Metoda 02 : Uji resazurin
02- Penghitungan Coliform dan Escherichia coli
1 Prinsip
Kristal violet dan garam empedu yang ada di media akan menghambat bakteri Gram positif lainnya sehingga hanya organisme coliform yang tumbuh. Selama pertumbuhannya, coliform akan mengubah laktosa menjadi asam dan perubahan ini akan dideteksi oleh indikator neutral red yang akan berubah warnanya menjadi merah. Selain itu keadaan asam akan menyebabkan presipitasi asam empedu.
2 Media, pereaksi dan kuman uji
42 dari 82
b) Violet Red Bile Agar (VRBA)
c) Violet Red Bile Dextrose Agar (VRBDA)
d) Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLBB)
e) Lauryl tryptose (LST) broth
f) EC broth
g) Levine's eosin-methylene blue (L-EMB) agar
h) Tryptone (tryptophane) broth
i) MR-VP broth
j) Koser's citrate broth
k) Plate count agar (PCA) (standard method)
l) Reagen Kovac
m) Reagent Voges-Proskaeur (VP)
3 Peralatan
a) Tabung reaksi berkapasitas 20 ml dilengkapi tabung Durham
4 Prosedur
4.1. Penghitungan Jumlah Presumtif Coliform Dengan Metoda Hitungan Cawan
4.1.1 Lakukan pengenceran contoh secara desimal seperti metoda hitungan cawan. Untuk pengenceran pertama dianjurkan mengambil 25 ml contoh yang dimasukkan ke dalam 225 ml larutan PW 0,1% steril.
4.1.2 Masukkan 0,1 ml atau 1,0 ml contoh ke dalam cawan petri steril. Pengujian sebaiknya dilakukan secara duplo. Kemudian tuangkan 10 - 15 ml media VRBA (suhu antara 45 - 480C). Supaya larutan contoh dan media agar dapat tercampur dengan baik, maka putarlah cawan dengan gerakan searah gerakan jarum jam yang dilanjutkan dengan gerakan berlawanan dengan arah jarum jam, atau dengan gerakan seperti angka delapan, masing-masing sebanyak 5 kali. Selama pencampuran, jaga jangan sampai tutup cawan terkena campuran larutan contoh dan media tersebut.
4.1.3 Setelah memadat tuangkan kembali 3-4 ml VRBA cair (overlay) di atas permukaan agar.
4.1.4 Segera setelah media mengeras, cawan-cawan petri tersebut dibalik hingga posisi tutupnya berada di bawah, dan masukkan ke dalam inkubator 350C selama 18-24 jam.
4.1.5 Cawan-cawan harus diatur sedemikian rupa sehingga inkubator tidak terlalu penuh, dan tidak ada cawan yang menyentuh dinding inkubator. Cawan boleh diatur bersusun yang tingginya tidak lebih dari 6 cawan.
4.1.6 Hitung semua koloni berwarna merah keunguan yang dikelilingi zona merah (diameter koloni pada umumnya 0,5 mm atau lebih). Pilihlah cawan yang ditumbuhi oleh koloni yang jumlahnya antara 25 - 250. Bila cawan dari tingkat pengenceran berbeda memiliki jumlah koloni pada kisaran tersebut di atas, maka pilihlah cawan dengan koloni yang lebih banyak. Gunakanlah tally
counter untuk menghitung koloni, dan berilah tanda koloni yang sudah
dihitung untuk menghindari penghitungan ulang.
4.1.7 Hasil yang diperoleh adalah jumlah presumtif coliform per ml/gram contoh. Untuk mendapatkan jumlah coliform sebenarnya perlu dilanjutkan ke uji konfirmasi coliform.
4.2 Konfirmasi Coliform
4.2.1 Pilihlah koloni-koloni yang mewakili semua jenis koloni yang tumbuh. Ambillah 10 koloni dengan ose steril, dan pindahkan masing-masing ke dalam 10 ml BGLBB steril dalam tabung-tabung reaksi yang telah dilengkapi dengan tabung durham.
4.2.2 Inkubasikan tabung-tabung reaksi tersebut pada suhu 350C selama 24-48 jam, amati terbentuknya gas dalam tabung durham sebagai reaksi positif. 4.2.3 Hitunglah tabung yang berisi gas. Untuk meyakinkan pertumbuhan coliform, buatlah preparat ulas dari tabung positif yang diwarnai pewarnaan Gram.
