MODUL PRAKTIKUM
TEKNOLOGI KULTUR JARINGAN
OLEH:
RINDANG DWIYANI HESTIN YUSWANTI DEWA NYOMAN NYANA
GEDE WIJANA
PRODI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS UDAYANA SEMESTER GANJIL 2017/2018
PRAKATA
Puji syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Kuasa atas tersusunnya Modul Petunjuk Praktikum untuk mata kuliah Teknik Kultur Jaringan Tanaman , mata kuliah pilihan yang diberikan di Jurusan Agroekoteknologi, Fakultas Pertanian Universitas Udayana.
Mata kuliah Teknik Kultur Jaringan memberikan teori sekaligus memberikan kesempatan kepada mahasiswa untuk menerapkan teori tersebut dalam praktek, sehingga setelah menyelesaikan mata kuliah ini dalam satu semester, akan terpenuhi capaian pembelajaran yaitu mahasiswa memiliki kompetensi dalam perbanyakan tanaman melalui kultur in vitro, yang nantinya dapat diterapkan dalam kehidupan di masyarakat . Modul praktikum membahas secara rinci dari pengenalan alat hingga praktek perbanyakan. Komoditi yang digunakan dapat disesuaikan dengan kebutuhan, namun prinsip dasar kultur sama, yakni menjaga sterilitas karena kondisi steril merupakan syarat keberhasilan dalam pekerjaan kultur jaringan.
Tentunya tulisan ini masih jauh dari sempurna, kritik dan saran kami harapkan untuk penyempurnaan tulisan ini. Tak lupa kami ucapkan terimakasih kepada semua pihak yang membantu penulisan, layout hingga terjilidnya tulisan ini.
Denpasar, 1 September 2017 Penulis
DAFTAR ISI
PRAKATA ... ii
DAFTAR ISI ... iii
DAFTAR GAMBAR ... iv
TOPIK 1. PERALATAN KULTUR JARINGAN ... 1
TOPIK 2. STERILISASI ALAT DENGAN AUTOKLAF ... 15
TOPIK 3. PEMBUATAN MEDIA KULTUR ... 18
TOPIK 4. PERSILANGAN ANGGREK... 26
TOPIK 5. KULTUR BIJI ANGGREK ... 29
TOPIK 6. SUBKULTUR ... 33
TOPIK 7. KULTUR ORGAN TANAMAN ANGGUR (Vitis vinifera L.) ... 36
TOPIK 8. KULTUR TANGKAI BUNGA ANGGREK PHALAENOPSIS ... 40
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Autoklaf yang menggunakan daya kompor (A); dan
daya listrik (B) ... 2
Gambar 2. Timbangan (balance)... 5
Gambar 3. Magnetic stirrer ... 7
Gambar 4. Oven ... 8
Gambar 5. Meja Kerja Steril; Enkas (A) dan Laminar (B) ... 11
Gambar 6. Rak Kultur ... 12
Gambar 7. Persilangan pada Tanaman Anggrek ... 27
Gambar 8. Buah hasil persilangan; Anggrek Phalaenopsis amabilis (A) dan Vanda tricolor (B) ... 30
Gambar 9. Penaburan biji anggrek secara in vitro ... 32
TOPIK 1. PERALATAN KULTUR JARINGAN
Tujuan
Memperkenalkan kepada mahasiswa alat-alat standar yang digunakan pada Laboratorium kultur jaringan tanaman.
Dasar Teori
Kultur jaringan tanaman atau yang dikenal dengan nama kultur in- vitro adalah suatu teknik untuk menumbuhkan sel, jaringan atau organ tanaman pada media buatan yang mengandung hara secara aseptik di laboratorium.
Kondisi aseptik ini merupakan syarat mutlak agar pekerjaan kultur dapat berjalan dengan baik dan berhasil. Untuk itu maka diperlukan alat-alat khusus untuk mendukung kondisi aseptik tersebut. Peralatan dalam kultur jaringan digunakan untuk melaksanakan pekerjaan kultur jaringan, dari sterilisasi, penanaman dan inkubasi kultur. Beberapa diantaranya, yang penting dan wajib dimiliki oleh setiap laboratorium kultur jaringan adalah : autoklaf, timbangan (balance), magnetic stirrer, meja kerja steril, shaker dan rak kultur.
1. Autoklaf (Autoclaves) Deskripsi
Autoklaf adalah alat untuk sterilisasi dengan metode uap panas (steam heating). Ada dua jenis jika dilihat dari daya yang digunakan. Yang pertama adalah autoklaf yang menggunakan
kompor dan yang kedua adalah autoklaf yang menggunakan daya listrik (Gambar 1). Keduanya memiliki cara kerja yang sama dalam proses sterilisasi.
Gambar 1. Autoklaf yang menggunakan daya kompor (A); dan daya listrik (B)
(Foto: Dokumentasi Pribadi)
Cara Kerja
Autoklaf dilengkapi dengan “sarangan” seperti pada dandang untuk mengukus. Pada sarangan ini diletakkan benda yang akan disteril. Sementara pada dandang (dibawah sarangan) diisi dengan air untuk menghasilkan uap, mirip seperti dandang pengukus.
Autoklaf mensterilisasi dengan metode steam heating (pemanasan dengan uap). Pertama alat/bahan yang akan disterilisasi dibungkus dengan kertas atau plastik yang tahan
panas. Selanjutnya alat/bahan tersebut diletakkan dalam sarangan (panci autoklaf), sementara di bawah sarangan diberi air, kemudian tutup autoklaf ditutup rapat, katup dibiarkan terbuka dan dihubungkan dengan sumber tenaga. Autoklaf kompor dipanaskan diatas kompor, yang dengan listrik dihubungkan dengan sumber listrik. Setelah beberapa lama, uap akan keluar dari katup, sebagai penanda bahwa air didalamnya sudah panas dan mendidih. Pada saat itu, maka katup ditutup agar tekanan dan suhu di dalam autoklaf dapat naik dengan cepat. Suhu akan naik sekitar 121oC dan tekanan 17.5 Psi. Kondisi ini dipertahankan sesuai waktu yang dibutuhkan untuk sterilisasi, misalnya untuk sterilisasi media diperlukan 30 menit, sedangkan untuk sterilisasi alat membutuhkan waktu 60 menit. Dalam kurun waktu itu, uap panas di dalam autoklaf akan memanaskan dan mematikan mikroorganisme yang ada. Setelah mencapai waktu yang dibutuhkan, autoklaf dilepaskan dari sumber tenaga (kompor/listrik). Selanjutnya katup dibuka secara perlahan, agar suhu turun secara perlahan pula. Tutup autoklaf boleh dibuka jika suhu/tekanan sudah mencapai nol. Selanjutnya, alat/bahan didalamnya dapat dikeluarkan secara hati-hati. Perlu diperhatikan bahwa pembukaan tutup autoklaf yang dilakukan sebelum suhu/tekanan mencapai nol dapat menyebabkan air meluap keluar dan sangat berbahaya bagi pengguna.
