SNI 01-3541-2002.MAGARIN

\

ybrlft-'F-JNl

Standar Nasional lndonesia

sNt

01

-3541-2002

t:it:. ffi i"S

Dafta; isi

Daftar

isi

... Prakata Ruang lingkup Acuan Definisi Syarat mutu Pengambilan contoh Cara uji iligiene Syarat penandaaan

Lampiran

A

: Ca!-a uji asam butirai dalam lemak

Lampiran

B

: Ca!-a ujivitamin

A...

...

g Lampiran

C

. Cara uji \"/itar,rin D... . ..

2 J 3

Prakata

Penyusunan

Standar

Nasional lndonesia

(SNl)

Margarin

ini

merupakan

revisi SNI

01-3541-1994 Margarin disiapkan

oleh

Tim

Panitia

Teknis Makanan

dan

Minuman, Departemen Perindustrian dan Perdagangan.

Adapun

tujuan revisi

ini

dibuat

adalah sebagai acuan sehingga

produk

margarin yang

Lreredar Ci lndonesia dapat terjamin

mutu

dan keamanannya bagi konsumen. Selain itu

guna

mengakomodir

cara

uji

yang

mengacu

pada

standar

internasicnal

dan perkembangan permintaan pasar yang cepat .

T.:n ci aias'dcia;'liiiieiri,usi.;i-, F,a,lcangen Si'ii ini 'i.c:an r:e::.pci'hati!-lan iiai-hai _{;.'ang telter-a}

dalam :

1

Perrnenkes Rl No. 722ll!'lenkes/PER/l)U88 . Bahan Tambahan Makanan

2.

Kec''nenkes R.l

No.

23/Menkes/Sl(!/78

:

Pedoman

Cara

Produksi

yang Baik

untuk

Makarran.

Standar

ini

suoah oibahas

oleh

rapat teknis

di

Ja<arla

tanggai

7

Septenrber 2001 dan

prol(onsensus

_tanggal

_{21 September 2001 dan terakhii- Cibahas dalam Rapat Konsensus}

Nasional pada tarrgoai 14 Nopernber 20C1 di Jakarta. Hadii- dalarn rapat tersebut

wakii-wakit dari

kbnsunren,

prociusen,

Lembaga

Litba'rg,

Lembaga

lpfEK,

ascsiasi

serta instansi terkait lainnya.

Margarin

'l

Ruang

lingkup

Si;-':a'rni

menetapkan acuan, istilah dan definisi, syarat mutu, pengambilan contoh, cara

-tr

r'',3lene.

pengemasan

dan

syarat

penandaan

untuk

produk

emulsi

berbentuk semi

:aE€: can

cair, dengan kandungan lemaknya tidak kurang

dari

62% dan

iidar

iebih dari

!'tl"

dan penggunaan utamanya adalah sebagai margai'in,

-iia^iar

ini tidak berlaku bagi mentega.

2

.Acuan

S"il

19 - O42B

-

1998, Petunjuk pengambilan contoh

pafat

S51

01 - 3555

-

1998, Cara uji minyak <ian lemak

Sl;i

01 - 2896

-

1998, Care uii cemaran logam

dalam

makanan

SNX

01

-

2897-

1992,

Cara uji cemaran mikroba

Slii

0'1 _- 4865

-

1998, Cara uji cemaran arsen dalant makanan

ACviS

The

American

Oil

Chernisi

Scciety,

1998

Official

$.tiethods arrd recominencied

Frac-Lices of the ACCS 5'h

ed.

AOCS Press Washington, DC Ca 5c-87(1989)

3

lstilah

dan ciefinisi

11

rnargarin

produk makanan berbentuk emuisi {,w/o), baik semipadat maupun cair, yang dibuat dari

lernak ;rrakan

dan atau

minyak

mal<an

nabaii, dengan atau tanpa

perubairan kirniawi

termasuk hidrogenasi. inteiesienfikasi, darr

telair

rnelalrri

proses

pemurrrian. seoagai bahan utama serta mengandung air Can bahan tambahan pangan yang diizinkan.

