Metoda pengujian susu segar
Standar Nasional Indonesia
SNI 01-2782-1998/Rev.1992
Berdasarkan usulan dari Departemen Pertanian standar ini disetujui oleh Badan Standardisasi Nasional
menjadi Standar Nasional Indonesia dengan nomor : SNI 01-2782-1998/Rev.1992
Penerbitan standar ini dilakukan setelah memperhatikan semua data dan masukan dari berbagai pihak. Kritik dan saran untuk penyempurnaan
standar ini, dapat disampaikan kepada :
BADAN STANDARDISASI NASIONAL - BSN
Gedung Manggala WanabaktiBlok IV Lantai 4 Jl. Jend. Gatot Subroto, Senayan, Jakarta 10270 Telepon 62 - 21 - 5747043, 5747044 Fax. 62 - 21 - 5747045
PUSAT STANDARDISASI DAN AKREDITASI BADAN AGRIBISNIS, DEPARTEMEN PERTANIAN
Kantor Pusat Departemen Pertanian Gedung D Jalan Harsono RM No. 3 Ragunan - Pasar Minggu
Jakarta 12550 Tlp./Fax. (021) 7815880
Metoda pengujian susu segar
Pendahuluan
Standar ini merupakan Revisi SNI 01-2782-1992 mengenai Cara Uji Susu
Segar untuk menyempurnakan standar serta metoda pengujian susu segar
sehingga diperoleh adanya keseragaman dalam keakuratan, ketelitian, spesifisitas dan sensitifitas hasil serta keberulangan yang stabil.
Standar ini disusun sebagai hasil pembahasan Rapat-rapat Teknis, Prakonsensus dan terakhir dirumuskan dalam Rapat Konsensus Nasional. Hadir dalam rapat-rapat tersebut wakil-wakil dari lembaga penelitian, perguruan tinggi, produsen, konsumen dan instansi yang terkait lainnya.
Sebagai acuan Cara Uji Susu Segar ini diambil dari: 1) AOAC, Official Methods of Analysis (1995)
2) Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Food
(1992)
3) Bundesegestzblatt, Jahrgang (1995)
Metoda pengujian susu segar
Uji penetapan berat jenis
1 Ruang lingkup
Standar ini menetapkan metoda untuk mengukur berat jenis (B.J) susu segar.
2 Prinsip
Benda padat yang dicelupkan ke dalam suatu cairan akan mendapatkan tekanan ke atas seberat volume cairan yang dipindahkan. Berat jenis diukur di antara suhu 20 - 300C kemudian disesuaikan pada :
BJ. 27,5 0 76 cm Hg. 27,50 3 Pereaksi Tidak diperlukan. 4 Peralatan
a) Satu Laktodensimeter yang ditera pada suhu 27,5oC (harus ditera ulang tiap tahun)
b) Dua buah gelas piala berukuran 500 ml untuk menghomogenkan susu c) Satu tabung besar
2 dari 82 5 Prosedur pengujian
5.1 Pengukuran B.J dilakukan minimum 3 (tiga) jam setelah pemerahan. 5.2 Homogenkan susu dengan sempurna (dituangkan dari gelas piala satu ke gelas piala lainnya), kemudian dengan hati-hati dituangkan kedalam tabung tanpa menimbulkan buih.
5.3 Dengan hati-hati laktodensimeter dicelupkan ke dalam susu dalam tabung tadi, biarkan timbul dan tunggu sampai diam.
5.4 Baca skala yang ditunjukkan dan angka yang terbaca menunjukkan angka ke-2 dan ke-3 dibelakang koma, sedangkan desimal ke-4 dikira-kira. Contoh :
Bila skala yang terbaca adalah 28, maka angka yang didapat adalah 1,0280 5.5 Lakukan pengukuran sebanyak tiga kali berturut-turut, masing-masing dilakukan setelah membenamkan kembali laktodensimeter.
5.6 Temperatur susu diukur dengan ketelitian 0,5oC dan tandon Hg dari termometer haruslah berada di dalam susu pada waktu pengukuran dilakukan.
6 Hasil Uji
6.1 Untuk laktodensimeter yang ditera pada 27,50C, bila temperatur susu adalah 29oC sedangkan skala rata-rata adalah 28 maka yang dicatat adalah :
BJ. 29
0
C
76 cm Hg = 1,0280 27,50 C
6.2 Untuk setiap kelebihan atau kekurangan suhu sebesar 10C dilakukan penyesuaian berat jenis sebesar koefisien muai susu setiap derajat Celcius yakni 0,0002 BJ. 27,5 0 76 cm Hg = 27,50 = 1,0280 + (29 - 27,5) x 0,0002 = 1,0280 + 0,0003 = 1,0283.
6.3. Bila laktodensimeter yang digunakan ditera pada 150C, maka perhitungan harus disesuaikan sebagai berikut:
BJ. 27,5 0 76 cm Hg = 1,0280 150 BJ. 27,5 0 76 cm Hg = 1,0280 + (29-27,5) x 0,0002 150 = 1,0280 + 0,003 = 1,0283 BJ. 27,5 0 76 cm Hg = 1,0283 x BJ air pada 15 0 C 27,50 BJ air pada27,50C BJ. 27,5 0 76 cm Hg = 1,0280 + (29-27,5) x 0,0002 150 = 1,0280 + 0,003 = 1,0283
4 dari 82 Tabel 1
Berat jenis dan volume air pada beberapa suhu Suhu (0C) BJ Volume Suhu (0C) BJ Volume 4 1,000000 1,0000 25 0,997069 1,0029 15 0,999126 1,0009 26 0,996808 1,0032 17,5 0,998710 1,0013 27 0,996538 1,0035 20 0,998229 1,0018 27,5 0,9966538 1,0036 21 0,998017 1,0020 28 0,996258 1,0038 22 0,997795 1,0022 29 0,995969 1,0040 23 0,997663 1,0024 30 0,995672 1,0043 24 0,997321 1,0027
Pengukuran kadar lemak dengan metoda Gerber
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda pemeriksaan rutin penentuan kadar lemak susu penuh, susu yang sebagian lemaknya diambil, susu yang tidak dihomogenisasi dan susu yang dihomogenisasi menggunakan metoda Gerber.
2 Definisi
Metoda Gerber adalah prosedur empiris untuk menentukan nilai kadar lemak susu dalam satuan gram lemak per 100 ml susu.
3 Prinsip
Asam sulfat pekat merombak dan melarutkan kasein dan protein lainnya, sehingga menyebabkan hilangnya bentuk dispersi lemak. Pemisahan lemak dipercepat dengan penambahan amil alkohol yang akan mencairkan lemak dengan panas yang ditimbulkannya. Dengan sentrifugasi akan menyebabkan lemak terkumpul dibagian skala dari butirometer.
4 Pereaksi
a) Asam sulfat (H2SO4) 90 - 91% (BJ pada 200 C = 1.818 + 0,003 g/ml) Penampakan: tidak berwarna atau lebih terang dari warna kuning pucat serta tidak mengandung endapan.
b) Amil alkohol (BJ pada 200 C = 0,811 + 0,002 g/ml) Penampakan: jernih dan tidak berwarna.
5 Peralatan
a) Butirometer yang dilengkapi sumbatnya. b) Penangas air (650C + 20C).
6 dari 82
d) Pipet otomat 1 ml + 0,05 ml (amil alkohol).
e) Pipet otomat 10 ml (asam sulfat pekat), dapat juga digunakan pipet biasa yang dilengkapi bola karet (untuk penghisap) pada ujungnya.
f) Pipet khusus 10,75 ml.
6 Prosedur
6.1 Metoda ini berlaku untuk 3 jenis susu: susu penuh, susu yang sebagian lemaknya diambil dan susu yang tidak dihomogenisasi.
6.1.1 Masukkan 10 ml asam sulfat pekat ke dalam butirometer.
6.1.2 Tambahkan 10,75 ml contoh susu dan 1 ml amil alkohol. Urutan dari pemasukan bahan ke dalam butirometer harus runtut seperti cara di atas.
6.1.3 Butirometer disumbat sampai rapat, kemudian dikocok sehingga bagian-bagian di dalamnya tercampur rata.
6.1.4 Setelah terbentuk warna ungu tua sampai kecoklatan (terbentuk karamel), masukkan butirometer ke dalam sentrifus dan disentrifusi pada 1200 rpm selama 5 menit.
6.1.5 Kemudian masukkan butirometer ke dalam penangas air dengan suhu 650 C selama 5 menit.
6.1.6 Setelah itu, bacalah skala yang tertera pada butirometer. Skala tersebut menunjukkan kadar lemak.
6.2 Untuk susu yang dihomogenisasi
6.2.1 Cara pengerjaan contoh sama dengan di atas, hanya setelah pembacaan skala, butirometer kembali disentrifusi dan dimasukkan ke dalam penangas air (650 C), lalu skala dibaca kembali.
6.2.2 Ulangi cara tersebut sebanyak dua sampai tiga kali.
6.2.3 Apabila perbedaan hasil pembacaan skala antara 2 dan 3, antara 3 dan 4 lebih dari 0.05%, maka pengukuran ini dianggap salah.
7 Hasil Uji
Kadar lemak adalah angka yang ditunjukkan oleh skala dinyatakan dalam persen.
Perhitungan kadar bahan kering tanpa lemak (BKTL)
Metoda 01 : Dengan menggunakan Rumus Fleischmann
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda untuk perhitungan kadar bahan kering tanpa lemak dalam susu segar dengan cepat.
2 Prinsip
Untuk tujuan ini diperlukan persentase kadar lemak dan berat jenis susu.