Perlu diperhatikan, senyawa yang bersifat themo sensitive atau rusak karena proses pemanasan dengan autoklaf seperti zat
pengatur tumbuh dan antibiotik. Senyawa tipe ini ditambahkan pada media setelah proses autoklafing selesai namun sebelum media mengental. Senyawa-senyawa tersebut harus disteril terlebih dahulu dengan proses filtering menggunakan filter
syringe.
2. Timbangan (Balance) Deskripsi
Timbangan (balance) beragam jenisnya, namun yang sering digunakan adalah timbangan digital. Fungsinya secara umum adalah untuk menghitung satuan massa suatu benda dengan teknik digital (Gambar 2). Dalam lab kultur, alat ini digunakan untuk menimbang bahan/zat yang digunakan dalam kultur, misalnya zat pengatur tumbuh, bahan untuk media, gula, agar, dan lain sebagainya.
Sebelum menimbang, spesifikasi timbangan yang akan digunakan harus diperhatikan terlebih dahulu. Misalnya, maksimum batas timbang, maksimum digit desimal dalam dalam penimbangan serta letak tombol-tombol yang diperlukan. Umumnya, setiap timbangan memiliki tombol “zero” yaitu tombol untuk menjadikan angka bergerak ke arah nol secara digital.
Gambar 2. Timbangan (balance) (Foto: Dokumentasi Pribadi)
Cara Kerja
Secara umum, cara penggunaan timbangan adalah sebagai berikut. Hubungkan timbangan dengan sumber listrik. Tekan tombol “on” untuk menyalakan timbangan. Nolkan terlebih dahulu timbangan sebelum digunakan dengan jalan menekan tombol “zero”. Selanjutnya letakkan alas timbang (misalnya wadah plastik, kertas atau aluminium foil) yang akan diletakkan zat/senyawa di atasnya. Setelah itu tekan kembali tombol “zero” kembali agar angka pada timbangan menunjukkan angka nol kembali. Setelah itu letakkan senyawa/zat yang akan ditimbang dan catat angka pada timbangan. Setelah digunakan timbangan harus dibersihkan kembali dan disimpan/diletakkan dalam kondisi tidak terhubung dengan sumber listrik.
3. Magnetic Stirrer Deskripsi
Magnetic stirrer digunakan untuk proses pembuatan media, yaitu untuk pemanasan (heating) dan pengadukan (stirring) (Gambar 3). Dengan fungsi tersebut maka alat ini dilengkapi dengan dua tombol putar, yakni tombol “stirrer” (pengaduk) dan tombol “heat” (untuk pemanasan). Magnetic stirrer dilengkapi dengan magnet pengaduk yang berputar dalam wadah (gelas ukur, dsb yang ditaruh diatas magnetic stirrer) jika tombol “stirrer” diputar ke kanan. Kecepatan magnet berputar dapat diatur sesuai skala (nomor) yang tertera, semakin besar skala, semakin cepat magnet berputar.
Dalam pembuatan media proses pengadukan sangat diperlukan untuk membuat media menjadi homogen. Selain tombol “stirrer”, juga ada tombol “heating”, yaitu tombol yang berfungsi untuk memanaskan. Jika tombol “heating” diputar ke kanan, maka suhu larutan/senyawa dalam wahah meningkat. Seperti halnya tombol “stirrer”, tombol “heating” juga dilengkapi dengan skala, yang semakin tinggi suhunya jika skala nomor semakin besar. Pemanasan larutan media kultur diperlukan hingga suhu mencapai kurang lebih 80oC.
Gambar 3. Magnetic stirrer (Foto: Dokumentasi Pribadi)
Cara Kerja
Sebelum digunakan, dipastikan dulu bahwa alat dapat berfungsi dengan baik. Jika untuk pembuatan media, cara kerjanya adalah sebagai berikut. Magnetic stirrer dihubungkan dengan sumber listrik. Wadah berisi sedikit air ditaruh diatas magnetic. Bahan-bahan media dimasukkan satu persatu sambil mengaktifkan tombol stirrer sehingga bahan tersebut dapat larut. Setelah senyawa semua larut, magnet diambil (stirrer dimatikan pada saat pengambilan magnet). Setelah itu ditambahkan aquades sampai mencapai volume media yang diinginkan, kemudian pH diukur dan disesuaikan menjadi 5.6-5.8 dengan jalan menambahkan beberapa tetes NaOH 1M (jika pH rendah) atau HCl 1M (jika pH tinggi). Terakhir ditambahkan pemadat dan tombol “heating” diaktifkan untuk pemanasan media hingga
mencapai 80oC. Setelah itu,media dituang dalam botol-botol kultur, ditutup rapat, kemudian diautoklaf.
4. Oven Deskripsi
Khususnya untuk laboratorium kultur jaringan, oven digunakan sebagai alat untuk sterilisasi. Sterilisasi dengan oven hanya bisa untuk alat-alat kecil dan glasswares dan tidak bisa untuk sterilisasi media. Di dalam laboratorium, oven diletakkan di ruang preparasi. Metode sterilisasi dengan oven dikenal dengan dry heating, karena proses sterilisasi menggunakan udara kering yang panas. Ada banyak ragam oven, namun satu diantaranya dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Oven (Foto: Dokumentasi Pribadi)
Cara Kerja
Semua alat atau glasswares yang akan disterilisasi dibungkus dengan kertas atau aluminium foil, selanjutnya dimasukkan ke dalam oven. Oven ini menggunakan daya listrik, dilengkapi dengan pengatur suhu dan waktu, sehingga proses sterilisasi bisa dilakukan dengan menekan tombol sesuai dengan kebutuhan. Angka yang menunjukkan suhu dan waktu pengovenan akan terbaca secara digital. Setelah selesai proses pengovenan, hendaknya oven dibersihkan dan tersimpan dalam keadaan tidak terkoneksi dengan listrik.