CATATAN Bila diperlukan, rnargarin dapat pula mengandung lemak susu yang kandungannya

maximum 3oto dari. total lemak 3.2

margarin siap

makan

margarin meja

dan

margarin oles yang ditujukan untuk langsung dimakan, tanpa diolah

terlebih dahulu, Can dikemas

CATATAN margarin ini harus ditambahkan vitamin yang dipersyaratkan, yang jumlahnya sesuai

dengan peraturan yang ditetapkan

3.3

margarin

industri

-

r-:TAi'.t

Margarin iniiidak perlu ditambahkan vitamin

:.4

rnrargarin krirn

atau spread

-:'-rarin

dengan kanndungan

lemaktotai

: 62ok -7\o/s

Syarat mutu

Tabel

1

Syarat

mutu margarin

No.

Kriteria uji

Margarin

siap

makarr

i Keadaan

1.i

Bau 1.2 Warna 1.3 Rasa % btb

i-

*a".s

18 maks 18

o/c

_bib

_{nrin 80 min 80}

l-

rutrcc

2500

_-3500

Persyaratan Margarin tlll,fu:Lr ! dapat diterima dapat diterirna daoat diterima

-R

',100 250

-

350 %biD

_{_qcks_!g}

fnglg_gg

I

maks.O,Z.

i

rnaks 4 maks 4 maks 4 Sesuai peraturan yang beriaku I Asam bi:tirat. Bilanqan asam I Cemaran arsen I Arsen (As) Cemaran mikroba Angka Lempeng Tota! Q clztari hanf r rlz E. Coli S. aureus Salmonella Enterococci

mg/rg

mg/kg

0,1 i'naKs. 40,0/25c*" mal<s.0,03 $.4aks 10s maks 10

<3

Maks 102 negatif Maks 102 0,1 maks. 40,0i250"" maks. 0,03 0,1 maks. 40,0/250"* maks. 0.03 maks 10s maks 10

<3

maks 102 negatif maks 102

'c

0,1 .) .L .J A -a .5 o Koloniig APfr4/g APM/s Koloni/g Koloni/25 g Koloni

.)

_{untuk margarin yang mengandung lemak susu}

**) daiam kemasan kaleng Vitamin A Vitarnin D Cemaran logam

rimbal

(Pb) Timah (Sn) maks 10s maks 10

<3

maks 102 negatif maks 102

5

Pengambitan contoh

Sesuai dengan SNI 19-0428-1998, Petunjuk pengambilan contah padatan

6

Cara uji

6-1

Keadaan

Bau, rasa, dan warna

sesuai

SNI

01

-

2891

-

1992,

Cara uji

makanan

dan

minuman,

butir

1.2

6-2

Kadar air

Sesuai SNI 01 - 2891

-

1992, Cara uji makanan dan minuman, butir 5.1

6.3

Lemak

Sesua! SN!

0'i

2891

,

1992. Cara tiii mai<aneii dan minumJn. Lutir 8.'3

6.4

Bilangan asam

Sesuai SNI 01

_-

3555

-

1998, Cara uji minyak dan iemak, butir 8

5.5

Asam

Butlrat

Sesua; cara rrji kandr-rngan asam butilat dalam leinak (Lampiran A)

5-G

Vitarnin

A

Sesuai

cara ui!vitar,lin A. (lampiran B)

5.7

Vitamin

D

SesuaiCara

UjiVitamin

D (Lamoiran C)

6.8

Cara uji cemaran logam

6.8.i

Timbal

(Pb)

Sesuai SNI 01

-

2896

-

1998, Cara ujiceinaran logam dalam makanan

6.8-2

Timah

_{Sn}

Sesuai SNI 01 - 2896

-

1998, Cara ujicemaran logam dalam makanan

6.8.3

Raksa

(Hg)

Sesuai SNI 01

_-

2896

-

1998, Cara uji cemaran logam dalam mak

6.9

Cemaran Arsen

(As)

Sesuai SNI

01

_-

4866 -

1998, Cara

uji

cemaran arsen dalam makanan

6.10

Cemaran Mikroba

t

Higiene

ffimduk yang bertanda SNI ini, harus dipersiapkan/diproses dan penanganannya mengacu

mmria

pssturan

Depademen Kesehaian Rl yang berlaku tentang Pedsman Cara Produksi

gmq

Baik uniuk

Makinan

t

Pengemasan

ililwgarin

dikemas

dalam wadah

yang

tertutup rapat.

Kemasan

tidak

dipengaruhi atau nnelnpengaruhi isi, sehingga pi'oduk tetap baik selama penyimpanan dan pengangkutan.