BK = 1,311 x L + 2,738 100 (BJ - 1) BJ
dimana : BK = Kadar Bahan Kering L = Kadar Lemak susu BJ = Berat Jenis susu
Penetapan Kadar Bahan Kering Tanpa Lemak berdasarkan rumus :
BKTL = BK - L
dimana : BKTL = Bahan Kering Tanpa Lemak
BK = Kadar Bahan Kering
8 dari 82 3 Prosedur
3.1 Setelah angka kadar lemak, dan BJ didapatkan, maka angka-angka tersebut dimasukkan ke dalam rumus, kemudian dihitung secara biasa, atau 3.2 Masukkan angka-angka tersebut kedalam tabel-tabel.
4 Hasil Uji
Tabel 2
Penyesuaian untuk lemak
Lemak 1,31 L Lemak 1,31 L Lemak 1,31 L Lemak 1,31 L Lemak 1,31 L
1,0 1,31 2,5 3,28 4,0 5,24 5,4 7,07 6,8 8,91 1,1 1,44 2,6 3,41 4,1 5,37 5,5 7,21 6,9 9,04 1,2 1,57 2,7 3,54 4,2 5,50 5,6 7,34 7,0 9,17 1,3 1,70 2,8 3,67 4,3 5,64 5,7 7,47 7,1 9,30 1,4 1,83 2,9 3,80 4,4 5,76 5,8 7,60 7,2 9,43 1,5 1,97 3,0 3,93 4,5 5,90 5,9 7,73 7,3 9,56 1,6 2,10 3,1 4,06 4,6 6,03 6,0 7,86 7,4 9,69 1,7 2,23 3,2 4,19 4,7 6,16 6,1 8,00 7,5 9,83 1,8 2,36 3,3 4,32 4,8 6,29 6,2 8,12 7,6 9,96 1,9 2,49 3,4 4,45 4,9 6,42 6,3 8,25 7,7 10,09 2,0 2,62 3,5 4,59 5,0 6,55 6,4 8,38 7,8 10,22 2,1 2,75 3,6 4,72 5,1 6,68 6,5 8,51 7,9 10,35 2,2 2,88 3,7 4,85 5,2 6,81 6,6 8,65 8,0 10,48 2,3 3,01 3,8 4,98 5,3 6,94 6,7 8,78
10 dari 82 Tabel 3 Penyesuaian untuk BJ BJ 2,738 100(B-1) B BJ 2,738 100(B-1) B BJ 2,738 100(B-1) B 1,0220 5,89 1,0270 7,20 1,0320 8,49 1,0225 6,02 1,0275 7,33 1,0325 8,62 1,0230 6,16 1,0280 7,46 1,0330 8,75 1,0235 6,29 1,0285 7,59 1,0335 8,87 1,0240 6,42 1,0290 7,72 1,0340 9,00 1,0245 6,55 1,0295 7,85 1,0345 9,13 1,0250 6,68 1,0300 7,97 1,0350 9,26 1,0255 6,81 1,0305 8,10 1,0355 9,39 1,0260 6,94 1,0310 8,23 1,0360 9,51 1,0265 7,07 1,0315 8,36
Metode 02: Dengan menggunakan metoda pengeringan
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda untuk perhitungan kadar BKTL pada susu segar, krim, buttermilk dan susu kental tawar (tanpa gula).
2 Prinsip
Sejumlah contoh susu dikeringkan pada suhu yang tetap (konstan) sampai berat kering yang konstan tercapai. Berat setelah pengeringan adalah berat bahan kering.
3 Peralatan
a) Timbangan analitik, skala 0:1 mg. b) Oven
c) Eksikator
d) Cawan dari bahan anti karat (alumunium, nikel, gelas) yang dilengkapi dengan tutup, mempunyai dasar rata, tinggi sekitar 3 cm dengan garis tengah 6-8 cm.
e) Penangas air
4 Prosedur
4.1 Keringkan cawan dan tutupnya dalam oven dengan suhu 102 + 20C selama 30 menit.
4.2 Setelah itu masukkan cawan beserta tutupnya ke dalam eksikator sampai suhunya sama dengan suhu kamar, kemudian timbang (G1).
4.3 Masukkan 3 ml contoh susu ke dalam cawan dan timbang kembali beserta tutupnya (G2).
4.4 Letakkan cawan di atas penangas air (mendidih) selama 30 menit. Untuk mencegah terbentuknya kulit, teteskan etanol sebanyak 5 - 10 tetes. 4.5 Masukkan kembali cawan ke dalam oven (suhu 102 + 20C) selama 1 jam dan letakkan tutup cawan disamping cawan.
4.6 Tutup kembali cawan dan masukkan ke dalam eksikator dan biarkan hingga suhu cawan sama dengan suhu kamar.
4.7 Timbang cawan beserta tutupnya (G3.1.).
4.8 Masukkan kembali cawan ke dalam oven selama 1 jam dan setelah itu masukkan kembali ke dalam eksikator hingga suhunya sama dengan suhu kamar, kemudian timbang lagi (G3.2.).
4.9 Lakukan prosedur tersebut sampai tercapai berat konstan (G3.1=G3.2) atau selisih hasil pengukuran sebelum dan sesudahnya tidak melebihi 0,5 mg.
12 dari 82 Kadar Bahan Kering (%) = 100 x (G3 - G1)
G2 - G1
Dimana : G1 = berat cawan dan penutupnya
G2 = berat cawan, penutupnya dan contoh G3 = berat cawan, penutupnya dan bahan kering
Beda pengukuran ulang susu = 0,05 %.
6 Hasil Uji
Uji protein menurut Kjeldahl
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda penentuan kadar protein susu segar dengan metoda Kjeldahl.
2 Prinsip
Pemanasan contoh susu dalam asam sulfat pekat mengakibatkan terjadinya destruksi protein menjadi unsur-unsurnya. Untuk mempercepat proses destruksi tersebut sering ditambahkan kalium sulfat bersamaan dengan cupri sulfat (sebagai indikator) sehingga gugusan N (organik) akan berubah menjadi gugusan amonium sulfat.
Melalui penambahan natrium hidroksida dan pemanasan terjadilah proses destilasi dimana amonium sulfat akan dipecah menjadi amonia. Selanjutnya amonium yang dibebaskan akan ditangkap oleh asam borat, sedangkan sisa asam borat yang tidak bereaksi dengan amonia akan dititrasi dengan asam klorida o,1 N. Selisih jumlah titrasi contoh dengan blanko merupakan jumlah ekivalen nitrogen.
3 Pereaksi
a) Asam sulfat pekat (H2SO4) (BJ 1,84 pada 20o C) b) Cupri sulfat (CuSO4.5H2O)
c) Kalium sulfat (K2SO4)
d) Larutan natrium hidroksida (NaOH) 33% (500 gram NaOH dilarutkan dalam 1.000 ml aquades)
e) Larutan asam klorida (HCl) 0,1 N
f) Asam borat 4% (40 gram asam borat dilarutkan dalam 1.000 ml aquades)
g) Larutan indikator Kjeldahl (2 gram methyl red dan 1 gram methylen
14 dari 82 4 Peralatan a) Labu Kjeldahl 500 ml b) Timbangan skala 0,1 mg c) Labu erlenmeyer 500 ml d) Buret skala 0,05 ml
e) Alat pelengkap lain untuk analisa protein (pemanas, alat destilasi, sumbat penghubung)
f) Pendingin Liebig
g) Gelas ukur 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml h) Butir gelas, batu didih
5 Prosedur
5.1 Masukkan ke dalam labu Kjeldahl 5 gram contoh susu, batu didih, 10 gram K2SO4 dan 0,25 gram CuSO4. Kemudian tambahkan 20 ml H2SO4 dan
campur dengan baik.
5.2. Panaskan hingga tidak ada uap, teruskan pemanasan sampai mendidih dan sekali-sekali labu diputar.
5.3. Setelah cairan dalam labu terlihat jernih dan tak berwarna, teruskan pemanasan selama 90 menit, kemudian didinginkan.
5.4 Setelah mencapai suhu kamar, tambahkan 150 ml aquades serta beberapa butir batu gelas, campur dan biarkan hingga dingin.
5.5. Di dalam erlenmeyer terpisah masukkan 50 ml asam borat, 4 tetes indikator dan campurkan. Kemudian tempatkan di bawah pendingin (Leibig) sehingga ujung pipa mengenai asam borat.
5.6. Melalui dinding, masukkan secara perlahan-lahan dan hati-hati 80 ml larutan NaOH ke dalam labu Kjeldahl sehingga NaOH tidak tercampur dengan isi dari labu tersebut.
5.7. Pasanglah labu Kjeldahl dengan segera pada alat destilasi. Panaskan labu Kjeldahl, mula-mula secara perlahan-lahan sampai dua lapisan cairan tercampur, kemudian panaskan dengan cepat sampai mendidih. Atur panasnya sampai terjadi proses destilasi (waktu pemanasan minimum 20 menit).
5.8. Menjelang berakhirnya proses destilasi letakkan erlenmeyer pada tempat yang lebih rendah sehingga ujung pipa tidak menyentuh larutan asam borat lagi.
5.9. Dinginkan hasil destilasi (destilat) dan jaga agar larutan asam borat tidak turut panas.
5.10. Titrasi destilat dengan HCl 0,1 N.
5.11. Lakukan prosedur diatas terhadap 5 ml aquades sebagai blanko/kontrol.
6 Cara Penghitungan
Kandungan protein (%) = 1,4 x N x (A - B) x 6,38 C
Keterangan : N = Normal HCl
A = Jumlah HCl yang digunakan untuk titrasi contoh (ml)
B = Jumlah HCl yang digunakan untuk titrasi blanko (ml)
1,4 = berat dari N (secara analitik), ekivalen untuk 1 ml HCl 0,1 N
C = Berat contoh susu yang digunakan (gram)
7 Hasil Uji
16 dari 82 Uji warna, bau, rasa dan kekentalan
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda uji warna, bau, rasa dan kekentalan pada susu segar secara organoleptik.
2 Definisi
Uji organoleptik adalah pengujian warna, bau, rasa dan kekentalan suatu produk makanan dengan menggunakan indera manusia sebagai alat utama untuk mengetahui kelainan-kelainan pada produk makanan tersebut.
