APLIKASI METODE POLYMERASE CHAIN
REACTION-RESTRICTION FRAGMENT LENGTH
POLYMORPHISM (PCR-RFLP) UNTUK
DETEKSI MUTASI PROMOTER inhA PADA PASIEN
MULTIDRUG RESISTANT Mycobacterium tuberculosis
(MDR-TB)
Skripsi
IDA AYU RATIH DWI NUGRAHA PUTRI 1208505001
JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN
ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
2016
i
APLIKASI METODE POLYMERASE CHAIN
REACTION-RESTRICTION FRAGMENT LENGTH
POLYMORPHISM (PCR-RFLP) UNTUK
DETEKSI MUTASI PROMOTER inhA PADA PASIEN
MULTIDRUG RESISTANT Mycobacterium tuberculosis
(MDR-TB)
Skripsi
IDA AYU RATIH DWI NUGRAHA PUTRI 1208505001
JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN
ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
2016
ii
Lembar Pengesahan
APLIKASI METODE POLYMERASE CHAIN
REACTION-RESTRICTION FRAGMENT LENGTH
POLYMORPHISM (PCR-RFLP) UNTUK DETEKSI
MUTASI PROMOTER inhA PADA PASIEN
MULTIDRUG RESISTANT Mycobacterium tuberculosis
(MDR-TB)
Tugas Akhir II
Tugas Akhir II (Skripsi) ini diajukan sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) di Jurusan Farmasi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana Oleh
IDA AYU RATIH DWI NUGRAHA PUTRI 1208505001
Menyetujui:
Mengesahkan:
KATA PENGANTAR Pembimbing I
Dr. Sagung Chandra Yowani, S.Si., Apt., M.Si. NIP. 197102101997022001
Pembimbing II
Dr. I Nengah Wirajana, S.Si., M.Si. NIP. 197102191997021001
Ketua Jurusan Farmasi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. rer. nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si., Apt. NIP. 196804201994021001
iii
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan ke hadapan Tuhan Yang Maha Esa karena berkat rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan Tugas Akhir II (Skripsi) yang berjudul “APLIKASI METODE POLYMERASE CHAIN REACTION-RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (PCR-RFLP) UNTUK DETEKSI MUTASI PROMOTER inhA PADA PASIEN MULTIDRUG RESISTANT Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB)” tepat pada waktunya. Tugas Akhir II ini diajukan sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Jurusan Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Udayana.
Penulisan Tugas Akhir II ini tentunya tidak terlepas dari dukungan dan bantuan dari berbagai pihak, baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:
1. Drs. Ida Bagus Made Suaskara, M.Si., selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.
2. Dr. rer. nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si., Apt, selaku Ketua Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.
3. Dr. Sagung Chandra Yowani, S.Si., Apt., M.Si., selaku dosen pembimbing I yang banyak mengarahkan serta memberi semangat dan dukungan yang tak henti demi kelancaran penyusunan Tugas Akhir II ini.
4. Dr. I Nengah Wirajana, S.Si., M.Si., selaku dosen pembimbing II yang banyak mengarahkan serta memberi semangat dan dukungan demi kelancaran penyusunan Tugas Akhir II ini.
5. Seluruh teknisi di Laboratorium Biologi Molekular FK, khususnya Mbok Nanik, Kak Echi, dan Bu Komang yang telah banyak memberi bantuan dan dukungan.
6. Seluruh dosen pengajar beserta pegawai di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana yang telah
iv
banyak memberikan ilmu serta dukungan sejak awal penulis mengenyam pendidikan di Jurusan Farmasi.
7. Kedua orang tua penulis, Ida Bagus Ngurah Sucarma dan I Gusti Ayu Ketut Rasminiati yang tak henti memberi doa. Kedua saudari penulis, Mbk Ewik dan Gek Agung yang selalu memberikan dukungan dan semangat kepada penulis sehingga Tugas Akhir II ini dapat diselesaikan.
8. Sahabat tersayang penulis, Eni, Claudia, Sonia yang selalu memberikan motivasi, dukungan, menjadi teman berbagi suka dan duka sejak awal perkuliahan, serta Nia, Desak, Risma, Wiwik, Diah yang juga selalu memberikan motivasi dan dukungan.
9. TB Team Linda, Widya, Dek Tri, Ebi yang selalu memberikan motivasi selama penyusunan skripsi serta Rai yang menjadi teman diskusi sejak awal penyusunan skripsi dan berbagi suka duka selama penelitian berlangsung.. 10. Seluruh mahasiswa Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana,
khususnya teman-teman Dioscuri Hygeia yang telah berjuang bersama sejak awal.
11. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu.
