyak diteliti, namun khasiatnya untuk mengatasi disfungsi ereksi yang diakibatkan diabetes melitus masih perlu dilakukan penelitian lebih lanjut, khususnya manfaat untuk menghambat penurunan kadar NO dan jumlah sel endotel korpus kavernosa pada tikus (Rattus norvegicus) jantan wistar.
METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan di Laboratory Animal Unit Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana. Pembuatan ekstrak biji kakao (Theobroma cacao L.) dan analisis fitokimia dilakukan di Laboratorium Teknologi Pangan Universitas Udayana, Denpasar. Pemeriksaan kadar NO dilakukan di Laboratorium Pangan dan Gizi Universitas Gajah Mada, Yogyakarta. Pemeriksaan jumlah sel endotel dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana, Denpasar. Penelitian ini adalah penelitian eksperimental murni dengan rancangan posttest only control group design
(Federer, 2008). Subjek penelitian adalah Tikus putih (Rattus norvegicus) jantan, galur Wistar,
berumur 10 minggu, berat badan 180-200 gram dan diabetes dengan kadar glukosa darah ≥ 135 mg/dL. Jumlah sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah 36 ekor (Federer, 2008) dan dibagi menjadi 2 kelompok yaitu kelompok kontrol (aquades), dan kelompok perlakuan tikus hiperglikemia yang diberi 280 mg/200 gram berat badan tikus ekstrak biji kakao (Theobroma cacao L.).
Semua tikus diadaptasikan selama 7 hari terlebih dahulu sebelum diberi perlakuan. Pada hari ke 8 semua kelompok tikus dipuasakan selama 8 jam, lalu diberi suntikan Nicotinamide 46 mg/ ekor, setelah 15 menit kemudian tikus diberikan suntikan Streptozotocin dosis 65 mg/kg BB secara intraperitoneal untuk membuat keadaan diabetes melitus (DM), dengan kadar glukosa darah sewaktu ≥ 135 mg/dL. Setelah 3 hari, tikus diambil darahnya melalui medial canthus sinus orbitalis untuk kemudian diukur kadar glukosa darah sebelum randomisasi. Semua tikus yang memenuhi kriteria inklusi secara random dibagi menjadi 2 kelompok untuk selanjutnya diberi perlakuan selama 30 sesuai dengan pembagian kelompok perlakuannya. Setelah 30 hari perlakuan, tikus dieuthanasia
menggunakan dietil eter dan diambil darah untuk pemeriksaan kadar NOx serta diambil jaringan korpus kavernosa untuk pemeriksaan histopatologi jumlah endotel. Data kemudian diolah dengan program SPSS Version 16 for windows.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil penelitian menunjukkan bahwa rerata kadar
Sebagai antioksidan, flavonoids bekerja dengan menangkap radikal bebas (free radical scavenger) (Baba et al., 2007; Hii et al., 2009 ; Sarda et al., 2011). Mekanisme penangkapan radikal bebas oleh flavonoid adalah dengan melepaskan atom hidrogen dari gugus hidroksilnya. Pemberian atom hidrogen ini meyebabkan radikal bebas menjadi stabil dan berhenti melakukan gerakan ekstrim, sehingga tidak merusak lipida, protein dan DNA (materi genetik) yang menjadi target kerusakan seluler (Baba et al., 2007).
Ekstrak ekstrak biji Kakao (Theobroma cacao L.) yang digunakan dalam penelitian ini mengandung flavonoid sebanyak 210,26 mg/100g QE (Laboratorium Teknologi Pangan, Universitas Udayana, 2016). Kandungan flavonoid yang tinggi pada ekstrak biji Kakao (Theobroma cacao L.)
menjadikan ekstrak biji kakao sebagai antioksidan yang potensial dalam menetralisir radikal bebas dalam tubuh dan mencegah terjadinya degradasi NO yang distimulasi oleh stres oksidatif.