3 Prinsip
Susu dapat berubah warna, bau, rasa, dan kekentalannya oleh sebab-sebab di bawah ini:
3.1 Warna
3.1.1 Menjadi kebiruan bila ditambah dengan air ataupun dikurangi lemaknya.
3.1.2 Menjadi kemerahan bila mengandung darah dari sapi yang menderita mastitis.
3.2 Bau
Lemak susu amat mudah menyerap bau dari sekitarnya. 3.3 Rasa
3.3.1 Susu menjadi terasa pahit oleh kuman pembentuk pepton. 3.3.2 Susu memiliki rasa lobak disebabkan oleh kuman coli.
3.3.3 Susu memiliki rasa sabun disebabkan oleh Bacillus lactis saponacei. 3.3.4 Susu memiliki rasa tengik disebabkan oleh kuman-kuman asam mentega.
3.4 Kekentalan
Susu akan berlendir bila terkontaminasi oleh kuman-kuman kokki yang berasal dari air, sisa makanan atau dari alat-alat susu.
4 Pereaksi Tidak diperlukan.
5 Peralatan a) Tabung reaksi
b) Kertas putih sebagai latar belakang.
6 Prosedur 6.1. Uji warna
6.1.1 Masukkan kurang lebih 5 ml susu ke dalam tabung reaksi. 6.1.2 Dengan latar belakang putih amati kelainan pada warna susu. 6.2. Uji bau
6.2.1 Masukkan ke dalam tabung reaksi kurang lebih 5 ml susu, atau dapat pula dipakai susu dalam tabung yang telah diuji warnanya pada butir 5.1. di atas, kemudian dicium baunya.
6.2.2 Dipanaskan sampai mendidih, kemudian dicium baunya lagi.
6.3. Uji rasa
6.3.1 Untuk pertimbangan kesehatan pemeriksa, maka susu harus dididihkan dahulu sebelum dilakukan uji rasa.
6.3.2 Tuangkan sejumlah susu di telapak tangan kemudian dicicipi dan rasakan adanya perubahan rasa susu.
18 dari 82
6.4.1 Masukkan kurang lebih 5 ml susu ke dalam tabung reaksi. 6.4.2 Miringkan tabung, kemudian tegakkan kembali.
6.4.3 Pada saat menegakkan tabung kembali perhatikan bagian susu yang membasahi dinding terhadap kecepatan turunnya susu serta adanya butiran, lendir dan sebagainya.
7 Hasil uji
Susu dianggap baik bila tidak dijumpai perubahan atau penyimpangan dalam warna, bau, rasa maupun kekentalannya.
Uji titrasi keasaman Soxhlet Henkel
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda pengukuran derajat asam susu dengan cara titrasi.
2 Definisi
Yang dimaksud dengan derajat asam Soxhlet Henkel adalah jumlah ml NaOH 0,25 N yang diperlukan untuk menetralisasi asam yang berada dalam 100 ml susu dengan phenolphthalein sebagai indikator.
3 Pereaksi
a) Larutan 0,25 N NaOH.
b) Larutan Phenolphthalein 2% (2 g phenolphtalein dilarutkan dalam 100 ml ethanol 96%).
c). Larutan Cobalt Sulfat (5 gram CoSO4. 7H2O, dilarutkan dalam aquadest sampai 100 ml) sebagai zat warna standar (kontrol) untuk memastikan bahwa reaksi pengikatan asam dalam susu oleh NaOH telah mencapai titik netral.
4 Peralatan
a) Buret dengan skala 0,05 - 0,1 ml. b) Dua buah labu erlenmeyer 50 ml. c) Pipet berskala.
5 Prosedur
5.1. Ke dalam labu erlenmeyer masing-masing diisikan 50 ml susu. 5.2. Tambahkan 2 ml phenolphthalein.
20 dari 82
5.3. Salah satu dari labu erlenmeyer tersebut dititrasi dengan larutan 0,25 N NaOH hingga terbentuk warna merah muda yang tetap bila dikocok.
5.4. Sebagai warna pembanding, susu di dalam labu erlenmeyer kedua ditambah dengan 1 ml larutan cobalt sulfat (CoSO4. 7H2O). Warna standar ini hanya dapat dipakai maksimum 3 jam. Setelah 3 jam harus diganti yang baru.
6 Cara Penghitungan
Derajat Soxhlet (0SH) adalah jumlah 0,25 N NaOH yang digunakan dikalikan nilai dua. Misalnya dalam titrasi diperlukan 3,5 cc 0,25 N NaOH untuk menetralkan 50 ml susu, maka derajat keasamannya adalah:
3,5 x 100 ml = 70 SH 50ml
7 Hasil Uji
Uji alkohol
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda untuk memeriksa dengan cepat derajat keasaman susu segar.
2 Prinsip
Kestabilan sifat koloidal protein-protein susu tergantung pada selubung air yang menyelimutinya. Hal ini terutama pada kasein. Bila susu dicampur dengan alkohol yang mempunyai sifat dehidrasi maka protein tersebut akan terkoagulasi sehingga susu tersebut akan pecah. Semakin tinggi derajat keasaman susu yang diperiksa, maka akan semakin rendah jumlah alkohol dengan kepekatan tertentu yang diperlukan untuk memecahkan susu dengan volume yang sama. Percobaan mulai positif pada derajat asam 8 - 90 SH.
3 Pereaksi
Alkohol 70% (tambahkan 74 ml alkohol 96% dengan 26 ml aquadest)
4 Peralatan a) Tabung reaksi. b) Gelas ukur 10 ml.
5 Prosedur
5.1. Masukkan 5 ml susu ke dalam tabung reaksi. 5.2. Tambahkan alkohol 70% dalam jumlah yang sama.
5.3. Amati terhadap adanya gumpalan dan atau pemisahan bagian-bagian protein susu.
22 dari 82 6 Hasil uji
Uji katalase
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda untuk menentukan adanya sel-sel radang (leukosit), kuman dan adanya bahan organis seperti santan di dalam susu segar.
2 Prinsip
Di dalam susu terdapat enzim katalase yang dibentuk oleh sel-sel leukosit, kuman-kuman, reruntuhan sel ambing dan zat organis yang membebaskan oksigen (O2) dari larutan peroksidanya (H2O2).
3 Pereaksi
Larutan H2O2 0,5 % (larutkan 1 ml H202 35% dengan 69 ml aquadest).
4 Peralatan
a) Pipet steril 5 , 10 ml b) Tabung katalase
c) Inkubator dengan suhu 37oC.
5 Prosedur
5.1. Isi tabung katalase steril dengan 10 ml susu.
5.2. Tambahkan 5 ml larutan H2O2 0,5 % ke dalamnya.
5.3. Aduk dengan cara membalik-balikkan tabung, kemudian tempatkan campuran susu tersebut di bagian tabung yang vertikal dan berskala dan jaga agar jangan ada gelembung udara di puncaknya.
5.4. Sumbat tabung dengan kapas, kemudian masukkan ke dalam inkubator 370 C.
24 dari 82
5.5. Tetapkan volume gas O2 yang terkumpul di dalam puncak tabung setelah 3 jam.
6 Hasil Uji
Angka katalase adalah jumlah cc gas oksigen yang terkumpul di dalam puncak tabung. Angka katalase maksimum adalah 3,0.
Penentuan titik beku
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda penentuan titik beku susu segar untuk mengetahui kemungkinan adanya pemalsuan susu dengan air.
2 Prinsip
Kenaikan atau penurunan titik beku susu adalah selisih antara titik beku air dengan standar titik beku susu. Kenaikan titik beku menyatakan adanya indikasi penambahan air, sedangkan penurunan titik beku menyatakan adanya indikasi penambahan susu bubuk atau tepung.
4 Pereaksi
4.1. Cairan pendingin dengan suhu kira-kira -40 C yang terbuat dari 2 gr NaCl yang telah ditumbuk halus di dalam 200 cc air dan kemudian dimasukkan kedalamnya 400 gr es.
5 Peralatan
a) Kryoskop yang dilengkapi thermometer Beckmann dengan pembagian skala hingga 0,0010 C.
b) Tabung gelas yang kedua ujungnya terbuka. c) Tabung reaksi yang berdiameter 2,5 cm. d) Tabung reaksi berdiameter 5 cm.
e) Bak cairan pendingin.
f) Batang pengaduk terbuat dari logam yang tidak bereaksi terhadap susu, berdiameter antara 1 - 1,5 mm.
26 dari 82 6 Prosedur
6.1 Dalam tabung reaksi berdiameter 2,5 cm dimasukkan 30 cc aquadestilata yang telah dimasak dan didinginkan, kemudian tabung disumbat dengan gabus yang mempunyai dua lubang.
6.2 Pada lubang pertama masukkan/tanamkan kristal es dan aduk cairan dengan alat pengaduk, sedang lubang yang satu lagi dimasukkan thermometer Beckmann dengan ujungnya tepat berada di pertengahan cairan.
6.3 Masukkan tabung ini ke dalam cairan pendingin berisolasi dengan suhu -2 sampai -60 C sambil diaduk terus secara teratur dan perlahan-lahan sampai suhu dalam tabung mencapai 10 C dibawah titik beku air.
6.4 Masukkan tabung ke dalam tabung reaksi berdiameter 5 cm sehingga mantel pendingin dan tabung pembeku tidak bersentuhan.
6.5 Kemudian masukkan keduanya ke dalam cairan pendingin kembali dimana cairan pendingin harus kira-kira 4 cm lebih tinggi dari permukaan air di dalam tabung pertama.
6.6 Ke dalam cairan pendingin dimasukkan kristal es murni kecil dan diaduk secara merata. Penaikan tiang raksa harus diperhatikan hingga kira-kira selama 1 menit tiang raksa tidak bergerak lagi.
