Strain
Improvement
(Pemuliaan
Galur)
Mikroorganisme
Produktif
Marlia Singgih Wibowo
Pengertian
Strain
Improvement
• Dalam bidang pertanian, perkebunan :
pengembalian sifat asli tanaman • Dalam bidang mikrobiologi : usaha
peningkatan produktivitas atau perubahan
sifat suatu galur mikroorganisme
Tujuan
Strain
Improvement
• Meningkatkan produktivitas
• Menghilangkan ko‐metabolit yang tidak
diinginkan
• Memperbaiki penggunaan sumber karbon
dan nitrogen
• Memperbaiki morfologi sel menjadi bentuk
yang lebih baik dalam rangka memudahkan
pemisahan mikroorganisme tsb dengan
produknya
Proses
umum
• Induksi variasi genetik dalam populasi sel
dari mikroorganisme yang dipilih
• Proses Fermentasi dalam skala lab dilakukan
terhadap beberapa individu terpilih dalam
populasi tersebut
• Melakukan analisis (assay) setelah proses
fermentasi tersebut untuk mengidentifikasi
Cara untuk meningkatkan produktivitas
mikroorganisme industri
• Optimasi kondisi lingkungan • Optimasi nutrisi mikroorganisme
• Modifikasi genetik : Mutasi, rekombinasi,
kloning gen
Optimasi
kondisi
lingkungan
• Modifikasi parameter fisika
(suhu, agitasi, dll)
• Modifikasi parameter kimia
(pH, kadar O2, dll)
• Modifikasi parameter biologi (ko‐kultur, enzim, dll)
Optimasi
nutrisi
mikroorganisme
• Sumber karbon • Sumber nitrogen
• Sumber mineral dan sumber nutrisi lain • Penambahan prekursor
• Bantuan enzim
MUTAGENESIS
• Mutagenesis adalah suatu usaha pemuliaan
galur mikroorganisme dengan cara memberi
perlakuan tertentu terhadap sel
mikroorganisme sehingga terjadi perubahan
dalam genotip maupun fenotipnya
• Mutasi yang terjadi dapat terjadi secara
Prosedur
mutagenesis
• Mutasi : fisika, kimia atau kombinasi
keduanya • Fusi protoplas • Rekombinasi • Kloning gen
Mutasi
secara
fisika
Mutagen fisik : • Sinar X (x‐ray)
Pertama kali tahun 1927 dilakukan terhadap lalat buah
(fruit fly)
Terjadi mutasi kromosomal • Sinar Ultra violet (250 – 270 nm)
Tahun 1938 ditemukan bahwa DNA mengabsorpsi uv
pada 260 nm
Terjadi point mutation
Terjadi dimerisasi timin‐timin
Photo‐repair : kembali ke sifat semula akibat sinar • Radioisotop
Langkah
dalam
pelaksanaan
mutasi
fisik
• Biakan murni galur induk disuspensikan dalam larutan
medium
• Jumlah sel dalam medium dihitung dan konsentrasi sel
diatur untuk proses mutasi
• Radiasi dilakukan dalam keadaan terbuka dengan jarak
tertentu selama jangka waktu tertentu pula dalam ruang
gelap yang steril.
• Biakan selanjutnya dibiakkan dalam medium pertumbuhan
dan diinkubasi selama beberapa hari
• Amati pertumbuhan sel dan koloni yang hidup diseleksi
Mutasi kimia
Mutagen
kimia
:
•
Senyawa
analog
basa :
senyawa yang mirip
basa purin atau pirimidin, sehingga terjadi transisi
, misalnya:
5‐bromouracil : mengganti C (cytosine) dengan T
(thymin)
2‐aminopurin : mengganti A (adenine) dengan G
• Senyawa Deaminasi dan pengalkil (alkylating
agent) dapat menyebabkan transisi, misalnya : Nitrit (NaNO2) menyebabkan deaminasi A dan
C sehingga pada proses replikasi pasangan AT
diganti menjadi pasangan GC, atau sebaliknya.