Penulis menyadari bahwa penulisan Tugas Akhir II (Skripsi) ini masih sangat jauh dari kesempurnaan. Penulis berharap kritik dan saran yang bersifat membangun dari berbagai pihak demi karya yang lebih baik di masa yang akan datang. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca dan perkembangan ilmu pengetahuan.
Denpasar, Juni 2016
v DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ... i
LEMBAR PENGESAHAN ... ii
KATA PENGANTAR ... iii
DAFTAR ISI ... v
DAFTAR SINGKATAN ... viii
DAFTAR ISTILAH ... x
DAFTAR TABEL ... xiii
DAFTAR GAMBAR ... xiv
DAFTAR LAMPIRAN ... xv ABSTRAK ... xvi ABSTRACT ... xvii BAB I PENDAHULUAN... 1 1.1 Latar Belakang ... 1 1.2 Rumusan Masalah ... 5 1.3 Tujuan Penelitian ... 5 1.4 Manfaat Penelitian ... 5 1.4.1 Manfaat Keilmuan ... 5 1.4.2 Manfaat Praktis ... 6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 7
vi
2.2 Multidrug Resistant Tuberculosis ... 8
2.3 Isoniazid ... 10
2.4 Gen resisten Isoniazid (inhA) ... 12
2.5 Mutasi Gen ... 13 2.5.1 Insersi ... 14 2.5.2 Delesi ... 14 2.5.3 Substitusi ... 15 2.6 DNA Metagenomik ... 15 2.7 Enzim restriksi ... 17
2.7.1 Enzim Restriksi Endonuklease Tipe II ... 19
2.7.2 Interaksi Enzim Restriksi Endonuklease Tipe II dengan DNA ... 21
2.7.3 Penempelan pada DNA dan Lokasi Situs Target ... 22
2.8 PCR ... 23
2.8.1 Tahapan Siklus PCR ... 24
2.8.2 Komponen dalam melakukan proses PCR ... 25
2.9 RFLP ... 27
2.10 Elektroforesis ... 28
BAB III METODE PENELITIAN ... 31
3.1 Rancangan Penelitian ... 31
3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian ... 31
3.3 Bahan Penelitian ... 31
vii
3.5 Prosedur Penelitian ... 32
3.5.1 Pemilihan Enzim Restriksi ... 32
3.5.2 Isolasi DNA M. tuberculosis H37Rv ... 33
3.5.3 Amplifikasi DNA dengan PCR ... 34
3.5.4 Deteksi Produk PCR dengan Elektroforesis... 34
3.5.5 Digesti dengan menggunakan enzim restriksi ... 35
3.5.6 Deteksi Hasil Digesti Enzim Restriksi dengan elektroforesis ... 35
3.5.7 Interpretasi Hasil ... 36
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN... 37
4.1 Pemilihan Enzim Restriksi ... 37
4.2 Isolasi DNA Mycobacterium tuberculosis H37Rv ... 41
4.3 Optimasi dan Amplifikasi Daerah Promoter inhA ... 44
4.4 Optimasi Formulasi dan Waktu Digesti Daerah Promoter inhA dengan Enzim Restriksi SacII ... 49
4.5 Digesti Daerah Promoter inhA ... 54
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN... 58
5.1 Kesimpulan ... 58
5.2 Saran ... 58
DAFTAR PUSTAKA ... 59
viii
DAFTAR SINGKATAN A : Adenin
ACP : acyl carrier protein BSC : biological safety cabinet bp : base pairs
C : Sitosin
DNA : Deoxyribonucleic acid dATP : deoksiadenosin trifosfat dCTP : deoksisitidin trifosfat dGTP : deoksiguanosin trifosfat dTTP : deoksitimidin trifosfat
dNTPs : Deoxynucleotide triphosphates EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid ETH : etionamid
FAS-I : Fatty Acid Synthetase tipe I FAS-II : Fatty Acid Synthetase tipe II G : Guanin
HIV : Human Immunodeficiency Virus INH : isoniazid (isonicotinic acid hydrazide) INHr : isoniazid resistant
LAM : Lipoarabinomannan LM : Lipomannan
ManLAM : Mannose Lipoarabinomannan MDR : Multi-drug resistant
MTb : Mycobacterium tuberculosis OAT : Obat Anti Tuberkulosis ORF : Open Reading Frame pb : pasang basa
PCR : Polymerase Chain Reaction
PCR-RFLP : Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism
ix
PILAM : Phosphoinositol Lipoarabinomannan PIM : Phosphatidylnositol mannosides T : Timin
TB : tuberkulosis
TBE : Tris-Boric Acid-EDTA WHO : World Health Organization
x
DAFTAR ISTILAH Amplifikasi DNA : perbanyakan DNA
Amplikon : produk PCR
Asam amino : unit monomer penyusun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida
Building block : unit monomer penyusun komponen
Comb : alat menyerupai sisir yang digunakan untuk membentuk
kolom (well) pada gel agarosa
Chamber : wadah untuk meletakkan gel agarosa
DNA polimerase : enzim yang diperlukan sebagai katalis dalam proses polimerisasi DNA
DNA templat : DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan
Frameshift mutation : mutasi titik yang menunjukkan terjadinya penghapusan atau penyisipan nukleotida (bukan kelipatan tiga)
Gen : urutan DNA yang menyandi suatu protein
GenBank : database utama dalam biologi molekuler yang dikelola
oleh NCBI
Genom : keseluruhan materi genetik (DNA/RNA) pada makhluk hidup
Hairpins : struktur primer yang terbentuk oleh DNA tunggal
dimana terdapat suatu bagian tertentu dari DNA tersebut terhibridisasi pada bagian komplemen di dalam untai DNA yang sama, membentuk struktur menyerupai hairpin
H37Rv : galur standar yang dijadikan wild type
In vitro : percobaan dilakukan dalam tabung yang menyerupai
sistem in vivo agar dapat memberikan hasil yang sama dengan proses in vivo
xi
Kodon : deret nukleotida pada mRNA yang terdiri atas kombinasi tiga nukleotida berurutan yang menyandi suatu asam amino tertentu
Lokus : letak suatu gen pada suatu kromosom
Mutasi : terjadinya perubahan basa dari urutan nukleotida yang lazim dari suatu sekuen DNA organisme yang dapat menyebabkan perubahan sifat fenotip
Nukleotida : unit monomer pembentuk DNA
Nonsense mutation : mutasi akibat perubahan kodon sehingga kodon stop terbentuk prematur
ORF : segmen dari urutan nukleotida yang diawali dengan start kodon dan diakhiri dengan stop kodon dan memiliki panjang yang cukup untuk mengkode protein
PCR : teknik perbanyakan urutan DNA dengan menggunakan reaksi enzimatis
Primer : oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat
Polimerisasi : reaksi pembentukan polimer
Prodrug : senyawa yang tidak aktif dan bersifat labil, di dalam
tubuh akan mengalami perubahan melalui proses kimia atau enzimatik menjadi senyawa induk aktif dan kemudian berinteraksi dengan reseptor untuk menghasilkan efek farmakologis
Promoter : suatu sekuen DNA spesifik yang berperan dalam mengendalikan transkripsi gen struktural
Resistensi : kemampuan bakteri untuk bertahan terhadap adanya obat yang dengan konsentrasi normal dapat membunuh atau menghambat pertumbuhannya
Runs : pengulangan basa tunggal pada sekuen primer
xii
Sekuensing : proses penentuan urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA
Silent mutation : mutasi yang menunjukkan perubahan nukleotida dapat
mengakibatkan perubahan kodon tetapi tidak ada perubahan fenotipik yang diamati pada individu
Transkripsi : proses sintesis RNA dengan menggunakan DNA sebagai templat
Tray : alat yang digunakan sebagai cetakan gel agarosa
Well : kolom-kolom tempat diletakkannya zat yang akan
dielektroforesis
Wild Type : organisme yang memunculkan karakter dalam populasi
xiii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1 Rentang Pemisahan pada Gel Agarosa ... 30
Tabel 4.1 Hasil enzim restriksi yang spesifik mengenal daerah promoter InhA ... 38
Tabel 7.1 Formulasi Digesti I ... 76
Tabel 7.2 Formulasi Digesti II ... 76
xiv
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1 Isoniazid ... 10
Gambar 2.2 Mutasi pada lokus inhA... 12
Gambar 2.3 Contoh insersi ... 14
Gambar 2.4 Contoh delesi ... 14
Gambar 2.5 Contoh transisi dan transversi ... 15
Gambar 2.6 Pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi tipe I, II, dan III ... 18
Gambar 2.7 Ujung blunt dan ujung sticky... 19
Gambar 2.8 Skema Ilustrasi Proses Pengikatan DNA dan Pemotongan dengan Enzim Restriksi Endonuklease ... 22
Gambar 4.1 Hasil pemotongan enzim restriksi SacII menghasilkan ujung asimetris (sticky end) ... 40
Gambar 4.2 Peta restriksi enzim restriksi SacII ... 41
Gambar 4.3 Elektroforegram produk PCR hasil optimasi suhu isolat M. tuberculosis H37Rv... 45
Gambar 4.4 Elektroforegram hasil amplifikasi fragmen region promoter inhA M. tuberculosis pada suhu annealing 54oC ... 47
Gambar 4.5 Elektroforegram hasil amplifikasi fragmen region promoter inhA M. tuberculosis pada suhu annealing 54oC ... 47
Gambar 4.6 Elektroforegram hasil optimasi digesti daerah promoter inhA 50 Gambar 4.7 Elektroforegram hasil digesti daerah promoter inhA ... 55