Hasil penelitian yang dilaporkan oleh Fisher et al. (2003) menunjukan kadar NO pada subjek penelitian yang diberikan inhibitor eNOS
meningkat setelah 4 hari konsumsi kakao kaya flavonoids. Selain itu penelitian lain membuktikan bahwa dosis rendah pemberian kakao yaitu 39 gram/hari dapat menurunkan tekanan darah dan meningkatkan produksi NO (Taubert et al., 2007). Hasil penelitian ini juga didukung oleh hasil penelitian in vitro terdahulu yang mana stimulasi sel endotel dengan polifenol meningkatkan transkripsi eNOS dan selanjutnya sintesis NO (Leikert et al., 2002). Penelitan lain menunjukkan bahwa dosis fenol kumulatif dapat menentukan besarnya transkripsi eNOS (Taubert et al., 2007). Selain jalur tersebut, Steffen et al. (2007) menunjukkan bahwa
epicathechin dapat meningkatkan produksi NO pada sel endotel dengan cara menginhibisi aktivitas NADPH oxidase. Karim et al. (2000) meneliti bahwa kandungan procyanidins pada kakao dapat meningkatkan aktivitas eNOS pada aorta kelinci sehingga akan meningkatkan produksi nitric oxide
(NO).
Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Ida Ayu Dewi Wiryanthini pada tikus yang mengalami stres oksidatif selama 14 hari menunjukan kadar MDA plasma terendah dan kadar NO plasma tertinggi didapatkan pada dosis ekstrak biji kakao 280 mg/200 gram berat badan pada tikus. Penurunan kadar MDA dan peningkatan kadar NO ini sesuai dengan peningkatan dosis ekstrak biji kakao (Wiryanthini, 2011).
Selain itu hasil penelitian yang dilakukan oleh Loke
et al. (2008) menunjukkan bahwa intake Kakao pada laki-laki sehat akut dapat meningkatkan aktivasi eNOS sehingga meningkatkan kadar NO pada plasma dan urin. Hal ini didukung oleh penelitian yang dilakukan oleh Kenny et al. (2004) yang menunjukkan bahwa flavonoid yang diekstrak dari kakao dapat menurunkan resiko penyakit kardiovaskuler melalui aktivitas antioksidan. Namun penelitian lebih lanjut pada manusia tentang manfaat ekstrak biji kakao pada penderita diabetes masih sangat terbatas khususnya dalam mencegah penurunan kadar NO.
Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa kelompok perlakuan yang diberi ekstrak biji kakao dosis 280 mg/200 gram berat badan tikus (P1) selama 30 hari memiliki rerata jumlah sel endotel korpus kavernosa yang lebih tinggi sangat bermakna dibandingkan kelompok yang diberikan placebo. Pengumpulan data dilakukan dengan mengamati jumlah sel endotel korpus kavernosa yang diwarnai dengan pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE) (Gambar 2). Jumlah sel endotel dihitung menggunakan mikroskop merek Olympus Tabel 1.Kadar Nitric Oxide (NO) antar Kelompok Sesudah
Diberikan Perlakuan
Kelompok Subjek n Nitric Oxide Rerata Kadar
(nmol/nl) SB t p
Kelompok kontrol (P0) 18 0,074 0,004
-30,679 0,000
Kelompok perlakuan (P1) 18 0,137 0,008
n = jumlah sampel; SB = Simpangan Baku; t = distribusi t hitung; p = signifikansi
glikasi protein, dan aktivasi jalur metabolisme poliol-sorbitol yang mempercepat pembentukan senyawa oksigen reaktif (reactive oxygen species / ROS) (Ueno et al., 2002). Stres oksidatif merupakan pemicu aktivasi disfungsi endotel ditandai dengan penurunan kadar NO. Selain itu senyawa oksigen reaktif juga menyebabkan kerusakan langsung melalui peningkatan modifikasi lipid, DNA, dan protein pada berbagai jaringan termasuk sel endotel pembuluh darah (Ueno et al., 2002).