EMS (Etil metil Sulfonat), MNNG (Metil‐nitro‐
nitroso‐guanidine)
•
Senyawa
Interkalasi
pewarna
acridine
(proflavin)
menyisip
(inserted)
di
antara
pasangan
basa,
menyebabkan
pergeseran
(frame
‐
shift)
sehingga
pembacaan
informasi
genetik
menjadi
salah
karena
adanya
sisipan
tersebut
Contoh
Mutasi
Monascus purpureus
menggunakan
EMS
Mutan
albino
Monascus purpureus
yang
FUSI
PROTOPLAS
• Fusi protoplas adalah suatu teknik umum untuk
menginduksi rekombinasi genetik pada beberapa
mikroba prokariot dan eukariot
• Protoplas adalah : seluruh sel tanpa dinding sel • Fusi ini berguna untuk peningkatan produktivitas
mikroba industri, misalnya pada prokariot genera
Actinomycetes.Metode rekombinasi genetik ini
relative mudah karena tidak memerlukan faga
transduksi, faktor plasmid atau pengembangan
kompetensi, namun memerlukan identifikasi
prosedur utk membuat protoplas yang stabil.
• Dalam Fusi protoplas perlu membuat sel‐sel hibrid
yang sehat dari hasil fusi tersebut.
Metode
Fusi
Protoplas
• Protoplas dibuat dengan cara membuang
dinding sel menggunakan enzim lisis di dalam
suatu larutan penstabil osmosis.
• Dengan bantuan larutan PEG (polietilen glikol)
konsentrasi tertentu sebagai senyawa
fusogenik, fusi dapat dilakukan dan akan
terbentuk suatu hibrid antara atau diploid.
• Selama bentuk hibrid ini, genom (atau
kromosom) dari kedua sel yang terfusi atau
saling bercampur dan rekombinasi genetik
akan terjadi.
Fusi
Protoplas
untuk
mikroorganisme
• Untuk prokariot Bacillidan Streptomycetesrekombinasi
terjadi pada frekuensi yang cukup tinggi karena kromosomnya
berada bebas dalam sitoplasma
• Untuk mikroba eukariot fusi protoplas harus diikuti dengan
fusi inti untuk memperoleh rekombinasi yang sesungguhnya • Tahap penting dalam teknik fusi protoplas ini adalah tahap
REGENERASIdari sel yang hidup dari hasil fusi tersebut.
• Fusi protoplas dilakukan untuk spesies yang sama, untuk
menghasilkan galur yang lebih produktif daripada galur
induknya.
Langkah umum fusi protoplas
• Penyiapan sel yang akan difusi
• Pencucian sel menggunakan larutan hipertonik untuk menghasilkan lingkungan yang stabil secara osmotik untuk protoplas
• Sel disentrifuga dan resuspensi dalam medium , lalu ditambahkan enzim lisozim dan diinkubasi pada 37 C selama min.15 menit. terbentuknya protoplas diamati dibawah mikroskop fase kontras.
• Sel dicuci dengan cairan medium , disentrifuga dan diresuspensi dalam medium segar.
• jumlah sel yang akan difusikan dihitung dgn hemositometer
• suspensi sel dari dua galur yang akan difusi dicampur dalam tabung sentrifuga
• Sel disentrifuga , lalu diresuspensi dengan medium segar
• PEG (BM 1000‐6000) ditambahkan dengan konsentrasi antara 40 – 65%
• Campuran tersebut digoyangkan perlahan lalu didiamkan pada suhu kamar selama lebih kurang 1 jam
• Pengenceran terbatas dilakukan untuk proses seleksi sel yang hidup,diinkubasi dan diamati sel hibrid yang terbentuk.
Contoh
Fusi
protoplas
:
Aspergillus terreus
Galur induk 1 Galur induk 2
Fusan (hasil fusi)
Rekayasa
Genetik
(Genetic
Engineering)
• Rekayasa genetik adalah salah satu cara pembuatan DNA
baru, biasanya melalui rekombinasi DNA dari organisme
yang berbeda dan meproduksi banyak kopi dari DNA
rekombinan tersebut melalui proses yang disebut KLONING
• Kloning adalah suatu proses dimana suatu urutan DNA
tertentu disisipkan ke dalam suatu vektor (berupa plasmid
atau kromosom faga) dan selanjutnya direplikasi sebanyak
mungkin. Replikasi terjadi di dalam suatu inang (host) yang
memungkinkan replikasi itu terjadi
Prinsip
mutasi
dengan
rekayasa
genetik
• Informasi genetik yang dituju, diisolasi dari
organisme donor dan dipotong menjadi bagian
tunggal menggunakan enzim restriksi
• Potongan ini digabungkan di dalam suatu DNA
pembawa (vektor) dan selanjutnya bersama vektor
tersebut ditransfer ke dalam suatu sel inang (host) • Sel inang akan bereplikasi dan mensekresi metabolit
yang sesuai dengan informasi genetik yang ditransfer
sebelumnya.
