JKD, Vol. 6, No. 2, April 2017 : 1217-1227
AKTIVITAS ANTIVIRAL [6]-GINGEROL TERHADAP VIRUS DENGUE
STUDI EKSPERIMENTAL IN VITRO PADA GALUR SEL A549
Stefanie Natalia Halim1, Edi Dharmana2, Rebriarina Hapsari3
1Mahasiswa Program Studi S-1 Ilmu Kedokteran Umum, Fakultas Kedokteran, Universitas Diponegoro 2 Staf Pengajar Ilmu Parasitologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Diponegoro
3
Staf Pengajar Ilmu Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Diponegoro JL. Prof. H. Soedarto, SH., Tembalang-Semarang 50275, Telp. 02476928010
ABSTRAK
Latar belakang : Virus dengue (DENV) adalah arbovirus yang paling luas tersebar secara geografis. Sampai sekarang belum ada obat antivirus berlisensi yang terbukti efektif untuk menangani kasus infeksi DENV. Akibatnya, pengobatan infeksi DENV saat ini hanya terbatas pada deteksi dini, penggantian cairan, dan terapi simtomatik. Jahe merupakan salah satu jenis tanaman obat yang telah lama dikenal di Indonesia. Gingerol adalah kandungan minyak non
volatile utama dari jahe segar, dengan kandungan terbanyak adalah [6]-gingerol. [6]-gingerol
mempunyai efek inhibisi pada biosintesis asam lemak yang sangat berperan dalam replikasi virus dengue.
Tujuan : Penelitian ini meneliti pengaruh antivirus dari [6]-gingerol, konstituen aktif utama jahe (Zingiber officinale) pada pertumbuhan DENV pada galur sel A549.
Metode : Awalnya, dilakukan cell toxicity assay [6]-gingerol pada galur sel A549 untuk menentukan CC50 [6]-gingerol. Kemudian, sel-sel diinfeksi dengan DENV-1 pada
multiplisitas infeksi = 1 dan dilakukan perlakuan dengan dosis multi-subtoksik dari
[6]-gingerol selama masa inkubasi penuh (full time) dan setelah virus masuk ke sel-sel (after entry). Sel yang terinfeksi diinkubasi dengan [6]-gingerol selama 48 jam. Terakhir, titer virus
ditentukan menggunakan plaque assay.
Hasil : Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian [6]-gingerol pada galur sel A549 yang terinfeksi DENV secara signifikan dapat mengurangi virus titer baik perlakuan full time maupun after entry, IC50 = 0,032 mM pada after entry dan IC50 = 0,038 mM pada full time.
Dengan demikian [6]-gingerol memiliki kemampuan antiviral untuk mengurangi pertumbuhan DENV melalui penghambatan replikasi.
Kesimpulan : [6]-gingerol memiliki aktivitas antivirus potensial terhadap infeksi DENV dan dapat memberikan pendekatan terapi baru untuk infeksi DENV.
Kata kunci : Dengue, [6]-Gingerol, galur sel A549
ABSTRACT
Background : Dengue virus (DENV) is the most geographically widespread arbovirus and a major worldwide public health problem. Until now, there is no licensed antiviral drug available. Consequently, the current treatment for DENV infection is only limited to early detection, fluid replacement, and symptomatic therapy. Therefore antiviral drug should be more effective treatment. Ginger is one of the medicinal plants that have long been known in Indonesia. Gingerol is the main non volatile oil content of fresh ginger. The highest content is [6]-gingerol, which have inhibitory effects on fatty acid biosynthesis is important in dengue virus replication.
Aims : In this study, we investigated the antiviral effect of [6]-gingerol, a major active constituent of ginger (Zingiber officinale), on DENV growth in human lung epithelial carcinoma (A549) cells line.
JKD, Vol. 6, No. 2, April 2017 : 1217-1227
Methods : Initially, we conducted gingerol A549 cells toxicity assay to determine [6]-gingerol’s Cytotoxic Dose (CC50) in A549 cells. Then, we infected the cells with DENV-1 at multiplicity of infection = 1 and treated the cells with multi-subtoxic dose of [6]-Gingerol during whole incubation (Full Time) and after the virus entry to the cells (After Entry). We incubated the infected cells with [6]-gingerol for 48 H and latter, determined virus titer using plaque assay.
Results : Treatment of DENV infected cells with [6]-gingerol could significantly reduce virus titer in both full time and after entry treatment with IC50 = 0.032 mM on After Entry treatment and IC50 = 0.038 mM on Full Time treatment. These results indicate [6]-gingerol has the antiviral ability to reduce DENV growth through replication inhibition.