Flavonoid yang terkandung di dalam kakao memiliki aktivitas antioksidan yang cukup tinggi dan dapat mencegah kerusakan sel yang disebabkan oleh radikal bebas dengan menambah fungsi kerja antioksidan endogen melalui pembersihan langsung radikal bebas. Pembersihan langsung radikal bebas oleh flavonoid menghasilkan zat yang stabil. Flavonoid dapat langsung membersihkan superoksida dan membersihkan lebih cepat oksigen reaktif peroksinitrit (Baba et al., 2007; Hii et al., 2009 ; Sarda et al., 2011).
Epicatechin merupakan pembersih radikal paling kuat untuk menghambat aktivitas xantin oksidase. Selain itu gugus flavon dan catechin mempunyai aktivitas tertinggi untuk mencegah tubuh dari serangan radikal bebas. Efek antioksidan ini menyebabkan penurunan atau pencegahan terjadinya stres oksidatif dan disfungsi endotel sehingga tidak terjadi vasokonstriksi pembuluh darah (Baba et al., 2007; Titik et al., 2007; Hii et al., 2009 ; Sarda et al., 2011).
Hal ini didukung oleh penelitian oleh Coskun et al (2005) yang menunjukkan aktivitas antioksidan flavonoid pada ekstrak biji kakao dapat melindungi sel β pankreas dari kerusakan akibat radikal bebas yang diinduksi streptozotosin. Penelitian yang dilakukan oeh Sarma dan Das (2008) juga menyimpulkan bahwa selain melindungi sel β pankreas, dengan aktivitas antioksidan yang tinggi tersebut, ekstrak biji kakao (Theobroma cacao L.)
juga dapat mencegah kerusakan oksidatif pada endotel yang diakibatkan oleh diabetes melalui mekanisme pembersihan langsung superoksida dan oksigen reaktif peroksinitrit (Dragan et al., 2003; Titik et al., 2007).
Selain itu pada diabetes terjadi peningkatan kadar Interleukin-6 (IL-6) dan Vascular cell adhesion
protein 1 (VCAM-1) yang dapat menyebabkan disfungsi endotel (Funatsu et al., 2003). Namun uji in vitro menunjukkan bahwa pemberian ekstrak biji kakao (Theobroma cacao L.) terbukti dapat meningkatkan viabilitas sel endotel dengan
Gambar 2. Pemeriksaan Histopatologi Menunjukkan Sel Endotel (panah hitam) pada (a) kelompok kontrol (P0) yang diberikan plasebo dan (b) kelompok perlakuan (P1) yang diberikan ekstrak biji kakao (Theobroma cacao L.)
Tabel 2.Jumlah Sel Endotel Korpus Kavernosa antar Kelompok Sesudah Diberikan Perlakuan
Kelompok Subjek n Rerata Jumlah Sel
Endotel SB t p
Kelompok kontrol (P0) 18 39,00 1,847
-22,215 0,000
Kelompok perlakuan (P1) 18 78,78 7,369
n = jumlah sampel; SB = Simpangan Baku; t = distribusi t hitung; p = signifikansi
Gambar 3.Grafik Perbandingan Jumlah Endotel Korpus Kavernosa antar Kelompok
pada pembesaran 400 kali. Jumlah sel endotel kelompok yang diberi aquades adalah 39,00±1,847 sel dan kelompok yang diberi ekstrak biji kakao dosis 280 mg/200 gram berat badan tikus adalah 78,78±7,369 sel (p<0,01) (Tabel 2; Gambar 3).
K. C., Choi, D. S. 2005. Elevated Homocysteine as a Risk Factor for the Development of Diabetes in Women with a Previous History of Gestational Diabetes Mellitus: a 4-year Prospective Study.
Diabetes Care; 28: 2750–2755.