I

Syarat nenandaan

9-1

Labei

Prcduk _{harus dilabel sesuai PP No. 69/1999} tentang label dan iklan pangan,

9-2

Cara pernberian

nama

Elila

suatu

produk marga;'in ditujukair untuk penggunaan khusus

dan

atau

mempunyai

karakteristik

yang spesifik,

rnaka

kata yang

menggambarkan keterangan oenggunaan

atau

karaktei'istik tersebut

dapat

dijadikan

kata

keterangan

dan

diletakkan

di

belakang

kafa rnarga.in.

CONTCH

:

llagarin

kue adalah margarin yang digurrakan untuk membuat kue.

Margarin biskuii adalah margadn untuk

'nernbuat biscurt.

Margarin pastry (lipat) adalah margarin yang digunakan untuk membuat pastry.

"

Margarin dapur adalah margarin untuk rnasak Margarin oles adalah margarin untuk dioies.

Lampiran

A

(normatif)

Cara

uji

kandungan asarn butirat dalam lemak

4.1

Definisi

Asam

butirat

dapat

digunakan untuk mengidentifikasi adanya lemak

susu dalam

suatu produk lemak.

4.2

Ruang

lingkup

Metcde

ini

dapat dipakai

untuk rnenentukan kandungan lemak

susu

dalam margarine,

yang

jumlahnva dinyatakan sebagai

persentasi

asanr buiirat

dalam

komposisi

asam len:ak dari suatu p;-ocuk.

A.3

Peralatan

Kromatografi gas dengan FID Detektor dan integrator elektronik

Kolom : Chromosorb

W,

panjang 2 m dan Ciameter dalam 3 mm, glass . Syringe

1

pl (

5

pl atau 1C _{prl ).}

Gelas piala 50 ml.

Tabung reaksi 10 ini bertutup asah. Pipet ukur 2

ml

sampai 5 ml. Kedas saring.

butiran-butiran kaca. Kaca arloji.

Penangas air.

4.4

Bahan pereaksi / kimia

Aq uadest untuk kromatografi.

Air yang digunakan untuk analisa adalah air kromatografi. KOH 0,5 N dalam etanol.

Larutan asam orthophosphat 5% b/v dalam air.

Larutan standar asarn n

_-

butirat : 0,4 mg

/ mldalam

air.

4.5

Kondisi

operas! kron-ratografi gas

-.cndisikan kolom sebelum dipakai pada suhu 180

"C

seiama nrinimum 43 jam

3.lhu lnjektor

Sunu Detektor Suhu Oven

,'.aktu rambat (Retention

tlme)

: kurang

lebih

5 menit

Gas pembawa (Carrier gas) Helium, Nitrogen, dengan kemurnian 99 95%

4.6

Cara kerja

A.5.i

ri-:--;ak=i!=ra=i

A.6.f

.1

Buat

larutan

deret siandar

dalam

tabung reaksi

yang

mengandung O,0B mg;

J 2 nrg; 0,+ nrg; 0,8 mg, 1,4 mg dan 2,0 mg asam butirat dan 0,5 rng asam valerat dengan cara sebagai

beiikut:

li4asukkan ke daiam masing-masing tabung reaksi . C,2

nrl,0,5

ml;

i,(J

_mi

_{2,0 ml; 3,5 ml dan 5,0 nri}

_{larutan standar}

_{asam butirat,}

_{kemudran tambahkan}

iarutan asam valerat

ke

Calam rnasing-rnasing tabung reaksi tersebut sebanyak

2,0

mt,

seteiah

itu

tambahkan

air

secara

bei-urutan

4.8

m!; .1,5

_ml;

_{4,0 ml;}

_3,0

_ml;

_{1,5 ml}

_dan

0 mi air.

Tr.rtup tabung reaksi dan kocok sampat larutan tercampur rata.

A.6.1.2

Stabilkan kolurn KG sekur'ang-kui-angrrya 30 menit pada suhu analisa

A.6.'t.3

lnleksikan secara

bergi!iran

1

p!

lar-utan

standar yang telah

dipersiapkan

(butir- _A.6.1.1)

A.6

1.4

Ukurtinggi

puncak kromatogram (peak) asanr butirai dan asam I'alerat dengan ketelitian 0,5 rnm

A.6.1=5.