6.7 Bila hal ini sudah tercapai, ketuk thermometer perlahan-lahan dan tingginya tiang air raksa diperiksa dengan loupe hingga 0,0010 C. Bila es yang terbentuk sudah meleleh lagi, ulangi lagi cara kerja ini dengan catatan perbedaannya tidak boleh lebih dari 0,0050 C.
6.8 Dengan cara yang serupa dilakukan perlakuan terhadap 30 cc susu. Akan tetapi cairan hanya didinginkan sampai 1,50 C dibawah titik beku air dan yang dimasukkan/ditanamkan adalah sepotong kecil susu beku. Perbedaan antara dua kali penentuan tidak boleh lebih dari 0,0050 C.
6.9 Bila menggunakan thermometer yang tidak ditera lebih dahulu, hendaknya dengan thermometer ini kita menentukan titik beku larutan 10 gr NaCl murni dalam 1 liter air, dimana titik ini harus -0,6030 C.
7 Hasil uji
Hasil uji titik beku susu dinyatakan dalam derajat Celcius (0 C). Titik beku susu yang memenuhi syarat mutu adalah -0,5200 C sampai -0,5600 C.
Pengukuran angka refraksi metoda Ackermann
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda untuk mengetahui kemungkinan adanya penyimpangan terhadap susu.
2 Prinsip
Angka refraksi ditetapkan dari serum kalsium khlorida (CaCl2) susu yang disesuaikan pada suhu 27,5o C, dan dihitung angka refraksinya.
3 Pereaksi
Serum CaCl2 20% (20 gr CaCl2 dilarutkan dalam 100 ml aquades) dengan BJ = 1,1375.
Bila larutan CaCl2 diencerkan dengan aquades (1:10) pada suhu 17,50C, maka
refraktometer harus menunjukkan angka 26.
4 Peralatan
a) Refraktometer celup (Zeiss) b) Penangas air
c) Corong d) Kertas saring
e) Labu Erlenmeyer 50 ml/100 ml dilengkapi sumbat karet dengan pipa gelas yang panjangnya + 22 cm.
5 Prosedur
5.1. Masukkan 30 ml contoh susu ke dalam labu Erlenmeyer. 5.2. Tambahkan 0,25 ml larutan CaCl2 20%.
28 dari 82
5.3. Labu Erlenmeyer disumbat dengan sumbat yang dilengkapi gelas untuk menghindari kehilangan cairan akibat penguapan.
5.4. Letakkan labu Erlenmeyer dalam penangas air (mendidih) selama 15 menit.
5.5. Dinginkan sampai terlihat ada pemisahan serum dengan endapan. 5.6. Pisahkan serum dengan endapan melalui saringan.
5.7. Serum dituang ke dalam cuvet sampai batas yang tertera.
5.8. Celupkan refraktometer ke dalam cuvet dan baca skala yang tertera. Setelah itu ukur suhu serum tersebut dengan termometer.
5.9. Koreksi suhu serum yang didapat ke 27,50 C yang merupakan rata-rata suhu kamar di Indonesia (Tabel 4).
6 Cara pengukuran
Cara pengukuran angka refraksi adalah seperti contoh di bawah ini:
6.1 Jika pada suhu 30o C didapatkan angka 18,0, maka kalau dikembalikan pada 27,5o C akan menjadi : 18,0 + 0,75 = 18,75.
6.2 Jika pada suhu 20o C didapatkan angka 45,0, maka kalau dikembalikan pada 27,5o C akan menjadi : 45,0 - 2,55 = 42,45.
Tabel 4
Tabel Koreksi Untuk Pembacaan Refraktometer yang dicelupkan pada suhu antara 20o C - 30o C terhadap suhu koreksi 27,5o C
12,55 17,6 22,5 27,35 32,2 37,1 41,9 46,7 300 290 280 +0,75 +0,40 +0,10 +0,75 +0,40 +0,10 +0,75 +0,45 +0,15 +0,75 +0,45 +0,15 +0,75 +0,45 +0,15 +0,75 +0,45 +0,15 +0,80 +0,45 +0,15 +0,80 +0,45 +0,15 27,50 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 270 260 250 240 230 220 210 200 -0,15 -0,45 -0,70 -0,90 -1,20 -1,45 -1,65 -1,90 -0,15 -0,45 -0,70 -0,95 -1,20 -1,45 -1,65 -1,90 -0,15 -0,45 -0,70 -0,95 -1,20 -1,45 -1,70 -1,95 -0,15 -0,45 -0,75 -1,05 -1,30 -1,55 -1,80 -2,05 -0,15 -0,45 -0,75 -1,05 -1,35 -1,65 -1,90 -2,15 -0,15 -0,45 -0,75 -1,05 -1,35 -1,65 -1,95 -2,25 -0,15 -0,50 -0,85 -1,15 -1,45 -1,80 -2,05 -2,35 -0,15 -0,50 -0,55 -1,20 -1,55 -1,0 -2,25 -2,55
30 dari 82 Uji reduktase
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda untuk menentukan adanya kuman-kuman di dalam susu segar dalam waktu cepat dengan menggunakan pereaksi warna indikator.
2 Prinsip
Di dalam susu segar terdapat enzim reduktase yang dibentuk oleh kuman yang mereduksi zat warna indikator menjadi larutan yang tidak berwarna.
Metoda 01 : Uji reduksi biru metilen (Methylen blue reduction test)
3 Pereaksi
Larutan biru metilen yang dibuat dengan cara :
a) Masukkan 10 mg methylen blue DAB7 ke dalam labu erlenmeyer steril. b) Tambahkan 100 ml aquades steril.
c) Campur dengan baik dan simpan dalam temperatur 4-80 C dan terlindung dari cahaya. Larutan ini dapat bertahan selama 4 minggu.
4 Peralatan
a) Pipet steril 1, 25 ml.
b) Tabung reduktase dengan batas melingkar pada 21 ml dilengkapi penyumbat karet atau parafin untuk mencegah terjadinya reaksi oksidasi. c) Labu erlenmeyer.
d) Inkubator atau penangas air dengan suhu 37o C yang terlindung dari cahaya.
5 Prosedur
5.1. Masukkan ke dalam tabung reduktase steril 1 ml larutan biru metilen. 5.2. Tambahkan contoh susu sampai batas lingkar.
5.3. Tutup tabung tersebut dengan sumbat, lalu campurkan biru metilen dengan contoh susu dengan cara membolak-balikkan tabung (+ 3 kali) sampai warna biru tersebar merata.
5.4. Masukkan tabung ke dalam penangas air (37 + 10 C) selama 4 - 4,5 jam. Letakkan penangas air di tempat yang terlindung dari cahaya. Bila menggunakan inkubator, masukkan dulu tabung dalam penangas air (37 + 10 C) selama 5 menit untuk menghangatkan baru dimasukkan ke dalam inkubator.
6 Cara Membaca Hasil
Pembacaan hasil dapat dimulai minimal setelah 2/3 dari warna sudah berubah menjadi putih. Sebaiknya reaksi ditunggu sampai seluruh warna biru hilang.
7 Hasil Uji
Hasil uji dinyatakan dalam satuan waktu, dimana waktu reduksi (angka reduktase) menunjukkan waktu yang dibutuhkan sejak saat memasukkan tabung kedalam inkubator/penangas air bersuhu 37o C sampai seluruh warna biru hilang.
32 dari 82 Tabel 5
Kualitas susu segar berdasarkan lamanya waktu reduksi
Waktu Reduksi Kualitas Susu
0 menit - 20 menit 20 menit - 2 jam
2 jam - 4,5 jam 4,5 jam - 5,5 jam
lebih dari 6 jam
Jelek Kelas III
Kelas II Kelas I
Susu dicurigai telah mengalami perlakuan (dididihkan, ditambah atau mengandung
Metoda 02 : Uji resazurin
1 Pereaksi
Larutan resazurin yang dibuat dengan cara :
1.1 Masukkan 1 ampul resazurin (Fa. Retorte) ke dalam labu erlenmeyer steril.
1.2 Larutkan dengan air panas, kemudian dengan aquades bersuhu 600 C. Setiap ampul dapat dilarutkan dengan 250, 500 atau 1000 ml.
1.3 Larutan disimpan dalam tempat yang terlindung dari cahaya. Pembuatan larutan jangan lebih dari 3 jam sebelum pemeriksaan dilaksanakan.
2 Peralatan
a) Tabung reduktasi dengan batas lingkar 11 ml steril.
Sterilisasi tabung tidak boleh lebih dari 48 jam sebelum uji dilaksanakan. b) Sumbat karet steril.
Sterilisasi sumbat karet dilakukan dalam autoklaf selama 10 menit atau dalam air mendidih selama 0,5 jam.
c) Pipet steril 1, 10 ml
d) Inkubator atau penangas air dengan suhu 37 + 1o C. e) Kartu standar warna.
3 Prosedur
3.1 Masukkan 1 ml zat warna dalam tabung reduktasi steril dan tambahkan 10 ml susu.
3.2 Tutuplah tabung dengan sumbat karet dan dibolak-balik minimal 3 kali. 3.3 Masukkan tabung ke dalam penangas air (37 + 10 C) selama 1 jam. Bila akan menggunakan inkubator, maka tabung terlebih dahulu harus dimasukkan ke dalam penangas air (37 + 10 C) selama 5 menit kemudian dimasukkan ke dalam inkubator selama 55 menit.
34 dari 82
3.4 Pembacaan dapat dilakukan 1 jam setelah tabung reduktase tadi dikeluarkan dari penangas air atau inkubator dan sebelum pembacaan dimulai hendaknya tabung dimiringkan atau dibalikkan dahulu 1 kali.
4 Hasil uji
Cocokkan warna yang terbentuk dengan standar warna yang tersedia setelah lewat waktu yang ditetapkan.
Uji sedimen
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda untuk mengetahui adanya kemungkinan penanganan susu yang tidak higienis.