Coskun, O., Kanter, M., Korkmaz, A., Oter, S. 2005. Quercetin, a flavonoid antioxidant, prevents and protects streptozotocin-induced oxidative stress and beta-cell damage in rat pancreas. Pharmacol Res; 51(2):117-23.
Dragan, A., Dusanka, D., Drago, B. 2003, Structure radical scavenging activity relationships of flvonoids, Croat. Chem. Acta
Droge, W. 2002. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev;82: 47-95. Federer, W. 2008. Statistic and Society: Data Collection and Interpretation. Edisi ke-2. New York: Marcel Dekker.
Fisher, N. D., Hughes, M., Gerhard-Herman, M., Hollenberg, N. K., 2003. Flavanol-rich cocoa induces nitric-oxide-dependent vasodilation in healthy humans. J Hypertens; 21(12): 2281-2286 Funatsu, H., Yamashita, H., Ikeda, T., Mimura, T., Eguchi, S., Hori, S. 2003. Vitreous levels of interleukin-6 and vascular endothelial growth factor are related to diabetic macular edema.
Ophthalmology; 110(9):1690-6.
Hii, C. L., Law, C. L., Suzannah, S., Misnawi, Cloke, M. 2009. Polyphenol in cocoa. Asian journal of food and agro-industry. 2(04).
Karim, M., McCormick, K., Kappagoda, CT. 2000. Effects of cocoa extracts on endothelium-dependent relaxation, J. Nutr; 130: 2105S–2108S.
Kenny, T. P., Keen, C. L., Jones, P., Kung, H. J., Schmitz, H. H., Gershwin, M. E. 2004. Pentameric procyanidins isolated from Theobroma cacao seeds selectively downregulate ErbB2 in human aortic endothelial cells. Exp Biol Med (Maywood); 229(3):255-63.
Lavi, S., Yang, E.H., Prasad, A., Mathew, V., Barsness, G.W.,Rihal, C.S., Lerman, L.O., dan Lerman, A. 2008. Oxidative Stress and Endothelial Function: The Interaction Between Coronary Endothelial Dysfunction, Local Oxidative Stress, and Endogenous Nitric Oxide in Humans.
Hypertension; 51: 127-133.
Leikert, J. F., Rathel, T. R., Wohlfart, P., Cheynier, V., Vollmar, A. M., Dirsch, V. M., 2002. Red wine polyphenols enhance endothelial nitric oxide synthase expression and subsequent nitric oxide mencegah peningkatan IL- 6 dan VCAM-1 (Rahayu
et al., 2016). Selain itu biji kakao juga dapat menjaga viabilitas endotel dengan meningkatkan kadar NO dan menurunkan endothelin-1 (Barokah et al., 2016).
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian ini, dapat disimpulkan bahwa pemberian esktrak biji kakao (Theobroma cacao L.) dapat menghambat penurunan kadar
Nitric Oxide (NO) dan jumlah sel endotel korpus kavernosa pada tikus (Rattus norvegicus) jantan wistar yang diabetes.
DAFTAR PUSTAKA
Ahmed, N., Babaei-Jadidi, R., Howell, S. K., Thornalley, P. J., Beisswenger, P. J. 2005. Glycated and oxidized protein degradation products are indicators of fasting and postprandial hyperglycemia in diabetes. Diabetes Care. 28 (10): 2465-71 Baba, S., Osakabe, N., Kato, Y., Natsume, M., Yasuda, A., Kido, T., Fukuda, K., Muto, Y., Kondo, K. 2007. Continuous Intake of Polyphenolic Compounds Containing Cocoa Powder Reduces LDL Oxidative susceptibility and Has Beneficial Effects on Plasma HDL-Cholesterol Concentrations in Humans. Am J Clin Nutr. 85: 709-17.