Hiiung rasio

tinggi

puncak (asam butir-at

/

asam valerat) untuk setiap stanoar

dan

buat kurva hubungan antara ratio tinggi

puncak

dengan berat asam butirat

_;-ang

terkait.

4.6.2

Penetapan

kandungan asam butirat

4.6.2.1

Timbang

contoh

dengan

teliti

kurang

lebih 100 mg ke dalam

piala

gelas

tambahkan

3

nrl

larutan KOH

0,5

N dalam ethanol dan beber-apa butir batu didih- Tutup

gelas

piala

dengan

kaca

arloji dan letakkan dalam penangas air

yang

mendidih

kira-kira 10 menit atau

sampaitioak

kelihatan lagi butiran lemak di permukaan

Angkat kaca arloji dan lanjutkan pemanasan sampai seluruh

etanol

menguap

Angkat gelas piala dan diamkan sampaiciingin.

4.6.2.2

Tambahkan 5 ml air

.1750C.

.25

_-

50 oC di atas suhu anaiisa

A.6.2.3

Tutup

ciengan

kaca arloji dan

goyangkan peilahan-lalran

_sampai

sernua sabunnya larut (dapat dibantu dengan pemanasan).

4.6-2.4

Tambahkan

larutan asam

orthophosphat

5,0

m!,

goyangkan

sedikit

untuk

mengengkoagulasi asarn le-rnak yang mengendap.

A.6-2.5

Saring dengan kertas saring lipat

A.6-2.6

Ambil

dan

pindahkan

filtrat

sebanyak

5,0 ml ke

dalam tabung reaksi

dan

tambahkan

ke

dalamnya

2,0 ml

larutan standar internal asam

valerat.Tutup

dan honrogenkan .

A.6.2.7

Stabilkan koiom kurang lebih 30 menit pada suhu analisa.

A.6.2.8

lnjeksikan

1

pl larutan contoh

tadike

dalam KG.

4.7

Perhitungan

Hitung rasio tinggi puncak kromatogi'am asam butirat

/

asam valerat yang diperoleh dari analia contoh dan hitung kanciungan asam butirat berdasarkan kurva standar yang didapai

Kaitdungan asarn hutirat dinyatakan seoagai persentasi (b/v) sebagai berikut :

W (b) x 100

w

(s)

dengan pengertian :

w

(b)

adalah

ber'al

asam

butlrat (mg) yang drbaca dari kurva standar

W

(s)

adalahberat contoh (mg)

A.8

Referensi

Lampiran

B

-

(

normatif

)

Cara uji vitamin A

8.1

Prinsip.

Lemak

atau

margarin dilarutkan

dalam

isopropanol

/

chloroform

dan

di

analisa dengan

khromatogi-afi

kinerja

tinggi

(HPLC)

menggunakan

detektor

UV. Peak

vang

dioeroieh untuk,vitamin A asetat dihitung dengan membandingkannya dengan standar eksternal.

8.2

Pereaksi

Pereaksi yang digunakan harus yang berkualitas atau HPLC grade (lihat butir B.Ba) :

Propanol-

2 (lso propanol) Chloroform

f\letanol

Standar vitamin A asetat yang kepekatannya diketahui (lihat butir B. Bb).

8.3

Peraiatan

Geias

piala

25 rn!

Labu ukur 25 mi, 100 ml

Seperangkat HPLC

Seperangkat alat penyaring, sepe:'ti

:

Miilex SR, penangas

air.

oven dengan thermostat,

neraca dan lain

_-

larn.

8.4

Kondisi

HPI-C Kolom Detektor Panjang gelombang Kepekaan detektor Campuran solven Solven 'i HPLC eluen

Kecepatan alir eluen Volume injeksi

Li chrosorb RP 18,5 um, 150 x 4,6 mm kolom baja (lihat butir 8 c)

UV

-?25 mm

0,02 AUFS (lihat butir B f) lihat butir 8 a Proponal-2 : chloroform 85 contoh) metanol : chloroform 97,5 , vitamin A) 1,0 ml

/

menit 20 pl : 15 (untuk melarutkan 2,5 (untuk standar

8.5

Kalibrasi

standar

Siapkan

larutan

stock 10 mg

vitamin

A

asetat

dalam 100

ml

propanol-2

yang

sudah

dihilangkan gasnya (lihat butir B.Ba), sebaiknya dengan mengencerkan dari larutan yang

tebih

plkat

_fnris

-100

mg

/

50

mg).