2 Prinsip
Kadar sedimen susu ditentukan dengan cara memusingkan susu dengan kecepatan tinggi.
3 Pereaksi Tidak diperlukan
4 Peralatan
a) Tabung sentrifus Tromsdorf.
b) Sentrifus dengan kecepatan 3000 rpm/menit.
5 Prosedur
5.1 Susu yang belum disaring dipanaskan hingga 60o C selama 5 menit. 5.2 Isi tabung Tromsdorf dengan susu yang telah dipanaskan tadi sampai garis 10 ml.
5.3 Susu tersebut disentrifusi selama 10 menit dengan putaran 3000 rpm/ menit.
5.4 Tabung dikosongkan dan dicuci dengan aquades steril.
5.5 Letakkan tabung terbalik diatas rak untuk beberapa waktu kemudian kadar sedimen dibaca.
6 Hasil Uji
36 dari 82 Pengujian cemaran mikroba
1 Pendahuluan
Pengujian cemaran mikroba dalam susu segar adalah bertujuan sebagai indikator sanitasi dalam roses produksi atau penanganan susu serta sebagai indikator kesehatan dan keamanan susu.
Berbagai macam uji mikrobiologi dapat dilakukan, meliputi uji kuantitatif mikroba untuk menentukan kualitas, uji kualitatif bakteri patogen untuk menentukan tingkat keamanannya, serta uji bakteri indikator untuk menentukan tingkat sanitasi susu tersebut.
2 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda pengujian kuantitatif
3 Peralatan Umum
Catatan: Seluruh peralatan yang mengalami kontak langsung dengan contoh susu yang diuji, pelarut maupun media biakan harus steril.
a) Pipet yang disumbat dengan kapas dengan ukuran 1 ml, 5 ml atau 10 ml.
b) Cawan petri, terbuat dari gelas atau plastik, berdiameter 90 - 100 mm. c) Tabung reaksi dengan kapasitas 20, 50 ml.
d) Labu erlenmeyer. e) Inkubator.
f) Pembakar Bunsen. g) Penangas air.
h) Tube shaker/pengocok mekanis.
i) Rak tabung reaksi.
j) Penghitung koloni atau “Hand Tally Counter”. k) Ose.
l) Timbangan
m) Spreader dari batang gelas/logam bengkok (hockey stick, spatel)
01- Penentuan Angka Lempeng Total pada 350C
1 Prinsip
Angka lempeng total (Total Plate Count) dimaksudkan untuk menunjukkan jumlah mikroorganisma yang terdapat dalam susu dengan metoda hitungan cawan.
Jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop.
2 Media
Plate Count Agar (Standard Method Agar).
3 Prosedur
Umum : selama pengerjaan penuangan, beberapa hal yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut:
a) Jaga agar tutup cawan tetap berada pada tempatnya kecuali pada saat akan menambahkan larutan contoh atau media PCA tutup cawan jangan dibuka terlalu lebar untuk menghindari kontaminasi dari luar.
b) Jarak waktu antara memipet larutan contoh hingga penuangan media PCA ke cawan petri dilakukan dalam waktu tidak lebih dari 10 menit.
c) Waktu antara dimulainya pengenceran sampai penuangan media pada cawan petri terakhir tidak boleh lebih dari 20 menit.
d) Untuk mencegah terjadinya kontaminasi silang, maka semua pekerjaan dilakukan di dekat nyala api Bunsen dan mulut segala bejana harus disterilkan sebelumnya dengan nyala api Bunsen.
38 dari 82 3.1.1 Siapkan contoh susu secara aseptis.
3.1.2 Lakukan pengenceran contoh susu secara desimal (menjadi pengenceran 1:10, 1:100, 1:1000, dan seterusnya).
3.1.3 Letakkan labu erlenmeyer secara berderet dan masing-masing diberi tanda 1:10, 1:100, 1:1.000, dan seterusnya serta 1 (satu) labu erlenmeyer lainnya dengan tanda K (Kontrol).
3.1.4 Deretkan pula cawan petri di depan labu erlenmeyer seperti dimaksud pada butir 3.1.3 disesuaikan dengan pengencerannya. Untuk meningkatkan ketepatan pengujian, sebaiknya pemupukan dilakukan secara duplo. Dengan mengetahui sejarah contoh susu serta berdasarkan pengalaman, maka cemaran mikroba dalam susu dapat diperkirakan jumlahnya secara kasar, sehingga pemupukan pada cawan petri dapat diambil dari 3 atau 4 konsentrasi tertentu yang berurutan.
3.1.5 Bila diharapkan jumlah cemaran susu adalah 105, maka contoh susu dikocok dengan shaker/pengocok mekanis dan dengan menggunakan pipet steril pindahkan 0,1 ml ke dalam cawan petri bertanda 10-1 dan sebanyak 1 ml ke dalam Buffered Peptone Water 0,1% dalam labu erlenmeyer I bertanda 1 : 10.
3.1.6 Kocok labu erlenmeyer (I) ini dengan shaker/pengocok mekanis, kemudian dengan pipet steril dipindahkan 0,1 ml ke dalam cawan petri bertanda 10-2, dan 1 ml ke dalam labu Erlenmeyer II bertanda 1:100.
3.1.7 Lakukan prosedur yang sama untuk mempersiapkan pemupukan selanjutnya.
3.1.8 Dengan pipet steril, pindahkan 1 ml Buffered Peptone Water dari labu Erlenmeyer bertanda K ke dalam cawan petri bertanda K.
3.1.9 Sementara itu tabung reaksi yang berisi 12 - 15 ml PCA dipanaskan dalam penangas air sampai mencair, kemudian didinginkan sampai suhunya mencapai 40 - 50oC.
3.1.10 Tuangkan tiap 12 - 15 ml PCA tadi ke masing-masing cawan petri yang sudah berisi larutan contoh.
3.1.11 Supaya larutan contoh dan media PCA dapat tercampur dengan baik, maka lakukan gerakan searah gerakan jarum jam yang dilanjutkan dengan gerakan berlawanan dengan arah jarum jam, atau dengan gerakan seperti angka delapan, masing-masing sebanyak 5 kali. Selama pencampuran, jaga jangan sampai tutup cawan terkena campuran larutan contoh dan media tersebut. Biarkan cawan-cawan tersebut pada posisi horisontal sampai mengeras.
3.2. Inkubasi
3.2.1 Segera setelah media mengeras, cawan-cawan petri tersebut dibalik hingga posisi tutupnya berada di bawah, dan masukkan ke dalam inkubator 35oC selama 48 jam
3.2.2 Cawan-cawan harus diatur sedemikian rupa sehingga inkubator tidak terlalu penuh, dan tidak ada cawan yang menyentuh dinding inkubator. Cawan boleh diatur bersusun yang tingginya tidak lebih dari 6 cawan.
4 Penghitungan koloni
4.1 Pilihlah cawan yang ditumbuhi oleh koloni yang jumlahnya antara 25 - 250. Bila cawan dari tingkat pengenceran berbeda memiliki jumlah koloni pada kisaran tersebut di atas, maka pilihlah cawan dengan koloni yang lebih banyak. 4.2 Gunakanlah tally counter untuk menghitung koloni, dan berilah tanda koloni yang sudah dihitung untuk menghindari penghitungan ulang.
4.3 Bila ada koloni yang menyebar, maka dihitung sebagai satu koloni. Akan tetapi bila lebih dari 25% koloni yang tumbuh pada suatu cawan adalah koloni yang menyebar, maka cawan tersebut tidak perlu dihitung.
5 Interpretasi Hasil/Perhitungan
Jumlah koloni per ml susu dihitung dengan mengalikan jumlah rata-rata koloni dari pengenceran yang dipilih dengan kebalikan dari faktor pengenceran
Contoh:
Misalnya, jika setelah diinkubasi diperoleh 60 dan 64 koloni pada masing-masing cawan duplo yang mengandung pengenceran 10-4, maka jumlah koloni dapat dihitung sebagai berikut (1 ml larutan pengencer dianggap mempunyai berat 1 gram):
Faktor pengenceran = Pengenceran x Jumlah yang ditumbuhkan = 10-4 x 1,0
= 10-4
40 dari 82 = 6.2 x 105
6 Pelaporan
6.1 Untuk melaporkan hasil analisa mikrobiologi digunakan suatu standar yang disebut Standard Plate Count (SPC) dengan satuan colony-forming units
(CFU) per mililiter atau per gram, dan hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari
dua angka, yaitu angka pertama di depan koma dan angka kedua di belakang koma. Jika angka yang ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5, maka dilakukan pembulatan satu angka lebih tinggi dari angka kedua.
6.2 Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan angka kurang dari 25 koloni, maka hanya jumlah koloni pada pengenceran terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 25 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.
Jumlah koloni per pengenceran SPC Keterangan 10-2 10-3 10-4 16 1 0 < 2,5 x 103 (1,6 x 103 Hitung pengenceran 10-2
6.3 Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan lebih dari 250 koloni, maka hanya jumlah koloni pada pengenceran tertinggi yang dihitung, misalnya dengan cara menghitung jumlahnya pada 1/4 bagian cawan petri, kemudian hasilnya dikalikan empat. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 250 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.
Jumlah koloni per pengenceran
10-2 10-3 10-4 TBUD*) TBUD 355 < 2,5 x 106 (1,6 x 106 Hitung pengenceran 10-4 TBUD 325 20 < 2,5 x 105 (1,6 x 105 Hitung pengenceran 10-3
*) TBUD = Terlalu banyak untuk dihitung
6.4 Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, maka data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh hanya dari salah satunya, meskipun salah satu dari cawan duplo tersebut.
7 Hasil Uji
Jumlah koloni yang diperoleh dinyatakan dengan Colony Forming Units (CFU) per ml.