Conclusion : [6]-gingerol has a potential antiviral activity against DENV infection and could provide a new therapeutic approach for DENV infection.
Keyword: Dengue, [6]-Gingerol, A549 cell
PENDAHULUAN
Virus dengue (DENV) adalah penyebab paling umum dari penyakit arboviral. Menurut World Health Organization (WHO), virus dengue merupakan mosquito-borne viral
disease yang paling cepat penyebarannya di dunia, yang memberikan kontribusi sekitar 50
juta infeksi setiap tahunnya dan mempengaruhi lebih dari 2,5 miliar penduduk yang tinggal di daerah yang berpotensi beresiko untuk demam berdarah. Sebelum tahun 1970, hanya terdapat 9 negara yang mengalami epidemi dengue tingkat yang menghawatirkan, namun sekarang lebih dari 100 negara yang mengalami permasalahan dengue denga tahap yang lebih serius. Setiap tahunnya terdapat sekitar 500.000 orang yang terinfeksi virus dengue harus mendapatkan perawatan yang intensif.1 Di Indonesia, dengue merupakan penyakit yang banyak di jumpai dengan case-fatality rates yang tinggi.2 Sekitar 2,5% dari total penderita virus dengue meninggal dunia.1 Terhitung sejak tahun 1968-2009, WHO mencatat Indonesia sebagai negara dengan kasus demam berdarah dengue (DBD) tertinggi di Asia Tenggara.3 Pada tahun 2014, bulan Januari hingga pertengahan bulan Desember tercatat sebanyak 71.668 kasus DBD di Indonesia, dengan 641 kasus di antaranya meninggal dunia. Namun angka ini telah mengalami penurunan dibandingkan dengan kasus yang tercatat di tahun 2013, terdapat 112.511 kasus DBD dengan 871 kasus di antaranya meninggal dunia.4
DENV adalah virus RNA anggota genus Flavivirus dalam famili Flaviviridae. Ada empat serotipe virus dengue, yaitu DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4,5 dan DENV-5.6 Tahun 2009, klasifikasi kasus dengue mengalami perubahan. WHO mengklasifikasikan dengue sesuai dengan tingkat keparahan: dengue tanpa warning signs, dengue dengan
warning signs, dan severe dengue. Klasifikasi 2009 ini dianggap lebih sensitif dalam
mengklasifikasikan kasus infeksi dengue.7 Sampai sekarang belum ada obat antivirus 1218
JKD, Vol. 6, No. 2, April 2017 : 1217-1227 berlisensi yang terbukti efektif untuk menangani kasus infeksi DENV. Akibatnya, pengobatan infeksi DENV saat ini hanya terbatas pada deteksi dini, penggantian cairan, dan terapi simtomatik.
Adanya kecenderungan masyarakat yang memilih obat herbal daripada obat sintetik dengan alasan bahwa alami lebih sehat dan harga lebih terjangkau8, membuat tanaman obat banyak diteliti. Jahe merupakan salah satu jenis tanaman obat yang telah lama dikenal di Indonesia. Hampir semua wilayah di Indonesia, kecuali Maluku Utara, membudidayakan jahe.9 Kandungan utama dari jahe (Zingiber officinale) adalah [6]-gingerdiol, [6]-gingerol, dan [10]-gingerol.10 Gingerol adalah kandungan minyak non volatile utama dari jahe segar, dengan kandungan terbanyak adalah [6]-gingerol.11 [6]-gingerol mempunyai efek inhibisi pada biosintesis asam lemak yang sangat berperan dalam replikasi virus dengue.12
Diketahui bahwa jahe segar terbukti menghambat proses attachment dan internalisasi dari Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV).13 Efek antiviral jahe segar juga didapatkan pada jenis virus lain, yaitu virus Hepatitis C (HCV). HCV merupakan anggota dari
Hepacivirus dalam famili yang sama dengan DENV, yaitu famili Flaviviridae.5 Lyophilizied
juice dari jahe (Zingiber officinale) dapat menghambat replikasi dari HCV. Penghambatan
replikasi HCV ini melalui penghambatan NS3 protease. Protein ini juga terdapat pada DENV, anggota dari genus Flavivirus dan hampir seluruh replikasi Flavivirus melibatkan protein nonstruktural ini.10