Sebelum dianalisis, encerkan

1 ml

larutan stock ke

dalam

100

rni solvent

1

(propanol-2: Chloroform

=

85:15). Gunakan

iarutan ini

untuk

mengkalibrasi HPLC (lihat butir B.B b).

8.6

Cara kerja

a.

Persiapan contoh

Tiinbang

clengan

telrti

1

.5

-

2

0

g

contoh

ke

dalam piala

25

ml-

Tambahkan

+l

sebelum diinjeksikan ke dalam HPLC (lilrat buttr B'B

e)'

:

b.

Pencucian

/

ReconCition

&

Cucilah kolom dengan alat HPLC dengan memompa eluen yang seSuai untuk kira-kira 1-2 jam sebelum airalisis. Pada selang waktu ter-tentu, injeksikan larutan pengkalibrasi untuk meyakinkan bahwa retensi w;rktunya stabil dan hasilnya jelas terlihat.

c

Kalibrasi

Buatlah kuiva kalibrasi Cengan cara yang biasa

ci.

Analisis

tnjek.20 ql tarutan contoh. Uku:' area peak zat yang ciitetapkan Catam ccntoh. Untuk

"",rpurrrl

induk dan larutan konsentrat yang iain, larutan contoh harus dienceirkan '

dengan sesuai sebelum dianalisis. Disarankan uniuk mencuci kolcm

iIPLC

dengan mempercepat kecepatan alir antara injeksi ccntoh'

B.7

Perhi'rungan

Faktcr kalibrasi

!-uas

puncak

As

F_

Jilmlah

Ms

Perhitungan kandungan vitamin A asetat

AAMs

C- ---

x

D=

x

--- x

D

FWASW

Dengan pengertian :

F

adalah faktor kalibrasi

As

adalah

merupakan peak area dari standar yang sesuai dalam kromatogram kalibrasi (lihat butir

B

Bg)

Ms

adalah

jumlah standar yang diinjeksikan (lihat butir

B

B g)

C

acjalah kandungan vitamin A asetat dalam contoh (lihat butir

B

B g)

A

adalah

merupakan luas puncak vitamin A asetat dalam kromatogram

U A

adalah

kandungan vitamin A asetat dalarn conioh (lihat buiir B. 8 g)

adalah

merupakan luas puncak vitamin A asetai cialam kromatogram contoh (lihat butir B. B g)

adalah

bobot contoh dalam gram adalah faktor pengenceran

8.8

Catatan

Semua solven

dan

campuran solven sebelum digunakan harus diitilangkan gasnya,

untuk menghindari kehilangan vitamin A dan menjarnin kelayakan kemarnpuan pompa HPLC. Cara menghiiangkan gas daoat dilakukan seperti dijelaskan dalam manual alat

HPLC

atau

dengan

menrupkan

helium

melalui solven,

atau dengan

memanaskan

sebentar

di

bawah titik didih dengan reflux kondeser. Solven harus transparan dalam

UV pada 325 n'tr.

Jika

konsentr-asi standar vitamin

A

yang digunakan tidak diketahui, standar tersebut harus ditetapkan derrgan UV spektrofotcmetri, dan kemurniannya Cicek dengan HPLC (hanya satu peak harus diperoleh pada 325 nrn ketika menggunakan cara reverseC

-phase HPLC).

c.

Umunrnya

koiom

C18

reversed phase

akan bekerja dengan baik.

Tapi

perlu

penyesuaian ratio campuran

eluen

HPLC (metano!

:

.;hloroforrn)

_untuk

_nrempercieh

peak yang oapat digunakan.

d.

Pernanasan sebentar pada penanggas aii-, mengocok deirgan pengaduk,

jika

perlu

pemanasan harus minimal darr larutan hanya hangat (+/- 30 "C).

f

Untuk menyaring, gunakan peralatan penyaring biasa

yang cocok untuk

menyaring

yang padikelnya Ci

atas

1

pm. Sebagai alternatif, dapat digunakan Milex Sr 0,5 um

(tekan

1-2

ml

larutan conioh melalui penyaring memakai syringe

2

ml,

buang 2C0

-500 rnl pertama, injek larutan saringan yang berikutnya).