5. Meja Kerja (Enkas; Laminar) Deskripsi
Meja kerja steril digunakan dalam penanaman (inkubasi) kultur. Ada dua jenis, yang bersifat konvensional disebut enkas (Gambar 5 A), sedangkan yang lebih modern adalah laminar (Gambar 5 B). Enkas tidak menggunakan sumber listrik, kecuali lampu neon yang menempel pada kaca enkas untuk penerang. Enkas terbuat dari bahan kaca dan kayu dengan dua lubang di bagian depan seukuran tangan pekerja. Lubang ini disertai tutup untuk mencegah kontaminasi. Laminar menggunakan sumber listrik, terbuat dari bahan logam dan kaca. Laminar dilengkapi dengan tombol “power‟ untuk mengaktifkan laminar, tombol “UV” untuk ultra violet, tombol “lamp” untuk lampu serta tombol “fan” untuk menyalakan kipas / blower.
Cara Kerja
Bagian dalam enkas dan laminar dilengkapi dengan meja kerja, tempat untuk meletakkan peralatan kultur selama proses penanaman. Cara kerja enkas adalah sebagai berikut. Sebelum digunakan, bagian dalam enkas dilap dengan alkohol 70% dengan menggunakan tissue/lap steril (tissue/lap yang sudah disteril dengan autoklaf). Tangan pekerja disemprot dengan alkohol dan masuk melalui lubang di bagian depan enkas ketika melakukan pengelapan. Semua bahan/alat yang akan digunakan disemprot dengan alkohol sebelum dimasukkan ke dalam enkas. Selanjutnya pekerjaan dapat dimulai. Enkas banyak digunakan pada usaha pembuatan seedling anggrek dalam botol. Perlu diingatkan bahwa penggunaan enkas tidak boleh menggunakan lampu bunsen, Adanya residu uap alkohol dalam enkas dapat menyebabkan enkas meledak jika terkena api dan dapat mencederai pengguna.
Cara kerja laminar adalah sebagai berikut. Laminar dihubungkan dengan sumber listrik dan tombel “power” ditekan untuk mengaktifkan alat. Lampu UV dinyalakan dengan jalan menekan tombol UV. Lampu UV tujuannya untuk membunuh mikroorganisme yang ada dalam laminar, dinyalakan selama minimal 15 menit sebelum laminar digunakan. Selanjutnya, lampu UV dimatikan, pintu laminar dibuka, kemudian lampu biasa (tombol “lamp”) dinyalakan dan fan/blower diaktifkan. Selanjutnya meja dibersihkan lagi dengan alkohol 70%, semua alat/bahan yang digunakan untuk penanaman juga disemprot
dengan alkohol dan dimasukkan ke dalam laminar. Selanjutnya pekerjaan dapat dimulai. Yang perlu diperhatikan bahwa tangan pekerja harus senantiasa menggunakan glove/sarung tangan dan selalu disemprot dengan alkohol. Setelah pekerjaan selesai, semua barang dikeluarkan dari laminar, meja dibersihkan (dilap) dengan alkohol, pintu laminar ditutup, blower dan lampu dimatikan dan lampu Uv kembali dinyalakan selama kurang lebih 15 menit. Setelah itu, lampu UV dan power dimatikan, lepaskan dari sumber listrik.
Gambar 5. Meja Kerja Steril; Enkas (A) dan Laminar (B) (Foto: Dokumentasi Pribadi)
6. Rak Kultur Deskripsi
Rak kultur merupakan tempat untuk meletakkan eksplan setelah ditanam pada media steril dan menumbuhahkannya
hingga menjadi plantlet. Rak kultur diletakkan dalam ruang kultur. Semua proses morfogenesis hingga terbentuknya plantlet berlangsung di ruang kultur pada rak kultur (Gambar 6).
Gambar 6. Rak Kultur (Foto: Dokumentasi Pribadi)
7. Glasswares dan peralatan kecil lainnya
Glasswares adalah semua peralatan kecil yang terbuat dari bahan gelas seperti gelas ukur, gelas dan labu Erlenmeyer, serta botol kultur. Alat-alat ini dapat disterilisasi dengan oven maupun dengan autoklaf. Alat-alat ini harus dibungkus dengan kertas saat sterilisasi agar kondisi steril tetap terjaga sampai alat
tersebut digunakan. Botol-botol bekas seperti botol selai, botol minuman dan botol infus yang terbuat dari bahan gelas dapat digunakan untuk botol kultur.
Peralatan kecil lainnya terdiri dari dissecting kit (perataan untuk memotong/mengiris), pinset, spatula dan lain-lain yang umumnya terbuat dari bahan logam (stainlessteel). Spatula merupakan pengaduk atau digunakan untuk mengambil bahan berupa serbuk. Pinset digunakan untuk memegang / menjepit benda, umumnya digunakan pada saat penanaman eksplan. Scalpel adalah gagang pisau yang dalam penggunaannya berpasangan dengan blade (pisau). Gunanya adalah untuk mengiris/memotong, dalam hal ini bahan eksplan yang akan ditanam. Bagian pisau dijual secara terpisah dari scalpel (gagang)nya dan sudah dalam keadaan steril. Pisau steril ini bersifat sekali pakai. Peralatan kecil dari bahan logam ini juga harus dibungkus dengan kertas saat sterilisasi. Sterilisasi dapat dilakukan dengan oven maupun dengan autoklaf.
Bahan Diskusi
Perhatikan dengan seksama alat-alat tersebut dan pelajari cara kerjanya, kemudian jawab pertanyaan berikut:
- Mengapa sebelum menimbang zat harus mengetahui kapasitas timbangan yang digunakan?
- Apa fungsi dari magnetic stirrer, autoklaf dan laminar? Bagaimana cara kerjanya?
- Apa beda enkas dan laminar? Sebutkan bagian penting dari alat-alat tersebut dan jelaskan fungsinya.
- Sebutkan alat untuk sterilisasi: a. media; b. alat-alat kecil seperti pinset, scalpel, spatula, dan sebagainya.
- Apa yang dimaksud dengan sterilisasi dengan metode steam heating dan dry heating?
TOPIK 2. STERILISASI ALAT DENGAN AUTOKLAF
Tujuan
1. Memperkenalkan kepada mahasiswa cara mensterilisasi alat dalam teknik perbanyakan tanaman melalui kultur jaringan. 2. Mahasiswa mampu mensterilisasi alat yang digunakan
dalam teknik perbanyakan tanaman dengan kultur jaringan
Dasar Teori
Kondisi steril merupakan syarat utama keberhasilan praktik teknik kultur jaringan baik untuk tujuan perbanyakan tanaman maupun tujuan lainnya seperti transformasi genetik. Kondisi steril / aseptik berarti bebas mikroorganisme. Dengan demikian, semua alat yang akan digunakan dalam proses kultur harus dalam kondisi aseptik / steril. Untuk itulah diperlukan sterilisasi terhadap semua alat yang akan digunakan seperti pinset, spatula, botol kultur, gelas ukur, scalpel, (dan lain sebagainya ).