02- Penghitungan Coliform dan Escherichia coli
1 Prinsip
Kristal violet dan garam empedu yang ada di media akan menghambat bakteri Gram positif lainnya sehingga hanya organisme coliform yang tumbuh. Selama pertumbuhannya, coliform akan mengubah laktosa menjadi asam dan perubahan ini akan dideteksi oleh indikator neutral red yang akan berubah warnanya menjadi merah. Selain itu keadaan asam akan menyebabkan presipitasi asam empedu.
2 Media, pereaksi dan kuman uji
42 dari 82
b) Violet Red Bile Agar (VRBA)
c) Violet Red Bile Dextrose Agar (VRBDA)
d) Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLBB)
e) Lauryl tryptose (LST) broth
f) EC broth
g) Levine's eosin-methylene blue (L-EMB) agar
h) Tryptone (tryptophane) broth
i) MR-VP broth
j) Koser's citrate broth
k) Plate count agar (PCA) (standard method)
l) Reagen Kovac
m) Reagent Voges-Proskaeur (VP)
3 Peralatan
a) Tabung reaksi berkapasitas 20 ml dilengkapi tabung Durham
4 Prosedur
4.1. Penghitungan Jumlah Presumtif Coliform Dengan Metoda Hitungan Cawan
4.1.1 Lakukan pengenceran contoh secara desimal seperti metoda hitungan cawan. Untuk pengenceran pertama dianjurkan mengambil 25 ml contoh yang dimasukkan ke dalam 225 ml larutan PW 0,1% steril.
4.1.2 Masukkan 0,1 ml atau 1,0 ml contoh ke dalam cawan petri steril. Pengujian sebaiknya dilakukan secara duplo. Kemudian tuangkan 10 - 15 ml media VRBA (suhu antara 45 - 480C). Supaya larutan contoh dan media agar dapat tercampur dengan baik, maka putarlah cawan dengan gerakan searah gerakan jarum jam yang dilanjutkan dengan gerakan berlawanan dengan arah jarum jam, atau dengan gerakan seperti angka delapan, masing-masing sebanyak 5 kali. Selama pencampuran, jaga jangan sampai tutup cawan terkena campuran larutan contoh dan media tersebut.
4.1.3 Setelah memadat tuangkan kembali 3-4 ml VRBA cair (overlay) di atas permukaan agar.
4.1.4 Segera setelah media mengeras, cawan-cawan petri tersebut dibalik hingga posisi tutupnya berada di bawah, dan masukkan ke dalam inkubator 350C selama 18-24 jam.
4.1.5 Cawan-cawan harus diatur sedemikian rupa sehingga inkubator tidak terlalu penuh, dan tidak ada cawan yang menyentuh dinding inkubator. Cawan boleh diatur bersusun yang tingginya tidak lebih dari 6 cawan.
4.1.6 Hitung semua koloni berwarna merah keunguan yang dikelilingi zona merah (diameter koloni pada umumnya 0,5 mm atau lebih). Pilihlah cawan yang ditumbuhi oleh koloni yang jumlahnya antara 25 - 250. Bila cawan dari tingkat pengenceran berbeda memiliki jumlah koloni pada kisaran tersebut di atas, maka pilihlah cawan dengan koloni yang lebih banyak. Gunakanlah tally
counter untuk menghitung koloni, dan berilah tanda koloni yang sudah
dihitung untuk menghindari penghitungan ulang.
4.1.7 Hasil yang diperoleh adalah jumlah presumtif coliform per ml/gram contoh. Untuk mendapatkan jumlah coliform sebenarnya perlu dilanjutkan ke uji konfirmasi coliform.
4.2 Konfirmasi Coliform
4.2.1 Pilihlah koloni-koloni yang mewakili semua jenis koloni yang tumbuh. Ambillah 10 koloni dengan ose steril, dan pindahkan masing-masing ke dalam 10 ml BGLBB steril dalam tabung-tabung reaksi yang telah dilengkapi dengan tabung durham.
4.2.2 Inkubasikan tabung-tabung reaksi tersebut pada suhu 350C selama 24-48 jam, amati terbentuknya gas dalam tabung durham sebagai reaksi positif. 4.2.3 Hitunglah tabung yang berisi gas. Untuk meyakinkan pertumbuhan coliform, buatlah preparat ulas dari tabung positif yang diwarnai pewarnaan Gram.
44 dari 82
Tabung positif (%) = Jumlah tabung positif x 100 % 10
Jumlah coliform per ml/gram = % tabung positif x jumlah (seluruh) koloni dalam cawan petri x faktor pengenceran cawan petri tersebut.
4.4 Uji konfirmasi Escherichia coli dengan metoda the Most Probable
Number (MPN)
4.4.1 Siapkan beberapa seri (seri 3 atau 5) tabung yang berisi EC broth yang dilengkapi dengan tabung Durham.
4.4.2 Pilihlah tabung BGLB positif sedikitnya dari tiga pengenceran yang berurutan. Goyangkan secara hati-hati tabung positif tersebut dan dengan ose steril pindahkan suspensi ke masing-masing seri tabung reaksi berisi EC broth, disesuaikan dengan pengencerannya.
4.4.3 Inkubasikan tabung rekasi tersebut pada suhu 45,50C selama 48 jam. Amati terbentuknya gas sebagai reaksi positif setelah diinkubasikan selama 24 jam. Bila belum terbentuk gas, inkubasi dilanjutkan dan amati reaksi positif pada 48 jam.
4.4.4 Jumlah tabung yang positif dari masing-masing seri dicocokkan dengan tabel statistik untuk mengetahui jumlah fecal coliform, dan dinyatakan dengan MPN per unit sampel.
4.4.5 Dengan ose steril pindahkan suspensi dari masing-masing tabung positif ke Levine's eosin-methylen blue (L-EMB) agar dan goreskan ke permukaan agar beberapa kali agar dapat diperoleh koloni tunggal. Inkubasikan cawan pada suhu 350C selama 18-24 jam dan amati adanya koloni berwarna gelap dan datar dengan atau tanpa warna metal.
4.4.6 Pindahkan 2 koloni yang dicurigai dari tiap cawan L-EMB ke agar miring PCA untuk pengujian morfologi dan biokimia, kemudian inkubasikanh pada suhu 350C selama 18-24 jam.
4.4.7 Lakukan pewarnaan Gram, amati adanya bakteri coccus atau cocoid, Gram negatif. Uji konfirmasi E. coli dilanjutkan ke uji biokimia IMViC (Indol-Voges Proskauer-Methyl red-Citrat) sebagai berikut:
Inokulasi tabung berisi tryptone broth dan inkubasikan pada suhu 350C selama 24 jam. Tambahkan 0,2 - 0,3 reagent Kovacs untuk menguji adanya pembentukan indole yang ditunjukkan dengan adanya warna merah yang jelas di bagian atas.
b) Voges-Proskauer.
Inokulasi tabung berisi MRVP broth dan inkubasikan pada suhu 350C selama 48 jam. Pindahkan 1 ml suspensi ke dalam tabung berukuran 13 x 100 mm. Tambahkan 0,6 larutan alpha-naphthol dan 0,2 ml KOH 40%, kemudian kocok. Setelah itu tambahkan beberapa kristal kreatin, kocok lagi dan diamkan selama 2 jam. Uji positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna pink eosin. c) Methyl red.
Setelah test VP, inkubasikan lagi tabung MRVP pada suhu 350C selama 48 jam. Tambahkan 5 tetes larutan methyl red ke masing-masing tabung. Positif test ditunjukkan dengan adanya warna merah yang jelas. Sedangkan reaksi negatif ditunjukkan dengan adanya warna kuning.
d) Citrate.
Inokulasi secara ringan tabung yang berisi Koser citrate broth; hindari adanya kekeruhan yang dapat terdeteksi dengan jelas. Inkubasikan pada suhu 350C selama 9 jam. Adanya kekeruhan yang jelas menunjukkan reaksi positif.
e) Pembentukan gas dari fermentasi laktosa.
Inokulasi tabung berisi LST broth dan inkubasikan pada suhu 350C selama 48 jam. Reaksi positif ditunjukkan dengan berpindahnya media dari tabung bagian dalam atau timbulnya busa setelah dilakukan agitasi secara halus.
f) Interpretasi.
Semua kultur yang 1) memfermentasikan laktosa dengan produksi gas pada suhu 350C dalam 48 jam, 2) muncul sebagai bakteri coccus, Gram negatif, dan 3) mempunyai pola ++-- (biotipe 1) atau -+-- (biotipe 2) pada uji IMViC dinyatakan sebagai E. coli. Hitung MPN E. coli berdasarkan tabung-tabung EC yang mengandung E. coli yang berasal dari 3 konsentrasi yang berurutan.
46 dari 82
03. Penghitungan Staphylococcus aureus dengan metoda hitungan cawan
Metoda ini digunakan untuk menghitung jumlah S. aureus lebih besar dari 100 sel S. aureus per ml/gram contoh. Metoda yang biasa digunakan adalah metoda sebar/permukaan.
1 Prinsip
Manitol akan diubah oleh Staphylococcus yang tumbuh menjadi asam dan susuana asam ini akan mengubah indikator phenol red menjadi kuning.
Tellurite yang ada akan menjadi tellurite yang berwarna hitam.
2 Media, pereaksi
a) Baird Parker Agar (BPA) (tambahkan 5 ml egg yolk tellurite ke dalam 95 ml agar cair
b) Trypticase Soy Agar (TSA)
c) Brain Heart Infusion (BHI) broth
d) Coagulase plasma kelinci mengandung EDTA 0,1%
e) Buffered Peptone Water (BPW) 0,1%
3 Prosedur
3.1 Isolasi dan enumerasi S. aureus
a) Buat pengenceran desimal terhadap contoh seperti metoda hitungan cawan.
b) Pindahkan 0,1 ml suspensi contoh dari masing-masing pengenceran ke dalam cawan petri berisi BPA.
c) Dengan spreader sebarkan suspensi contoh di atas permukan agar secara merata dan biarkan suspensi contoh terserap ke dalam media agar dengan mendiamkan cawan-cawan tersebut sekitar 10 menit.