Harus

digunakan

variable, panjang

gelcnrt-rang

detektor

UV

yang

sensitif,

memberikan signat yang

baik uniuk

noise rasio pada 0,02

av

a.u.f.s

(a.u.f.s.

₌

unit

serapan pada skala penuh). Berapa model yang l<uno mungkin tidak cukup sensitif.

Luas purlcak dan jumlah

vitarlin

dapat diukur atau dihitung

dalam

unit yang,sesuar,

misalnya peak area dalam

mm',

cmt, uv detik atau pembacaan planmeter dan;umlah

dalam

pg ester

vitamin

A

bebas atau

dalam

internasionai

unit

(lU).

Buatlah bahwa unit-unit yang sama diqunakan melalui prosedur untuk kalibrasi dan analisis.

W D a. ,ati; b e. g

Lampiran

C

(ncrmatif)

Cara

uji vitamin

D

C.1

Prinsip

Penyabunan contoh

pada suhu

ruang

dan

recovery

fraksi

kandungan

vitamin

D

dari

bahan yang

tidak tersabunkan

menggunakan

teknik

RP.

Pemisahan

penyerapan kromatografi fraksi ini untuk penetapan kualitatif dan kwantitatif vitamin D. ldentifikasinya drbuat dengan membanCingkan retensi waktu relatif dengan standar.

C.2

Pei'eaksi dan baha;-i-banaii

a.

Vitanrin

D3

(ergocalciferol 50-14-6)

atau

vitamin

D3

(67-97-0).

Harus

digunakan standar yang murni dengarr diketahui jumlahnya.

Peritatian'.

Ergocalcifrel (vitamin

D2) dan

vitamin D3 adalan sangat be;-acurr bila dhisap,

kena

k'.rlit

atau

ditelan.

Ada

kernr-rrlg(lnan akibar pengaruhnya.

Jika

mer3sa kurang

enak

baCan. temullah dokter (tunjukkan labelnya jika mungkin): Pakai pakaian petindung yang sesuai, sarung tangan Can pelindung mata / muka iangan menghisap debtr.

b. Pl,rogallol i87-e5-1)

Perhatian : Pyrogallol berbahaya bila _{dihisap, mengenai kulit dan iika ditelan}

c. Etanoi 96%

d. Larutan KOH jenuh

e. Metanol untt-rk chrcmatografi

f.

Dietii eter, bebas percksida

g

1 _,4

-

dioxane, uniuk kh;ornatografi

h. n-heksana, untuk khromatografi i. Nitrogen 99,99%

;.

ilatrium suifat, bebas air

k. Alumunium Foil

l.

Eluen

1.

Air dalam metanol Q = 8 ml / I

C.3

Peralatan

a.

Neraca analitik.

b.

Erlenmeyer berwarna coklat 200 ml.

c.

Gelas ukui- 10 ml, 5C ml, 250 ml dan 500 nil.

d.

Corong pemisah

i

labu kocok berwarna coklat 250 ml.

e.

rabu

berdasar bulat coklat 250 ml.

f.

Ccrong 0,8 cm.

g.

Rotai-y evaporator.

h.

Flutecj filter, watei- repellent

: n^- _{a -,-,1 '-..-,r; -,,^,-; n ?.J.---} L^-^^- _^^--L!'L..-^

i

i-'enyaiing vacuiil

iiiieio z iiii,

iJUii-iiuiiu.i

L;er-,Ee:

_]eiiang

pengniiDiinE

j.

Labu berbentuk lancip coklat 10 ml, ciengan sambungan bawah.

k.

Labu ukur coklat 1 rr,l, 2 ml, 5 mi dan 100 ml.

l.

Kombirrasi seperangkat i-IPLC dengan detector UV

m.

Rekorder

/

alat pencatat.

n.

Sis'rem integrator'.

o.

Kolcrn RP-18,5

_!m,

250mnr x 4,5 mm Cengan 2 cm pre kolorn RP-13.

p

Kolom . Si 60,5 um,125 mm x 4.5 n-im.

q.

Feeding system 100 pi

_-

2000 pl .

i

I

r.

Mesin pengccok atau nragnetic stirrer

s.

Alat pendingin untuk +/- 0 oC

t.