Proses sterilisasi diawali dengan langkah persiapan yakni pengemasan alat alat yang akan disteril. Alat-alat tersebut harus dalam keadaan terbungkus saat disteril maupun setelah disteril, untuk menghindarkan alat dari ekspose terhadap mikroorganisme, sehingga ketika digunakan tetap dalam kondisi steril.
Alat dan Bahan yang Dibutuhkan
- Autoklaf sebagai alat pensterilisasi
- Alat-alat yang akan disterilisasi, seperti botol kultur, alat tanam (pinset, scalpel), gelas ukur, aquades
- Plastik, kertas coklat, karet gelang, aluminium foil
Cara Kerja
- Bungkus alat-alat seperti botol kultur, gelas ukur dan aquades (dalam wadah) dengan plastik dan diikat dengan karet gelang.
- Karet gelang, plastik dan aluminium foil (untuk tutup botol kultur) disiapkan dalam wadah dan ditutup dengan plastik dan diikat dengan karet gelang.
- Alat tanam dibungkus dengan kertas coklat.
- Masukkan alat alat yang sudah siap tersebut dalam autoklaf, diletakkan dalam sarangan (panci autoklaf), sementara di bawah sarangan diberi air, kemudian tutup autoklaf ditutup rapat, katup dibiarkan terbuka dan dihubungkan dengan sumber tenaga.
- Autoklaf kompor dipanaskan diatas kompor, yang dengan listrik dihubungkan dengan sumber listrik.
- Setelah beberapa lama, uap akan keluar dari katup, sebagai penanda bahwa air didalamnya sudah panas dan mendidih. Pada saat itu, maka katup ditutup agar tekanan dan suhu di dalam autoklaf dapat naik dengan cepat.
- Kondisi ini dipertahankan sesuai waktu yang dibutuhkan untuk sterilisasi, misalnya untuk sterilisasi media diperlukan 30 menit, sedangkan untuk sterilisasi alat membutuhkan waktu 60 menit.
- Setelah mencapai waktu yang dibutuhkan autoklaf dilepaskan dari sumber tenaga (kompor/listrik).
- Selanjutnya katup dibuka secara perlahan, agar suhu turun secara perlahan pula.
- Tutup autoklaf boleh dibuka jika suhu/tekanan sudah mencapai nol. Selanjutnya, alat/bahan didalamnya dapat dikeluarkan secara hati-hati.
- Simpan alat-alat yang sudah disteril tersebut pada ruang khusus untuk penyimpanan alat/bahan steril.
Bahan Diskusi
- Mengapa kondisi steril senantiasa harus dijaga dalam pekerjaan kultur jaringan?
- Apa akibatnya jika alat-alat yang digunakan tidak steril?
- Apa saja yang bisa menjadi sumber kontaminan dalam kultur jaringan?
TOPIK 3. PEMBUATAN MEDIA KULTUR
Tujuan
Melatih mahasiswa agar memiliki keterampilan dalam pembuatan media kultur.
Dasar Teori
Eksplan (berupa jaringan atau organ) yang ditumbuhkan secara in vitro pada media buatan, juga membutuhkan hara untuk terjadinya morfogenesis dan pertumbuhan. Secara umum media buatan tersebut mengandung :
- Hara makro: nitrogen (N), posfor (P), kalium (K), kalsium (Ca), magnesium (Mg), dan sulfur (S).
- Hara mikro: ferum/zat besi(Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), cobalt (Co), copper (Cu) dan molybdenum (Mo).
- Gula: Gula diberikan pada media kultur sebagai sumber karbohidrat untuk respirasi karena tanaman kultur bersifat heterotrof atau tidak dapat melakukan fotosintesis untuk menghasilkan karbohidrat.
- Vitamin: Vitamin dibutuhkan tanaman sebagai katalisator dalam berbagai proses metabolisme. Vitamin digunakan untuk pertumbuhan sel dan proses diferensiasi sel dan jaringan yang ditanam secara in vitro. Beberapa jenis vitamin yang digunakan dalam kultur in vitro adalah thiamin, nicotinic acid dan pyridoxine.
- Myo-inositol: Myo-inositol adalah senyawa golongan karbohidrat yang ditambahkan pada media kultur dalam jumlah sedikit untuk menstimulasi pertumbuhan sel untuk banyak spesies tanaman. Meskipun bukan tergolong vitamin, namun senyawa ini akan terpecah menjadi vitamin C dan pectin.
- Zat pengatur tumbuh: Umumnya ada dua golongan zat pengatur tumbuh (ZPT) yang digunakan dalam kultur in- vitro, yakni golongan auksin dan sitokinin.
- Pemadat media: Media kultur diberi pemadat, dapat berupa agar, bioagar atau gellan gum. Penambahan senyawa pemadat bertujuan untuk membuat media menjadi padat maupun semi padat.
- Asam amino: Asam amino tidak selalu harus ditambahkan pada media kultur, namun diperlukan untuk kultur sel dan kultur protoplas.
- Senyawa organik alami: Senyawa organik alami seperti air kelapa, santan kelapa, jus/ekstrak tomat, ekstrak pisang, ekstrak kentang dan lain sebagainya seringkali ditambahkan pada media kultur untuk menstimulasi pertumbuhan sel/jaringan kultur. Kebutuhan akan jenis dan jumlahnya tergantung spesies tanamannya.
Unsur/senyawa tersebut kini sudah tersedia dalam bentuk kemasan jadi yang kita sebut sebagai media dasar. Dikenal ada
beberapa media dasar yang umumnya digunakan dalam kultur in
vitro, diantaranya adalah media MS (Murashige dan Skoog),
Knudson, VW (Vacin dan Went), dan NP (New Phalaenopsis). Dalam praktikum kali ini akan dilakukan pembuatan 2 macam media dengan menggunakan media dasar MS. Yang pertama adalah media untuk menumbuhkan biji atau subkultur protokorm anggrek dan yang kedua adalah media untuk kultur organ anggrek yakni menginduksi organogenesis. Pada media pertama, dilakukan penambahan 100 gram tomat per liter media; sedangkan pada media yang kedua dilakukan penambahan 0,01ppm NAA dan 5 ppm BAP. Jumlah NAA dan BAP yang dipipet untuk satu liter media tergantung pada larutan stok ZPT tersebut yang tersedia.