Barokah, L., Baktiyani, S. C. W., Kalsum. U. 2015. Protective effect of Theobroma cacao on nitric oxide and endothelin-1 level in endothelial cells induced by plasma from preeclamptic patients: In silico and in vitro studies. European Journal of Integrative Medicine. 1876-3820
Beckman, J. A., Goldfine, A. B., Gordon, M. B., Creager, M. A., 2001. Ascorbate restores endothelium-dependent vasodilatation impaired by acute hyperglycemia in humans. Circulation.
103:1618-23.
Beisswenger, P. J., Szwergold, B. S., Yeo, K. T. 2001. Glycated proteins in diabetes. Clin Lab Med. 21(1): 53-78.
Bivalacqua, T. J., Usta, M. F., Champion, H. C., Kadowitz, P. J., Hellstom, W. J. G. 2003. Endothelial Dysfunction in Erectile Dysfunction: Role of the Endothelium in Erectile Physiology and Disease.
Journal of Andrology. 24: 19-37.
Borak, C. 2009. Oxidation Reaction Theory of Aging. Available from : www://http.Oxidation_
Reaction_Theory_of_Aging.htm. Accessed : 09-04-
2011.
Steffen, Y., Schewe, T., Sies, H. 2007. Epicatechin elevates nitric oxide in endothelial cells via inhibition of NADPH oxidase. Biochem Biophys Res Commun; 359(3): 828-33.
Taubert, D., Roesen, R., Lehmann, C., Jung, N., Schomig, E. 2007. Effects of low habitual cocoa intake on blood pressure and bioactive nitric oxide: a randomized controlled trial. JAMA;298: 49–60 Titik, S., Suwidjiyo, P., Ratna, A. 2007, Antioxidant-free radical scavenging of flavonoid from the leaves of stelechocarpus burahol, majalah Farmasi Indonesia.
Ueno, Y., Kizaki, M., Nakagiri, R., Kamiya, T., Sumi, H., Osawa, T. 2002. Dietary gluthatione protects rats from diabetic nephropathy and neuropathy. J Nutr; 132:897-900.
Vinna. J., Gimeno, A., Sastre, J., Desco, C., Asesnsi, M., Pallardo, F. V., Cuesta, A., Ferrero, J. A., Terada, L. S., Repine, J. E. 2000. Mechanism of Free Radical Production in Exhaustive Exercise in Humans and Rats; Role of Xanthine Oxidase and Protection by Allopurionol. Informa Healthcare; 49 (6): 539-544. Wiryanthini, I. A. D. 2011. Pemberian Ekstrak Biki Kakao (Theobroma cacao L.) Menurunkan Kadar Malondialdehide dan Meningkatkan Kadar NOx Darah Tikus Putih (Rattus norvegicus) Yang Diinduksi Stress Psikososial. Universitas Udayana. release from endothelial cells. Circulation;
106(13):1614-1617
Loke, W. M., Hodgson, J. M., Proudfoot, J. M., McKinley, A. J., Puddey, I. B., Croft, K. D. 2008. Pure dietary flavonoids quercetin and ()-epicatechin augment nitric oxide products and reduce endothelin-1 acutely in healthy men. Am. J. Clin. Nutr;88: 1018–1025.
Mao, T. K., Van De Water, J., Keen, C. L., Schitz, H. H., Gershwin, M. E. 2003. Cocoa Flavanols and Procyanidins Promote Transforming Growth Factor-β1 Homeostasis in Peripheral Blood Mononuclear Cells. Exp Biol Med; 228: 93- 9.
Panduan Lengkap Budi Daya Kakao. 2004. Kiat Mengatasi Masalah Praktis: Panduan Lengkap Budi Daya Kakao. Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia. Jakarta: Agromedia Pustaka.
Penson, D. F., Wessells, H. 2004. Erectile Dysfunction in Diabetic Patiens. Diabetes Spectrum; 17: 225-230. Sarda, M. U., Llorach, R., Menagas, M., Khan, N., Ribalta, M. R., Roura, E. 2011. Effect of cocoa powder in the prevention of cardiovascular disease: biological, consumption and inflammatory biomarkers. Transworld research network.