Porrrpa vacu;'n

u.

lripet ukur 5 ml

v

Syi-inges '10 Ut

-

2000 pl atar-r autosampler

C.4

Cara Kerja

Timbang dengan ketelitian 1 mg 109 -15 g contoh ke dalam labu 200 ml

Tanibah 50 ml etanol, 100 pyrogallol dan 20 ml larutan KOH jenuh

Kocok atau aduk campuran tersebut di atas dengan kuat di bawah tekanan N2 pada 25 oC

-

30 oC selama 30 menit

Pindahkan ke dalam labu kocok 500 ml dan dibilas dengan 150

ml

airdan 150

ml dietil

eter lalu kocok dengan kuat

Eksti-ak lapisan airnya dua kali dengan masing-masing 100 ml dietil eter

CATATAN

Air oencucinya harus betul-betu! sarnpai netral

Tanrbah

5

g

natrium sulfat dan larutan eter ke dalam rvater-repellent filter dan saring ke

dalam labu berdasar bulat 250 ml

Bilas labu kocok dengan sedikit dietil eter

Uapkan solven dengan rotary

evaporator

pada maks.

40

oC

di

baw'ah

tekanan

yang

dikurangi (pcmpa uap air).

Tambah residu tersebut

dengan

10

ml

metanol, biarkan

pada

0

oC

dan saring

clenga;t

vacum

mikro.

Buang residu saringannya.

Masukkan saringan

ke

dalam

iabu lancip 10

ml dan

uapkan dengan rotary evapoi-ator

sampai kira-kira tersisa 1 ml

Pindahkan ke dalam labu 2 ml dan impitkan dengan metanol.

cA-iAlAi.j

,;:ka t--r;adr !,..i.ierui:al .,,anc _{mcnia;;t"3x 6epain:/a .oengeniapan, g'-riiakarr iar'uiarr}

'

yang jernih untuk diinjeksikan ke HP'*C.

'1.

-C.5

Pemisahan bahan yang trdak tersabunkail dengan cara

tehirik

:'eversing

phase.

Penetapan fraksi vitarnin [.r

Timbang

50

rn!

vit.'D

ke

dalani labir ukur 100

ml,

larutan dalam metanol pada

suhu kamar dan irnpitkan sampai garis tancia dengan nretanol.

Encerkan

+l-

100 rn! larutan

(a) ke

Caiarn

labu ukur 100 rnl dan

diimpitkan

dengan metanol.

Kondisikan kolom RP 18 Cerrgan pre-kolom menggunakan eluen

icjan

kecepatan aiirnya

2

ml

t

rnenit sampai

menciapatkan

garis

lurus

yairg stabil pada

panjang

gelombang 265 nm.

Aiirkan 1000 ml larutan (b) ke dalam kclcm RP r 8 da:r pre kolorn yang sr.rdah dikondisikan

mengguirakan eluen I dengan kecepatan alir 2 ml/rnenit. ,r I i.

qn

Tetapkan

waktu

retensi

dari

awal

sampai

akhir dari aiiran vitamin

D.

Tentukan waktu

antara permulaan aliran "- 1 menit" dan akhir aliran "+ menit" sebagai fraksi window.

C.6

Recovery

fraksi vitamin

D

a.

ln.iek 1C00

ml

larutan

(e)

ke,Jalanr

kclom

F.P

18

dengan

pre

kolom

yang

st:dah

dikondisikan dan alirkan eluen I dengan kecepatan alir 2 ml

/

menit.

b.

Kumpulkan fi'aksi vit. D (C.5e) yang dialirkan di antara fraksi windov'r dalam labu lancip 10 ml.

CATATAN

Fraksi vit. D yang dikumpulkan harus melewati detector ultra violet, ini dapat diperoleh dengan menghalangi penutup atau klep corresponding pilot

c.

Uap'<an

fraksi

(b) dengan sempurna

di

bawah tekanan yang Cikurangi

dalam

rotary eva'roratoi- pacia maksimunr 40 oC.

c

a--i":-

':sl.r-r

dengan kira-kira '1 _{ml eluen}

₂

_{dan ciinciing iabu dibilas}

_dengan

hati-; ^'

c-e

F

-,::-. e-

anlar

Cengan ada sebagian yang menganciung oartikel padat dalam i C00

ii

S_, -

-;:

tre._lan dipasang penyaring mikro yang

berpo.i-pori

0,45. Gunakan larutan

sa--

ja-

::rcebut

untuk penetapan secara kuantitatif

(butirC.