Alat dan Bahan yang Dibutuhkan Alat:
- Gelas Ukur ukuran 2 L
- Magnetic stirrer yang dilengkapi dengan pemanas
- Timbangan analitik
- Botol botol kultur yang sudah steril
- Tutup botol kultur yang dapat berupa karet, plastik atau aluminium foil
- Autoklaf untuk sterilisasi
Bahan / Senyawa:
- Media Kemasan jadi MS
- Buah tomat yang masak
- ZPT : NAA, BAP
- Sukrosa
- Pemadat
- Aquades
- Larutan KOH atau HCl
Cara Kerja
Cara membuat satu liter media tanam untuk biji anggrek sama dengan membuat satu liter media tanam untuk kultur in
vitro secara umum. Caranya adalah sebagai berikut:
- Siapkan gelas ukur (ukuran 2 Liter) dan letakkan di atas magnetic stirrer. Ukuran gelas harus lebih besar dari volume media yang akan dibuat
- Dibuat 3 macam media yakni: Media 1 (media MS murni), Media 2 (media MS ditambah 100 gram tomat per liter untuk kultur biji anggrek), dan Media 3 (sejumlah NAA dan BAP untuk induksi tunas pada kultur organ)
- Timbang media kemasan jadi, beratnya disesuaikan dengan kebutuhan (untuk satu liter media) yang tercantum dalam sampul kemasan. Untuk media MS, ditimbang 4,43 gram media kemasan untuk pembuatan 1 liter media
- Untuk pembuatan satu liter media, masukkan senyawa tersebut pada gelas ukur yang sudah disediakan.
Tambahkan akuades hingga 500 ml. Masukkan magnet pengaduk dan putar knop “stirrer” magnetic stirrer untuk pengadukan dan putar juga knop “heat” untuk pemanasan
- Masukkan 30 gram sukrosa (gula pasir) untuk setiap liter media dan tetap dilakukan pengadukan dan pemanasan
- Pada media 1 tidak dilakukan penambahan ZPT maupun bahan organik. Pada media 2 ditambahkan 100 gram tomat per liter. Caranya, timbang tomat 100 gram, kemudian dijus dengan penambahan sedikit air dan kemudian dituang seluruhnya. Media 3 adalah media untuk induksi tunas yang mengandung 5 ppm BAP dan 0,1ppm NAA. Pada media 3, dipipet sejumlah NAA dan BAP (dilakukan perhitungan sesuai dengan konsentrasi stok yang tersedia)
- Selanjutnya pada masing-masing jenis media ditambahkan akuades hingga volume mendekati satu liter, misal 900 ml
- Ukur pH dengan pH indikator, kemudian pH tersebut diadjust atau dijadikan 5,6-5,8 dengan jalan menambahkan larutan yang bersifat basa (NaOH atau KOH) jika terlalu asam atau larutan yang bersifat asam (HCl) jika terlalu basa
- Timbang pemadat yaitu 7 gram agar-agar komersial untuk setiap liter media dan tambahkan ke masing- masing jenis media
- Tambahkan akuades lagi hingga volumenya benar-benar tepat satu liter. Pada saat menambahkan akuades, magnet pemutar diangkat sebentar, setelah tepat satu liter dimasukkan lagi
- Tetap dilakukan pengadukan (“stirrer”) dan pemanasan
(“heat”) agar larutan benar benar homogen
- Jika sudah mendidih (suhu mencapai 80oC), maka media tersebut dituang ke dalam botol-botol kultur yang sudah disteril, ditutup rapat dengan penutup botol yang terbuat dari karet atau dengan plastik lembaran atau aluminium foil. Volume masing-masing botol tergantung ukuran botolnya, berkisar kurang lebih 20-40 ml
- Selanjutnya botol-botol yang sudah berisi media tersebut disteilisasi dengan autoklaf. Caranya, panci autoklaf diisi air secukupnya, kemudian “sarangan” (bentuknya seperti bagian dalamnya dandang yang berlubang) diletakkan di dalamnya. Botol-botol yang berisi media tersebut diletakkan dalam “sarangan‟, diatur sedemilian rupa agar efisien dan volume tidak melebihi volume “sarangan” sehingga autoklaf dapat ditutup rapat.
- Selanjutnya autoklaf dipanaskan dengan kompor (untuk jenis autoklaf kompor) atau dengan listrik (untuk jenis autoklaf listrik). “Katup asap‟ dibiarkan terbuka hingga keluar asap. Setelah asap keluar dari katup, selanjutnya katup ditutup agar suhu dan tekanan meningkat
- Dibiarkan suhu naik hingga mencapai 121oC atau tekanan mencapai 17 psi (autoklaf umumnya dilengkapi dengan penunjuk suhu dan tekanan). Proses sterilisasi media
membutuhkan waktu 30 menit, dihitung sejak suhu mencapai 121oC
- Setelah proses autoklafing selesai, media tidak dapat langsung dikeluarkan. Harus ditunggu dulu sampai suhu autoklaf mencapai 0oC atau tekanan 0 psi.
- Setelah dikeluarkan dari autoklaf, media ditaruh di ruang media. Digunakan paling cepat satu minggu kemudian, untuk memberikan kesempatan pada mikroorganisme (seandainya masih ada dalam media) untuk tumbuh dalam kurun waktu tersebut, sehingga dapat mencegah penggunaan media yang mengandung mikroorganisme dorman di dalamnya
- Dalam kondisi tidak tersedianya “magnetic stirrer‟ di laboratorium, maka pembuatan media dapat dilakukan di atas kompor. Peran gelas ukur digantikan oleh panci aluminium atau “stainlessteel‟ yang tahan untuk pemanasan di atas kompor, sedangkan untuk mengaduk digunakan sendok pengaduk sebagai pengganti magnet yang diputar oleh stirrer (pada “magnetic stirrer‟).
Bahan Diskusi
- Mengapa harus ditambahkan 100 gram jus tomat pada media untuk kultur biji atau sub kultur protokorm anggrek?
- Mengapa ditambahkan 0,01ppm NAA dan 5ppm BAP untuk induksi organogenesis pada kultur organ?
- Mengapa dibutuhkan suatu tenggang waktu sejak “media
selesai diautoclaving‟ dengan “media dapat digunakan”?
- Jika ada media yang kontaminasi, apa jenis kontaminan dan dari mana sumbernya?
TOPIK 4. PERSILANGAN ANGGREK
Tujuan
Melatih mahasiswa dalam melakukan persilangan pada tanaman anggrek, sebagai langkah awal dalam pembuatan anggrek hibrida.