44 dari 82
Tabung positif (%) = Jumlah tabung positif x 100 % 10
Jumlah coliform per ml/gram = % tabung positif x jumlah (seluruh) koloni dalam cawan petri x faktor pengenceran cawan petri tersebut.
4.4 Uji konfirmasi Escherichia coli dengan metoda the Most Probable
Number (MPN)
4.4.1 Siapkan beberapa seri (seri 3 atau 5) tabung yang berisi EC broth yang dilengkapi dengan tabung Durham.
4.4.2 Pilihlah tabung BGLB positif sedikitnya dari tiga pengenceran yang berurutan. Goyangkan secara hati-hati tabung positif tersebut dan dengan ose steril pindahkan suspensi ke masing-masing seri tabung reaksi berisi EC broth, disesuaikan dengan pengencerannya.
4.4.3 Inkubasikan tabung rekasi tersebut pada suhu 45,50C selama 48 jam. Amati terbentuknya gas sebagai reaksi positif setelah diinkubasikan selama 24 jam. Bila belum terbentuk gas, inkubasi dilanjutkan dan amati reaksi positif pada 48 jam.
4.4.4 Jumlah tabung yang positif dari masing-masing seri dicocokkan dengan tabel statistik untuk mengetahui jumlah fecal coliform, dan dinyatakan dengan MPN per unit sampel.
4.4.5 Dengan ose steril pindahkan suspensi dari masing-masing tabung positif ke Levine's eosin-methylen blue (L-EMB) agar dan goreskan ke permukaan agar beberapa kali agar dapat diperoleh koloni tunggal. Inkubasikan cawan pada suhu 350C selama 18-24 jam dan amati adanya koloni berwarna gelap dan datar dengan atau tanpa warna metal.
4.4.6 Pindahkan 2 koloni yang dicurigai dari tiap cawan L-EMB ke agar miring PCA untuk pengujian morfologi dan biokimia, kemudian inkubasikanh pada suhu 350C selama 18-24 jam.
4.4.7 Lakukan pewarnaan Gram, amati adanya bakteri coccus atau cocoid, Gram negatif. Uji konfirmasi E. coli dilanjutkan ke uji biokimia IMViC (Indol-Voges Proskauer-Methyl red-Citrat) sebagai berikut:
Inokulasi tabung berisi tryptone broth dan inkubasikan pada suhu 350C selama 24 jam. Tambahkan 0,2 - 0,3 reagent Kovacs untuk menguji adanya pembentukan indole yang ditunjukkan dengan adanya warna merah yang jelas di bagian atas.
b) Voges-Proskauer.
Inokulasi tabung berisi MRVP broth dan inkubasikan pada suhu 350C selama 48 jam. Pindahkan 1 ml suspensi ke dalam tabung berukuran 13 x 100 mm. Tambahkan 0,6 larutan alpha-naphthol dan 0,2 ml KOH 40%, kemudian kocok. Setelah itu tambahkan beberapa kristal kreatin, kocok lagi dan diamkan selama 2 jam. Uji positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna pink eosin. c) Methyl red.
Setelah test VP, inkubasikan lagi tabung MRVP pada suhu 350C selama 48 jam. Tambahkan 5 tetes larutan methyl red ke masing-masing tabung. Positif test ditunjukkan dengan adanya warna merah yang jelas. Sedangkan reaksi negatif ditunjukkan dengan adanya warna kuning.
d) Citrate.
Inokulasi secara ringan tabung yang berisi Koser citrate broth; hindari adanya kekeruhan yang dapat terdeteksi dengan jelas. Inkubasikan pada suhu 350C selama 9 jam. Adanya kekeruhan yang jelas menunjukkan reaksi positif.
e) Pembentukan gas dari fermentasi laktosa.
Inokulasi tabung berisi LST broth dan inkubasikan pada suhu 350C selama 48 jam. Reaksi positif ditunjukkan dengan berpindahnya media dari tabung bagian dalam atau timbulnya busa setelah dilakukan agitasi secara halus.
f) Interpretasi.
Semua kultur yang 1) memfermentasikan laktosa dengan produksi gas pada suhu 350C dalam 48 jam, 2) muncul sebagai bakteri coccus, Gram negatif, dan 3) mempunyai pola ++-- (biotipe 1) atau -+-- (biotipe 2) pada uji IMViC dinyatakan sebagai E. coli. Hitung MPN E. coli berdasarkan tabung-tabung EC yang mengandung E. coli yang berasal dari 3 konsentrasi yang berurutan.
46 dari 82
03. Penghitungan Staphylococcus aureus dengan metoda hitungan