Syarat
untuk
vektor
• Memiliki Selectable markers
(penanda selektif)
• Memiliki Restriction sites
(situs restriksi)
Plasmid
• Plasmid adalah suatu molekul DNA sirkular (BM 106 – 2 x 108) dari bakteri, yang membawa 1‐3% genom sel dan mengkode suatu sifat genetik penting yang
tidak dikode secara normal oleh kromosom bakteri
tersebut
• Sifat yang banyak digunakan : resistensi antibiotik,
produksi antibiotik, degradasi senyawa aromatik,
dll.
Faga
(bakteriofaga)
• suatu sub‐kelompok virus yang menginfeksi bakteri
dengan cara menyisipkan asam nukleat nya ke
dalam bakteri host nya.
• Faga terkecil hanya mengandung 3 gen pengkode ss
RNA
• T4, suatu faga bakteri yang mengandung lebih kurang
60 gen pengkode ds genom DNA faga tersebut
Cosmid
• Cosmid adalah partikel sintetik yang dapat bereplikasi sendiri
• Berasal dari plasmid yang mengandung fragmen lambda‐DNA
(DNA‐λ) yang mengkode urutan cos site (situs pengenalan)
untuk sistem λ yang akan membentuk struktur sirkular. • DNA λ faga ini bereplikasi melalui suatu mekanisme khusus
yaitu rolling circleyang yang selanjutnya membentuk struktur
concatemer (berulang secara linear) setelah disisipkan DNA
asing.
• Bentuk linear ini merupakan substrat untuk reaksi packaging
secara in‐vitro membentuk partikel. Selanjutnya partikel
tersebut digunakan untuk menginfeksi sel inang, dan bentuk
linear cosmid akan membentuk sirkular kembali pada sisi cos
site
Prinsip
kloning
gen
menggunakan
plasmid
E.coli
pBR
322
Plasmid yang mengandung gen resistensi thp ampisilin dan tetrasiklin dipotong pada sisi tetrasiklin dengan enzim restriksi
DNA asing di sisipkan pada plasmid dengan enzim ligase
Plasmid yang telah mengandung DNA asing tsb ditransfer ke dalam sel bakteri
Seleksi sel yang hanya mengandung gen resistensi ampisilin dan DNA asing Pembiakan
Jenis
Mutan
• Mutan Aukosotrof (Auxotrophic mutan) • Mutan Resisten (Resistant)
• Mutan yang sensitif terhadap temperatur • Mutan Konstitutif katabolik
• Mutan Konstitutif anabolik
• Mutan aukosotrofadalah mutan yang tidak dapat
mensintesis suatu molekul organik yang sebenarnya sangat
diperlukan untuk salah satu jalur biosintesis metabolit nya.
Misalnya : nitrat, antibiotik
• Mutan resistenadalah mutan dari organisme yang
sebelumnya sensitif terhadap suatu senyawa
• Mutan yang sensitif terhadap temperatur
adalah mutan dari oraganisme yang semula tidak sensitif
terhadap temperatur
• Mutan yang memiliki enzim konstitutif
katabolik : antiinduksi, limiting factor, dll.
• Mutan yang memiliki enzim konstitutif
anabolik : antimetabolit
Rancangan
tahap
skrining
untuk
proses
mutasi
di
Industri
Tahap Proses Jumlah
1 a.Mutasi biakan induk b.Pembiakan pada agar c.Seleksi koloni
d.Fermentasi
e.Seleksi galur terbaik
a.8 dosis berbeda c.25 dari setiap dosis d.200 galur
e.40 galur 2 a.Pengujian kembali galur
terseleksi (5 replikasi) b.Seleksi galur terbaik
Skrining berikutnya dilakukan utk setiap galur
a.40 x 5 = 200 galur b.8 galur utk metabolit
primer, 40 galur utk metabolit sekunder