Dasar Teori
Anggrek merupakan tanaman yang paling mudah disilangkan diantara tanaman yang tergolong Kelas Angiospermae, sehingga setiap tahunnya di dunia bisa dihasilkan ratusan hingga ribuan anggrek hibrida. Anggrek memiliki perhiasan bunga yang spesifik, dimana kelopak dan mahkota bunganya sulit dibedakan karena warnanya sama, sehingga keduanya disebut perhiasan bunga. Polen (sel kelamin jantan) menggumpal disebut polinia. Sementara putik (sel kelamin betina) terdapat pada suatu cekungan dalam struktur yang disebut “tugu” atau “columna”, bersama dengan polen di bagian atasnya.
Persilangan dapat dilakukan dengan jalan mengambil polinia anggrek dan meletakkan pada putiknya. Umumnya tujuh hari setelah persilangan dilakukan, perhiasan bunga akan layu dan gugur, dan perlahan bakal buah membengkak. Bakal buah ini selanjutnya berkembang menjadi buah, yang mana di dalamnya terdapat ribuan biji anggrek. Diperlukan waktu yang berbeda untuk setiap spesies anggrek dari sejak persilangan
sampai buahnya dapat dipanen untuk ditabur dalam pembuatan anggrek botol. Misalnya, genus Dendrobium membutuhkan waktu 3 bulan setelah persilangan, Phalaenopsis 8-9 bulan, dan anggrek Vanda sekitar 6-7 bulan setelah persilangan. Gambar 7 menunjukkan contoh persilangan anggrek.
Gambar 7. Persilangan pada Tanaman Anggrek
Alat dan Bahan yang Dibutuhkan - Tanaman anggrek
- Kertas label - Pensil 2B
- Tusuk Gigi - Benang - Cawan petri
Cara Kerja
- Buka tutup polen, ambil polen dengan tusuk gigi dan letakkan pada cawan petri
- Letakkan polen tersebut pada putik - Lakukan resiprokal
- Beri label dan diikatkan dengan benang pada tangkai bunga yang digunakan sebagai induk betina (yang akan berkembang menjadi buah)
- Label ditulis dengan pensil bukan pulpen agar tidak luntur. Label berisi nama tanaman induk (betina dan jantan) serta tanggal.
- Amati dan catat apa yang terjadi dan ambil gambar / foto secara periodik perkembangan bakal buah setelah persilangan.
Bahan Diskusi
- Berapa jumlah bunga yang berhasil menjadi buah? - Apa yang menyebabkan kegagalan terbentuknya buah? - Mengapa buah yang akan ditabur bijinya harus dipanen
TOPIK 5. KULTUR BIJI ANGGREK
Tujuan
Melatih mahasiswa agar memiliki keterampilan dan pengetahuan dalam perbanyakan tanaman anggrek melalui kultur biji.
Dasar Teori
Hasil persilangan anggrek akan membentuk buah (Gambar 8). Di dalam buah anggrek terdapat biji anggrek yang berukuran sangat kecil, sehingga dalam satu buah bisa terdapat ratusan hingga jutaan biji tergantung spesies nya. Berbeda dengan biji tanaman angiospermae lain yang memiliki cadangan makanan, biji anggrek sedikit atau tidak sama sekali memiliki cadangan makan (endosperm). Konsekwensinya, biji-biji ini harus disemai secara in vitro di laboratorium pada media steril yang mengandung sumber makanan (hara makro, hara mikro, vitamin). Perkecambahan biji anggrek secara alamiah (di habitatnya) bisa terjadi, namun harus ada simbiosis dengan semacam mikoriza. Dengan kondisi inipun persentase perkecambahan masih sangat rendah, yaiti berkisar sekitar 1 %. Sedangkan penyemaian di luar laboratorium pada media tidak steril menyebabkan biji-biji tersebut mati karena serangan mikroorganisme atau dimakan serangga (seperti semut) karena ukuran biji yang sangat kecil. Dengan demikian, penaburan biji anggrek harus ditanam secara in vitro di laboratorium. Syarat
utama untuk kultur in vitro adalah kondisi aseptik, sehingga sterilisasi merupakan faktor penting untuk keberhasilan kerja kultur in vitro.
Gambar 8. Buah hasil persilangan; Anggrek Phalaenopsis amabilis (A) dan Vanda tricolor (B)
(Foto: Dokumentasi pribadi)
Alat dan Bahan yang Dibutuhkan Alat:
- Media kultur steril yang sudah disiapkan sebelumnya
- Cawan petri yang berdiameter agak besar (9-12cm) untuk tempat menaruh buah dalam meja kerja
- Erlenmeyer kecil atau botol selai steril untuk tempat alkohol
- Lampu bunsen dan spiritus
- Scalpel dan blade (pisau steril) untuk mengiris buah
Bahan:
- Buah anggrek yang siap ditabur
- Spiritus
- Alkohol
- Detergen untuk mencuci buah anggrek
Cara Kerja:
- Pertama buah anggrek (yang akan ditabur bijinya) dicuci pada kucuran air kran sambil disikat (dengan sikat gigi bersih) menggunakan detergen
- Selanjutnya buah anggrek yang sudah bersih ini dicelupkan dalam spiritus dan dibakar di atas lampu bunsen. Hal ini dilakukan sebanyak tiga kali, baru kemudian dimasukkan ke dalam laminar
- Di dalam laminar, buah anggrek tersebut dipegang dengan pinset, dibakar sekali lagi baru kemudian dibelah
- Selanjutnya biji-biji anggrek ditanam pada media yang sudah disiapkan, yakni media 1 (MS murni) dan media 2 (MS +100gram per liter jus tomat).
- Botol kultur diberi label dan diletakkan di ruang kultur
- Prinsip untuk menjaga kondisi steril adalah setiap alat tanam yang akan mengenai bahan tanam harus dicelupkan terlebih dahulu dalam alkohol, lalu dibakar di api lampu bunsen, baru kemudian digunakan. Hati-hati dalam penggunaan alkohol dan api. Jangan sampai alat yang masih mengandung api‟ dicelupkan dalam alkohol karena dapat menyebabkan terbakarnya alkohol. Gambar 9 menunjukkan cara penaburan biji anggrek.
Gambar 9. Penaburan biji anggrek secara in vitro
Bahan Diskusi
- Amati saat biji berkecambah (berubah hijau) pada kedua jenis media. Pengamatan dilakukan setiap minggu sampai minggu ke 3. Pada media mana biji anggrek lebih cepat berkecambah?
- Amati dan hitung jumlah botol kultur yang bijinya berkecambah (dilakukan pada akhir pengamatan, yakni pada minggu ke 3).
- Bahaslah hasil tersebut di atas, cari bahan referensi yang mendukung pembahasan.