Ba). ir4asukkan larutan

sal-,1:-

:

aias ke dalam labu

ukur

2

ml

dan

impiikan clengan

eluen 2-

Gunakan

lar:a-

-

seiiac kaii sebanyak 200 ml.

C.7

Merrlbuat

grafik

kalibrasi

;

a. Ti-:=-_

Cengan

keielitian

1 mg,

i00

mg vit. D ke dalam labu ukur

100

ml

dan \zi:t,'-^'?- _{-='r.')Ai'i eluen}

₂

_{lmoitkan samoai garis tanda dengan eluen 2.}

b

Pice:

i

n': leru*tan

a

ke dalam laou ukur 100 mi cian

impitran

dengan eiuen

2

sai-npai

th

v

_{ca.is ianca}

c.

Pice:5

-nl larutan h ke Calam labu ukur 100 rnldan impitkan dcngan cluerr2.

d

lnj:<:ebanyar< 10

plsarnpai

100 pii ia'utan c untuk menrbtrat grafik kalibrasi ke dalam

aia: HPLC

CATA

tAN

t0

ul larutan c mengandung 25 mg

vit

D.

e.

Alirka;r laruian

c ke

cialam

fraksi

F.oiom dengan eluen

2

pada

kecepatart

aiir'1,2

nrl

/

ni:nit.

DeteKsi ultr-a violet pada 265 nrn.

f.

Plot grafik

kaiibiasi dengan

rneirggambark.ar,

tanda{a;rda

waktu

detektor

sebagai

jumlah vitamin D yang diinjerkan.

C.8

Penetapan

v;tamin

D

secara kuantitatif dan

kualitatif

?.

Gunakan fraksi yang dipercieh pada (C.6c) unttrk peneiapan vitamin D. Untuk injeksi pada saat pengujian awal, pilinlan vclunre )/ang penetapan vitarnin D secara kuaniitatif

cjapat dilakukan sesuai grafik kaltbrasi.

b.

Pemisah kondisi-kondisi

fraksivitamin

D kerjakan seperti C.7e.

C.9

Perhitungan

a.

Penetapan kualitatif

Rrnrlinnk:n

luaktrr

retensi

khr"omatoot'afi _{-..j-..Y-.i"".'J}vano diner-oleh

sesuai C.8b

elenqan \.'anQ

ditetapkan pada

waktu plot grafik

kalibrasi untuk

vit. D dan

incientifikasi

vit. D

dalam

khromatogram.

b.

Penetapan kuantitatif

Kandungan vitamin

D

(M), dihitung dalam unit

per'100 gram

margarin,

di

mana satu unit vitamin D. Sesuai dengan 25 mg vitamin D dengan rumus :

,?a

Mt.10c.vt.v3 l/t

-Mo. F.V2.V4 Cengan pengertian :

Mo

adalah

bobot contoh dalam gram;

Ml

adalah bobot vitamin _{D yang di dapat dari grafik kaiibrasi dalam monogram;}

v1

adalah

volume larutan

contoh

yang ciiukur (butir 4a) unruk pemisahan

RP-phase dalam mikroliter;

V2

adalah volume

yang

diinjeksikan untuk

pemisah

RP-phase

(butir 6a)

dalam mikroliter;

V3

adalah

volurie

larutan contoh yang rjiukui- uniuk khomatografi (buiir C.Ba) dalam

mikroliter,

V4

adalah volume larutan conioh (yanE Ciukur) yang pada khomatografi (butir C.Ba);

F

acalah Faktor ko;':versi dari _{monogranrs vitamin D ke dalam units 25;}

Jika ada

keragr-r-raguart

plci

vitarnin

D

pada _{fr-axsi vitamin}

_{D yang}

_{diperoleh sesuai}

butir C.6c dan khiornatograr.r- berikutni,a di _{bawah ini kondisl -vani}

_{Oiietaikrn p"O"}

_Urti,

c.6b

CATATAN

_{Untuk penetapan vitamin}

_D

_{khromatogram yang diperoleh secara rutin}

untuk margarrn yang diketahui dapai digr.rnakan sebagai acuan.