3.2 Inkubasi
3.2.1 Inkubasikan cawan-cawan tersebut dengan posisi tutup berada di bawah pada suhu 35-370C selama 45-48 jam.
3.2.2 Cawan-cawan harus diatur sedemikian rupa sehingga inkubator tidak terlalu penuh, dan tidak ada cawan yang menyentuh dinding inkubator. Cawan boleh diatur bersusun yang tingginya tidak lebih dari 6 cawan.
3.3 Penghitungan jumlah presumtif S. aureus
3.3.1 Pilihlah cawan yang ditumbuhi oleh koloni tipikal S. aureus yang jumlahnya antara 20 - 200 koloni. Bila cawan dari tingkat pengenceran berbeda memiliki jumlah koloni pada kisaran tersebut di atas, maka pilihlah cawan dengan koloni yang lebih banyak. Koloni khas S. aureus adalah bulat, licin halus, cembung, basah dan berdiameter 2-3 mm jika koloni tidak padat, berwarna abu-abu sampai hitam pekat, dikelilingi zona opak, dengan atau tanpa zona luar yang jelas.
3.3.2 Gunakanlah tally counter untuk menghitung tipikal koloni, dan berilah tanda koloni yang sudah dihitung untuk menghindari penghitungan ulang. Bila ditemukan adanya beberapa jenis koloni, hitung dan catat jenis koloni. Uji konfirmasi dapat dilakukan dengan uji koagulase, clumping faktor dan pewarnaan Gram.
3.4 Uji konfirmasi S. aureus dengan uji koagulase
3.4.1 Pindahkan koloni yang diduga S. aureus ke dalam tabung berisi 0,2-0,3 ml BHI broth dan larutkan dengan seksama.
3.4.2 Tambahkan 0,5 ml coagulase plasma yang mengandung 0,1 5 EDTA ke dalam kultur BHI dan campur dengan seksama. Kemudian inkubasikan pada suhu 350C dan periksa secara periodik adanya penggumpalan setiap 6 jam sekali. Reaksi positif S. aureus ditunjukkan bila terjadi gumpalan yang kokoh dan lengkap dan apabila tabung dijentikkan atau dibalik, gumpalan tadi akan tetap berada ditempat semula. Penggumpalan parsial, dinyatakan dengan reaksi koagulase 2+ dan 3+, harus dilanjutkan dengan uji lebih lanjut.
3.4.3 Bila reaksi koagulase dari kultur yang diduga tidak dapat dipastikan berasal dari S. aureus, maka inokulasikan kultur tersebut pada kultur yang sudah diketahui positif dilanjutkan pada kultur yang sudah diketahui negatif S.
48 dari 82
3.4.4 Lakukan pewarnaan Gram terhadap semua kultur yang diduga S. aureus dan periksa di bawah mikroskop.
4 Interpretasi Hasil/Perhitungan
Jumlah S. aureus per ml susu dihitung dengan mengalikan jumlah rata-rata koloni dari pengenceran yang dipilih dengan kebalikan dari faktor pengenceran
04 Pengujian Salmonellae
1 Prinsip
Dalam metoda ini dilakukan penggunaan gabungan larutan untuk pemulihan/resusitasi (liquid resuscitation), larutan pre-enrichment dan media solid selektif untuk mengisolasi presumtif salmonellae, sedangkan konfirmasi salmonellae harus dilanjutkan dengan uji konfirmasi secara biologi dan serologi.
2 Media, pereaksi, antiserum dan uji 2.1 Media dan pereaksi
2.1.1 Buffered Peptone Water (BPW) (0,1%) 2.1.2 Mannitol selenite cystine broth (MSCB) 2.1.3 Rappaport-Vassiliadis (RV) media 2.1.4 Xylose Lysine desoxycholate (XLD) agar 2.1.5 Bismuth sulfite (BS) agar
2.1.6 Lysine decarboxylase broth 2.1.7 ONPG broth
2.2.1 Kultur dari Salmonella hadar 2.2.2 Kultur dari Citrobacter freundii
3 Prosedur
3.1 Resusitasi (Pre-enrichment)
3.1.1 Masukkan 25 ml contoh susu ke dalam 225 ml BPW dan campur hingga benar-benar merata, kemudian inkubasikan pada suhu 370 C selama 24 jam.
3.1.2 Sebagai kontrol, inokulasi BPW dalam 2 tabung reaksi dengan masing-masing kuman uji dan inkubasikan pada suhu 370 C selama 24 jam.
3.2 Enrichment pada media selektif
3.2.1 Inokulasikan 1 ml suspensi dari masing-masing larutan resusitasi ke 10 ml MSCB dan inkubasikan pada suhu 370
C selama 18-24 jam., serta 0,1 ml lainnya ke 10 ml RV media dan kemudian diinkubasikan pada suhu 420
C selama 18-24 jam.
3.3 Isolasi presumtif Salmonellae pada media agar selektif
3.3.1 Dengan menggunakan ose steril inokulasikan suspensi dari masing-masing media enrichment ke cawan yang berisi XLD agar dan BS agar dengan cara goresan kuadran, kemudian inkubasikan pada suhu 370
C selama 18-24 jam untuk cawan XLD serta 24-48 jam untuk cawan BS. Amati terbentuknya koloni-koloni yang diduga sebagai Salmonellae.
3.3.2 Pada XLD agar, koloni Salmonellae berbentuk bulat dan berwarna hitam mengkilat, sedangkan pada media BS koloni Salmonellae berwarna hitam.
3.3.3 Pilihlah tiga koloni tipikal Salmonellae dari tiap cawan dan inokulasikan masing-masing koloni ke tabung reaksi berisi 2,5 ml larutan pepton 1% kemudian inkubasikan pada suhu 370 C selama 4 jam atau hingga terjadi adanya kekeruhan.
50 dari 82
3.4.1 Dengan ose steril inokulasikan suspensi dari masing-masing tabung reaksi berisi larutan pepton ke Lysine-Decarboxylase broth (sebagai kontrol), ONPG broth dan media agar CLED.
3.4.2 Interpretasi hasil. Suspensi dipastikan mengandung Salmonellae apabila pada media Lysine-Decarboxylase terjadi reaksi positif dengan adanya perubahan warna menjadi kuning, pada media ONPG terjadi reaksi negatif ditunjukkan dengan tidak adanya perubahan warna.
Penghitungan jumlah sel radang
Metoda langsung 1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda langsung penghitungan jumlah sel radang dalam susu segar dengan menggunakan metoda Breed.
2 Prinsip
Untuk menetapkan jumlah sel radang dalam susu, maka dihitung jumlah sel radang dalam 0,01 ml susu yang disebarkan di atas gelas objek hingga mencapai luas 1 cm2 dan kemudian diwarnai.
3 Pereaksi
a) Larutan alkohol ether (ana) b) Larutan alkohol 96%
c) Larutan methylen blue Loeffler
4 Peralatan
a) Gelas objek bersih yang bebas dari lemak b) Pipet Breed steril
c) Bunsen d) Mikroskop e) Ose siku
5 Prosedur
5.1 Siapkan sebuah gelas objek yang telah dibersihkan dan bebas dari lemak, kemudian diberi tanda yang menunjukkan asal contoh susu.
52 dari 82
5.2 Letakkan gelas objek tersebut di atas kertas yang sudah berisi gambar kotak seluas 1 cm2.
5.3 Pipet sejumlah 0,01 ml contoh susu dengan pipet Breed ke daerah yang dibatasi kotak, dan dengan bantuan ose siku contoh susu tadi disebarkan sehingga menutupi seluruh gambar kotak (luas 1 cm2).
5.4 Keringkan di udara sampai kering (sekitar 5 - 10 menit), kemudian difiksasi di atas nyala api.
5.5 Lakukan pewarnaan dengan cara:
a) Celupkan preparat tadi ke dalam larutan alkohol-ether (ana) selama 2 menit,
b) Masukkan preparat tadi ke dalam larutan methylen blue Löffler selama 1 menit,
c) Bilas secara hati-hati dengan air,
d) Celupkan ke dalam alkohol 96% (untuk membersihkan bahan pulasan yang tidak terikat),
e) Preparat dikeringkan di udara atau dengan kertas pengisap.
5.6 Penetapan jumlah sel radang dilakukan dengan bantuan mikroskop (pembesaran 100x) dengan menggunakan lensa minyak imersa.
5.7 Hitung jumlah sel radang dalam 20 lapangan pandang, kemudian dirata-ratakan.
6 Cara Perhitungan
Tentukan luas lapang penglihatan dengan cara menghitung diameter lapangan penglihatan dari mikroskop yang digunakan dengan rumus: r2.
Diketahui pada bidang 1 cm2 disebarkan 0,01 ml susu, maka jumlah sel radang pada luas lapang penglihatan adalah:
r2
X 0,01 ml 100
7 Hasil Uji
Pengujian residu antibiotik
I Skrining residu antibiotika
Pendahuluan
Pada dasarnya cara pengujian residu antibiotika dibedakan antara uji skrining dan uji konfirmasi. Tujuan dilakukannya skrining residu antibiotika pada susu segar adalah untuk mengetahui kemungkinan adanya residu antibiotika dalam susu secara kualitatif atau semi kuantitatif. Dengan demikian dengan cara ini hanya dapat diketahui ada/tidak adanya suatu residu antibiotika serta golongan dari antibiotika yang ditemukan dari contoh susu yang diperiksa, sedangkan untuk mengetahui jenis dan konsentrasi residu antibiotika secara pasti harus dilanjutkan dengan uji konfirmasi.
Metoda -1
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metode untuk skrining residu antibiotika pada air susu dengan batas kepekaan adalah antara konsentrasi 0.04 µg/ml sampai 1 µg/ml tergantung dari jenis antibiotika, sedangkan angka perolehan kembali antara 75% - 95%.