TOPIK 6. SUBKULTUR
Tujuan
Mahasiswa dapat melakukan praktek subkultur yang merupakan tahapan dalam pekerjaan dalam kultur jaringan.
Dasar Teori
Subkultur adalah memindahkan kultur ke media baru dengan alasan tertentu. Beberapa alasan kultur harus dipindahkan adalah:
- Media habis sementara tanaman masih sehat
- Penjarangan pada pertumbuhan protokorm anggrek
- Media terkontaminasi sementara tanaman tidak/masih sehat
- Proliferasi tunas sehingga tunas-tunas yang sudah tumbuh dipindahkan kembali ke media induksi tunas untuk menstimulasi peningkatan jumlah tunas
- Memindahkan ke media perakaran untuk induksi akar. Ini dilakukan untuk tunas-tunas yang sudah tumbuh tapi belum berakar
- Untuk tujuan lainnya, seperti induksi embrio dalam embriogenesis, dan lain sebagainya.
Pada praktikum ini dilakukan subkultur protokorm anggrek hasil semai biji. Subkultur dilakukan karena media sudah habis dan populasi protokorm dalam botol sangat tinggi sehingga tumbuh berjejal dan menghambat pertumbuhan.
Alat dan Bahan yang Dibutuhkan Alat:
(semua alat dalam keadaan steril / sudah diautoklaf)
- Pinset
- Wadah alkohol
- Aluminium foil
- Lampu bunsen dengan spiritus
- Korek api
- Karet gelang
- Laminar
Bahan:
- Media tanam steril
- Protokorm anggrek dalam botol
- Alkohol
Cara Kerja
- Aktifkan laminar, nyalakan lampu UV selama 15 menit
- Matikan lampu UV, nyalakan lampu biasa dan hidupkan blower
- Kenakan glove dan semprot tangan dengan alkohol 70 %
- Semprot semua alat dan bahan yang akan digunakan dan masukkkan dalam laminar
- Celupkan pinset dalam alkohol dan ekspose ke arah api. Gunakan pinset tersebut untuk memindahkan protokorm ke media baru
- Tutup kembali botol setelah penanaman pada media baru
- Pekerjaan ini diulang hingga protokorm dalam botol awal habis disubkultur. Yang perlu diperhatikan untuk menjaga kondisi aseptik adalah:
- Selalu celupkan pinset ke alkohol dan ekspose ke arah api sebelum digunakan mengambil protokorm
- Panaskan mulut botol (botol asal protokorm maupun botol media baru) sebelum mengambil atau meletakkan protokorm dari/ke dalam botol.
Bahan Diskusi
- Berapa persen dari botol yang ditanam terkontaminasi?
- Amati apa yang menyebabkan kontaminasi beserta ciri-cirinya?
- Bagaimana cara menanggulangi kontaminasi tersebut?
- Apa akibatnya jika protokorm anggrek tersebut tidak disubkultur?
- Dalam pembuatan anggrek botol, perlukah sub-kultur dilakukan?
- Untuk menjawab semua pertanyaan, carilah literatur yang mendukung dan tulis sumbernya.
TOPIK 7. KULTUR ORGAN TANAMAN ANGGUR (Vitis vinifera L.)
Tujuan
Melatih mahasiswa agar memiliki keterampilan dan pengetahuan dalam perbanyakan tanaman melalui kultur organ.
Dasar Teori
Teknik kultur jaringan tanaman adalah suatu cara atau teknik untuk menumbuhkan sel, jaringan, organ atau bagian tanaman lainnya untuk menjadi tanaman secara utuh, dalam kondisi steril (aseptik) pada media yang mengandung nutrisi, di laboratorium.
Teknik kultur in-vitro ini digunakan sebagai dasar untuk melakukan perbanyakan mikro, atau dikenal dengan istilah ‟mikropropagasi‟ (micropropagation) atau in vitro propagation. Mikropropagasi ini merupakan perbanyakan vegetatif yang dilakukan secara modern. Karena perbanyakan vegetatif, maka anakan hasil perbanyakan akan identik dengan induknya. Anakan hasil perbanyakan melalui mikropropagasi ini disebut plantlet. Jadi plantlet adalah tanaman hasil perbanyakan melalui mikropropagasi atau kultur in vitro. Plantlet ini disebut somaklon, karena merupakan tanaman hasil perbanyakan secara vegetatif (klon) yang berasal dari sel-sel somatik. Somaklon memiliki sifat-sifat yang secara genetik identik dengan induknya, sehingga mikropropagasi ini digunakan untuk memperbanyak
tanaman transgenik yang dihasilkan melalui rekayasa genetika maupun untuk memperbanyak hibrida unggul yang merupakan hasil persilangan konvensional.
Di dalam kultur in vitro (kultur jaringan), sistem regenerasi tanaman atau terbentuknya plantlet dari eksplan dapat terjadi melalui dua cara yakni organogenesis dan embriogenesis. Organogenesis adalah proses pembentukan propagul berupa organ. Embriogenesis adalah proses pembentukan embrio, dan dalam kultur in vitro disebut embriogenesis somatik (somatic
embryogenesis) karena embrio yang terbentuk berasal dari
eksplan yang terdiri dari sel-sel somatik. Organogenesis maupun embriogenesis dapat terjadi secara langsung (direct) ataupun secara tidak langsung atau melalui fase kalus terlebih dahulu (indirect).
Dalam praktikum ini akan dilakukan produksi plantlet melalui organogenesis secara langsung melalui kultur organ. Organ yang akan dijadikan eksplan adalah daun dan tunas tanaman anggur.
Alat dan Bahan yang Dibutuhkan Alat:
Peralatan yang digunakan sudah dalam kondisi steril
- Cawan petri
- Scalpel dan blade
- Lampu bunsen
- Gunting
- Wadah alkohol
- Wadah untuk sterilisasi eksplan (gelas erlen meyer steril)
Bahan:
- Daun dan tunas tanaman anggur
- Alkohol
- Spiritus
- Fungisida
- Larutan Bayclin 5%
- Media untuk induksi tunas yang sudah disiapkan sebelumnya dan media MS murni
Cara Kerja:
- Laminar dipersiapkan sebagaimana mestinya (lihat topik topik sebelumnya)
- Ambil tunas dan daun tanaman anggur dari tanaman induk menggunakan gunting steril
- Cuci material eksplan di bawah air kran mengalir
- Masukkan dalam wadah yang berisi larutan detergen dan digoyang-goyang selama 5 menit
- Bilas dengan air steril 3 kali dan masukkan dalam larutan fungisida (2 gram/L), ditutup rapat dan masukkan ke dalam laminar
- Dalam laminar, selanjutnya wadah tersebut digoyang selama 10 menit
- Bilas dengan air steril 3 kali dan kembali dimasukkan ke larutan fungisida (baru) dengan konsentrasi sama, digoyang kembali selama 10 menit
- Bilas kembali dengan air steril sebanyak 3 kali, selanjutnya dimasukkan ke dalam larutan bayclin 5% selama 2 menit
- Bilas dengan air steril 3 kali, selanjutnya letakkan pada cawan petri yang sudah dialasi dengan kertas saring
steril untuk ditiriskan
- Buatlah irisan eksplan, daun dan node dipisahkan
- Tanam pada media yang sudah disiapkan
- Lakukan pengamatan secara periodik (setiap minggu) hingga 6 minggu
- Variabel pengamatan: jumlah eksplan bertunas (setiap botol), jumlah tunas per eksplan (hanya dihitung dari eksplan yang tumbuh tunas, dirata-ratakan untuk setiap botol).