xv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1. Prosedur penelitian... 67 Lampiran 2. Pemilihan Enzim Restriksi ... 68 Lampiran 3. Tahapan Isolasi DNA M. tuberculosis H37Rv ... 69 Lampiran 4. Sekuen Nukleotida M.tuberculosis H37Rv Promoter inhA ... 70 Lampiran 5. Pembuatan Larutan ... 71 Lampiran 6. Hasil Enzim Restriksi dengan aplikasi Clone Manager Suite 6 73 Lampiran 7. Formulasi Digesti Enzim Restriksi SacII ... 76 Lampiran 8. Ethical Clearance ... 77
xvi ABSTRAK
Mutasi pada promoter inhA tidak hanya mengakibatkan terjadinya resistensi terhadap isoniazid (obat anti tuberkulosis lini pertama), tetapi juga bertanggung jawab terhadap terjadinya resistensi silang pada etionamid (obat anti tuberkulosis lini kedua). Mutasi yang pernah dilaporkan terjadi adalah pada nukleotida -15 dan -24 dari promoter inhA. Deteksi mutasi secara molekuler dapat dilakukan dengan cara Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP), yang menggunakan enzim restriksi spesifik untuk mengenal urutan nukleotida tertentu. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui enzim restriksi yang dapat secara spesifik mengenal mutasi pada -24 dari daerah promoter inhA dan mendeteksi adanya mutasi tersebut dengan menggunakan teknik PCR-RFLP. Metode penelitian yang digunakan adalah metode eksploratif laboratoris, dengan tahapan sebagai berikut: pemilihan enzim restriksi, isolasi DNA M. tuberculosis H37Rv, amplifikasi daerah promoter inhA, deteksi produk PCR, optimasi dan digesti dengan menggunakan enzim restriksi, deteksi hasil digesti, dan interpretasi hasil.
Hasil analisis dengan menggunakan aplikasi Clone Manager Suite 6 memperlihatkan bahwa enzim restriksi SacII mampu mengenal secara spesifik urutan nukleotida -24 dari promoter inhA. Hasil optimasi digesti menunjukkan bahwa enzim SacII bekerja secara optimal pada suhu 37oC dengan waktu inkubasi 3 jam. Inaktivasi enzim dilakukan pada suhu 65oC selama 20 menit. Hasil digesti memperlihatkan bahwa enzim restriksi SacII memotong daerah promoter inhA pada isolat P10, P11, P16, 86, dan 134 menghasilkan 2 pita, yang menunjukkan bahwa tidak terjadi mutasi pada isolat-isolat tersebut.
Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa enzim restriksi yang digunakan untuk mendeteksi mutasi pada nukleotida -24 dari promoter inhA adalah enzim restriksi SacII. Pada keseluruhan isolat yang diteliti, yaitu P10, P11, P16, 86, dan 134 tidak ditemukan adanya mutasi pada titik -24 dari promoter inhA.
xvii ABSTRACT
The mutation of inhA promoter is not only result in isoniazid resistance (first line antituberculosis drugs), but also have responsible for cross resistance in ethionamide (second line antituberculosis drug). The mutations that have been reported was at -15 and -24 in promoter region of inhA. Molecular detection of mutations could be done by Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP), which uses specific restriction enzymes to recognize specific nucleotide sequences. Changes in the nucleotide sequence due to mutation, will be quickly recognized by this method. This study aims to determine the restriction enzyme which can specifically recognize the mutation at promoter region of inhAand detect the mutation using PCR-RFLP technique. This research were conducted in several steps which are: selection of restriction enzyme, DNA isolation of H37Rv Mycobacterium tuberculosis, amplification promoter region of inhA, detection of PCR product, optimization and digestion using restriction enzyme, detection of digestion product, and interpretation of result.
The analysis result using Clone Manager Suite 6 showed that SacII restriction enzyme could recognize specifically at -24 promoter region of inhA. The result of digestion optimization showed that SacII restriction enzyme have optimal work at 37oC for 3 hours incubation time, heat inactivation at 65oC for 20 minutes. Digestion result showed that SacII restriction enzyme cleave inhA promoter region of P10, P11, P16, 86, and 134 isolates into 2 bands, that showed there was no mutation in all isolates.
In conclusion, the enzyme that could detect the mutation at -24 in promoter region of inhA is SacII. There were no mutation found at all isolates at -24 promoter region of inhA.