2 Prinsip
Sampel susu dihomogenisasi. Tetesi kertas cakram dengan sampel susu, lalu letakkan kertas cakram tersebut di atas permukaan media agar yang telah dicampur dengan biakan bakteri uji dan diinkubasikan pada suhu 370 C selama 16-18 jam. Contoh susu dinyatakan positif mengandung residu antibiotika bila terbentuk zone hambatan di sekitar kertas cakram.
3 Bahan
54 dari 82 c) Kuman uji :
1) Micrococcus luteus ATCC 9341 - untuk golongan Makrolida.
2) Bacilus subtilis ATCC 6633 - untuk golongan Amino-glikosida.
3) Bacillus cereus ATCC 11778 - untuk golongan Tetrasiklin.
4) Bacillus calidolactis - untuk golongan Penisilin.
d) Larutan stok baku pembanding untuk antibiotika penisilin (PC), kanamisin (KM), tilosin (TS) dan oksitetrasiklin (OTC).
e) Larutan baku kerja.
f) Kultur media (inokulasikan sebanyak 1% kuman uji pada media agar:
Bacillus subtilis pada media NV-4, Micrococcus luteus pada media NV-8 dan Bacillus cereus pada media MX).
g) Kurva baku
4 Peralatan
a) Cawan petri steril 100 x 12 mm b) Inkubator 370 C dan 300 C
c) Tabung sentrifus 50 ml, tabung reaksi 50 ml.
d) Kertas cakram steril berdiameter 8-10 mm, silinder cakram 0,3 ml. e) Ultra turax.
f) Sentrifus. g) Mikro pipet.
5 Prosedur
5.1 Persiapan media agar
5.1.1 Media NV-4 : Larutkan 5 gr pepton, 3 gr beef extract dan 16 gr agar dalam 1.000 ml air suling, lalu ukur pH 8,5 ± 0.1, dan kemudian didihkan. Media disterilisasi dengan memasukkannya ke dalam otoklaf pada suhu 1210C, 15 psi selama 15 menit.
5.1.2 Medium NV-8: Larutkan 6 gr pepton, 1,5 gr beef extract, 3 gr yeast
extract, 1 gr D(+) Glucose dan 16 gr agar dalam 1.000 ml air suling, ukur pH
8.5 ± 0.1, didihkan, kemudian sterilisasi dengan otoklaf pada suhu 1210C, 15 psi selama 15 menit.
5.1.3 Medium MX: Larutkan 6 gr pepton, 1,5 gr beef extract, 3 gr Yeast
extract, 1,35 gr kalium dihidrogen fosfat dan 15 gr agar dalam 1.000 ml air
suling dengan pH 5,7 ± 0.1, didihkan dan dilakukan sterilisasi dengan otoklaf pada suhu 1210 C, 15 psi selama 15 menit
5.2. Persiapan larutan dapar fosfat
5.2.1 Dapar fosfat pH 7.0± 0.1: Campuran 6,4 gr kalium dihidrogen fosfat, 18,9 gr dinatrium hidrogen fosfat dalam 1.000 ml air suling, otoklaf pada suhu 1210C, 15 psi selama 15 menit
5.2.2 Dapar fosfat pH 8.0±0.1: Campuran 13,3 gr kalium dihidrogen fosfat dan 6,2 gr kalium hidroksida dalam 1.000 ml air suling, otoklaf pada suhu 1210C, 15 psi selama 15 menit.
5.3 Larutan stok baku pembanding : Timbang 20 mg masing-masing baku pembanding penisilin (PC), kanamisin (KM), tilosin (TS) dan oksitetrasiklin (OTC), kemudian larutkan masing-masing dengan larutan dapar fosfat pH 7.0.
5.4 Larutan baku kerja : Untuk masing-masing antibiotika buat 6 serial pengenceran larutan stok baku kerja dengan air atau larutan dapar fosfat hingga konsentrasi 0,05 IU/ml atau 1 µg/ml.
5.5 Kultur media :
5.5.1 Cairkan media agar (NV-4, NV-8, MX) dengan pemanasan pada suhu 1000 C, kemudian dinginkan dan simpan dalam penangas air bersuhu 560 C. 5.5.2 Inokulasikan 1% kuman uji Bacillus subtilis pada media agar NV-4,
Micrococcus luteus pada media NV-8 dan Bacillus cereus pada media MX
dan campur secara seksama sehingga kuman uji dan media dapat tercampur rata. Tuangkan sebanyak 7 ml masing-masing kultur media tersebut ke dalam cawan petri steril dan biarkan menjadi beku.
56 dari 82 5.6 Kurva baku
5.6.1 Siapkan tabung reaksi berisi 9 ml susu
5.6.2 Tambahkan masing-masing larutan baku kerja dari tiap konsentrasi ke dalam susu (hitung konsentrasi akhir dalam susu).
5.6.3 Siapkan media agar NV-4, NV-8 dan MX masing-masing sebanyak 5 cawan petri untuk setiap konsentrasi pengenceran.
5.6.4 Ambil kertas cakram steril dengan pinset steril dan letakkan masing-masing 4 buah kertas cakram di atas permukaan media agar.
5.6.5 Teteskan 30 µl setiap pengenceran ke kertas cakram. Inkubasikan 35-370 C selama 16-18 jam. Ukur diameter zona hambatan.
5.6.6 Buat kurva semilogaritmik dari rata-rata diameter zona hambatan yang terbentuk dengan konsentrasi antibiotika. Respon point (RP) diambil darimasingmasing antibiotika dengan zona hambatan berdiameter antara 1,2 -1,5 mm.
5.7 Pengujian contoh susu
5.7.1 Siapkan kultur media untuk masing-masing kelompok antibiotika. Pengujian contoh susu dilakukan secara triplet.
5.7.2 Letakkan kertas cakram steril di atas permukaan kultur media. Tiap cawan petri kultur media berisi 4 buah kertas cakram. Dengan menggunakan pipet steril, tetesi kertas cakram steril dengan contoh susu.
5.7.3 Inkubasikan pada suhu 37o C selama 16-18 jam. Ukur diameter zona hambatan dengan kaliper atau jangka sorong.
5.7.4 Sesuaikan dengan kurva baku
6 Cara menyatakan hasil
Sampel susu dinyatakan positif mengandung residu apabila terbentuk zona hambatan di sekitar kertas cakram, minimal 1 mm lebih besar dari diameter kertas cakram.
Metode-2
1 Ruang lingkup
Standar ini menetapkan metoda skrining residu antibiotika dari susu segar, terutama residu antibiotika golongan penisilin dan golongan tetrasiklin. Batas kepekaan antara 0,1 µg/ml sampai 20 µg/ml tergantung jenis antibiotika.
2 Prinsip
Kultur Bacillus stearothermophillus var calidolactis diinokulasi pada media agar. Teteskan contoh susu pada kertas cakram, letakkan pada media agar, kemudian diinkubasikan pada 550 C selama 2 jam 30 menit. Untuk memastikan adanya residu golongan penisilin, maka penisilinase ditambahkan pada contoh susu sebelum diteteskan pada kertas cakram. Tidak terbentuknya zona hambatan menunjukkan indikasi adanya penisilin karena antibiotika tersebut telah diinaktifkan oleh penisilinase.
3 Bahan Media
a) Skim Milk: Larutkan 100 gr skim milk dalam 1.000 ml air dengan suhu
45-500 C, bagikan ke dalam tabung-tabung reaksi 50 ml, tutup dan otoklaf selama 20 menit pada suhu 1150 C, simpan dalam lemari pendingin hingga saat akan digunakan.
b) Nutrient broth: Larutkan 20 gr tryptone, 10 gr yeast extract, 0,5 gr
dextrose dalam air 1.000 ml dengan suhu 45-500 C, masukan ke dalam tabung
masing-masing 15 ml, tutup dan otoklaf dengan suhu 1210 C selama 15 menit. c) Stok kultur media : Larutkan masing-masing 5 gr pepton, 2 gr yeast
extract dehydrated, 1 gr beef extract, 5 gr natrium klorid dan 12,18 gr agar
dalam 1.000 ml air, ukur agar pH 7,4 kemudian didihkan. Masukkan sejumlah 10 ml kultur media ke dalam tabung, tutup dan otoklaf dengan suhu 1210 C selama 15 menit.
d) Media agar difusi : Larutkan masing-masing 5 gr tryptone, 2,5 gr yeast
extract dehydrated, 1 gr dextrose dan 12,18 gr agar dalam 1.000 ml air, ukur
58 dari 82 e) Larutan stok baku pembanding :
1) Larutan baku penisilin : Larutkan 100 mg benzil-penisilin dengan 100 ml dapar fosfat pH 6 + 0,1. Simpan dalam lemari pendingin (Tahan 2 minggu) 2) Larutan baku penisilin dalam air susu: Encerkan stok baku penisilin dengan air susu sampai konsentrasi 0.006 µg/ml, setara dengan 0,01 IU/ml.
4 Peralatan
a) Cawan petri 100 mm x 12 mm b) Labu erlenmeyer 125 ml
c) Glass beads 5 mm
d) Inkubator 37-65 oC
e) Labu ukur 125 ml dengan tutup f) Gelas piala 100 ml dan 1000 ml g) Otoklaf h) Kertas cakram 8-10 mm i) Wire-loop j) Tabung pembiak 5 ml, 10 ml, 20 ml k) Tangas air 45-100 oC l) Vortex - mixer 5 Prosedur
5.1 Persiapan biakan Bacillus stearothermophillus var calidolactis C 953 5.1.1 Aktivasi ulang biakan (Reactivation culture).
Dengan menggunakan wire loop, tambahkan biakan dalam bentuk freeze dried ke dalam 3 tabung nutrient broth yang masing-masing berisi 10 ml, inkubasikan pada suhu 550 C selama 16 jam.