Bahan Diskusi dan Pelaporan:
- Adakah perbedaan hasil antar jenis eksplan?
- Apakah yang terjadi pada percobaan anda, organogenesis atau embriogenesis?
- Sebutkan dan jelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi morfogenesis tanaman secara in vitro
TOPIK 8. KULTUR TANGKAI BUNGA ANGGREK PHALAENOPSIS
Tujuan
Melatih mahasiswa agar memiliki keterampilan dan pengetahuan dalam perbanyakan tanaman melalui tangkai bunga.
Dasar Teori
Anggrek dari genus Phalaenopsis atau dikenal di Indonesia sebagai anggrek Bulan memiliki kelebihan yakni warna bunga yang menarik, serta memiliki flower longevity (daya tahan bunga dalam tandan bunga yang masih melekat pada tanaman/intact
plant), sehingga sangat baik digunakan untuk bisnis rental
tanaman hias (Gambar 10). Dalam prakteknya, setelah bunganya gugur, tangkai bunga tersebut harus dibuang atau dipangkas dari tanamannnya untuk merangsang tumbuhnya tunas-tunas baru pada tanaman, sehingga menjadi limbah yang tak termanfaatkan.
Sementara itu, teori totipotensi sel menyebutkan bahwa sel tanaman secara genetik memiliki potensi untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman secara utuh. Dengan dilatarbelakangi teori totipotensi sel ini maka mikropropagasi atau perbanyakan tanaman melalui teknik kultur jaringan dilakukan.
Gambar 10. Anggrek Bulan (Phalaenopsis amabilis L.) (Foto: Dokumentasi Pribadi)
Didasari oleh teori tersebut serta didasari oleh banyaknya limbah tanaman berupa tangkai bunga anggrek Phalaenopsis yang diproduksi oleh berbagai rental tanaman hias dewasa ini menjadi alasan yang sangat kuat untuk melakukan perbanyakan menggunakan bahan tanam dari limbah tangkai bunga anggrek Phalaenopsis.
Alat dan Bahan yang Dibutuhkan Alat:
Peralatan yang digunakan sudah dalam kondisi steril
- Cawan petri
- Scalpel dan blade
- Lampu bunsen
- Gunting
- Wadah alkohol
- Wadah untuk sterilisasi eksplan (gelas erlen meyer steril)
Bahan:
- Tangkai bunga anggrek Phalaenopsis
- Alkohol
- Spiritus
- Fungisida
- Larutan Bayclin 5%
- Media untuk induksi tunas yang sudah disiapkan sebelumnya dan media MS murni
Cara Kerja:
- Laminar dipersiapkan sebagaimana mestinya (lihat topik topik sebelumnya)
- Ambil tunas dan daun tanaman anggur dari tanaman induk menggunakan gunting steril
- Cuci material eksplan di bawah air kran mengalir
- Masukkan dalam wadah yang berisi larutan detergen dan digoyang-goyang selama 5 menit
- Bilas dengan air steril 3 kali dan masukkan dalam Larutan fungisida (2 gram/L), ditutup rapat dan masukkan ke dalam laminar
- Dalam laminar, selanjutnya wadah tersebut digoyang selama 10 menit
- Bilas dengan air steril 3 kali dan kembali dimasukkan ke larutan fungisida (baru) dengan konsentrasi sama, digoyang kembali selama 10 menit
- Bilas kembali dengan air steril sebanyak 3 kali, selanjutnya dimasukkan ke dalam larutan bayclin 5 % selama 2 menit
- Bilas dengan air steril 3 kali, selanjutnya letakkan pada cawan petri yang sudah dialasi dengan kertas saring steril untuk ditiriskan
- Buatlah irisan eksplan, node tangkai bunga diiris, dengan ukuran kurang lebih 1 cm.
- Untuk mencegah browning, pengirisan dapat dilakukan pada larutan vitamin C 50 ppm, kemudian dibilas dengan air steril dan ditiriskan pada kertas saring steril
- Tanam pada media yang sudah disiapkan
- Lakukan pengamatan secara periodik (setiap minggu) hingga 6 minggu
- Variabel pengamatan: saat tumbuh tunas, jumlah eksplan bertunas (setiap botol), jumlah tunas per eksplan (hanya dihitung dari eksplan yang tumbuh tunas, dirata-ratakan untuk setiap botol).
Bahan Diskusi dan Pelaporan:
- Adakah perbedaan hasil antar jenis eksplan?
- Apakah yang terjadi pada percobaan anda, organogenesis atau embriogenesis?
- Sebutkan dan jelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi morfogenesis tanaman secara in vitro
DAFTAR REFERENSI
Sumber Referensi untuk mendukung pelaporan:
1. Dwiyani, R. 2015. Kultur Jaringan Tananaman. Pelawasari, Denpasar. 75hal.
2. George EF & SherringtonPD. 1984. Plant propagation by tissue culture. Hand book and directory of commercial laboratories. Exegetics Ltd, England.
3. Saad AIM & Elshahed AM. 2012. Plant tissue culture media. http://creative commons.org./licenses/by/3.0
4. Dwiyani R, Yuswanti H, Darmawati IAP, Suada K & Mayadewi NNA. 2015. In vitro germination and its subsequent growth of an orchid of Vanda tricolor Lindl. var. suavis from Bali on complex additives enriched medium. Agrivita 37 (2) : 144-150
5. Dwiyani R. 2013. Perkecambahan Biji dan Pertumbuhan Protokorm Anggrek dari Buah dengan umur yang berbeda pada media kultur yang diperkaya dengan dengan ekstrak tomat. Jurnal Hortikultura Indonesia 4(2): 90-93
6. Jurnal internasional lainnya yang terkait dengan topik praktikum.