Pada penelitian ini hanya dilihat efek [6]-gingerol pada DENV-1 karena pada tahun 2015 muncul outbreak infeksi virus dengue di Jambi. Pada outbreak tersebut diketahui bawa DENV-1 adalah serotipe yang mendominasi terjadinya outbreak.14
Metode yang digunakan dalam peneltian ini adalah kultur sel dan plaque assay. Replikasi DENV paling efisien terjadi pada galur sel C6/36, Vero, dan A549. Pada penelitian ini sel yang digunakan adalah galur sel A549 (adenocarcinomic human alveolar basal
epithelial cells). Terlepas dari fakta bahwa galur sel A549 berasal dari sel epitel, infeksi
beberapa galur sel manusia dengan DENV-2 menunjukkan keunggulan galur sel A549 untuk mendukung replikasi DENV dibandingkan galur sel lain.15 Selain itu pada galur sel A549 terdeteksi antigen viral di makrofag dan di sel endotel pembuluh darah pada jaringan paru.16
Plaque assay adalah prosedur untuk mengetahui kuantitas virus yang infeksius.17 Plaque yang terbentuk berupa area berwarna lebih gelap yang mengeliling sel. Plaque ini
adalah hasil dari cytopathic effect (CPE) yang ditimbulkan oleh virus. Satuan yang digunakan 1219
JKD, Vol. 6, No. 2, April 2017 : 1217-1227 untuk menghitung sejumlah virus yang menimbulkan plaque adalah plaque-forming unit
(PFU).18
METODE
Penelitian ini dilakukan secara eksperimental in vitro menggunakan galur sel A549. Serotipe DENV yang digunakan adalah DENV-1. Awalnya, dilakukan cell toxicity assay
[6]-gingerol pada galur sel A549 untuk menentukan CC50 [6]-gingerol. Kemudian, sel-sel
diinfeksi dengan DENV-1 pada multiplisitas infeksi = 1 dan dilakukan perlakuan dengan dosis multi-subtoksik dari [6]-gingerol selama masa inkubasi penuh (full time) dan setelah virus masuk ke sel-sel (after entry). Sel yang terinfeksi diinkubasi dengan [6]-gingerol selama 48 jam. Terakhir, titer virus ditentukan menggunakan plaque assay.
HASIL
Cell Toxicity Assay [6]-Gingerol terhadap Galur Sel A549
DMSO 0,1% (vehicle) sebagai pelarut [6]-gingerol tidak mempengaruhi viabilitas sel dibandingkan terhadap kontrol (galur sel A549 + medium). CC50 [6]-gingerol pada durasi inkubasi 24 jam adalah 0,34 mM dan pada durasi inkubasi 48 jam adalah 0,21 mM.
Med ium on ly Vehi cle 0, 1% 0,05 m M 0,1 m M 0,2 m M 0,4 m M 0,5 m M 0 50 100 150 Konsentrasi [6]-Gingerol (mM) V ia b ili ta s S el ( % ) 24 Jam 48 Jam
Gambar 1 Hasil Cell Toxicity Assay
JKD, Vol. 6, No. 2, April 2017 : 1217-1227 (A) 0.0 0.2 0.4 0.6 0 20 40 60 80 100 120 Konsentrasi [6]-Gingerol (mM) V ia b ili ta s S el ( % ) Y = -103.6*X + 84.89 (B) 0.0 0.2 0.4 0.6 0 20 40 60 80 100 120 Konsentrasi [6]-Gingerol (mM) V ia b ili ta s S el ( % ) Y = -161.7*X + 83.74
Gambar 2 Grafik Cell Toxicity Assay pada durasi inkubasi (A) 24 Jam (B) 48 Jam
Viabilitas Galur Sel A549 setelah Perlakuan After Entry dan Full Time
Hasil MTT assay memperlihatkan terjadinya penurunan viabilitas sel pada kontrol (galur sel A549 + medium + DENV-1). Penurunan viabilitas sel juga terjadi pada perlakuan
after entry dan full time (p<0,0001), terutama pada konsentrasi [6]-gingerol 0,2 mM. Namun
pada konsentrasi [6]-gingerol 0,05 mM (post-hoc Tukey’s multiple comparisons test) penurunan viabilitas sel tidak signifikan. Ini berarti viabiltas sel A549 tidak terpengaruhi pada konsentrasi [6]-gingerol 0,05 mM.
JKD, Vol. 6, No. 2, April 2017 : 1217-1227 Med ium only Vehi cle 0, 1% 0.05 mM 0.1 m M 0.2 m M 0 50 100 150 Konsentrasi [6]-Gingerol (mM) V ia b ili ta s S el (% ) Kontrol After Entry Full Time
Gambar 3 Viabilitas sel setelah perlakuan after entry dan full time menunjukkan bahwa
pemberian[6]-gingerol mempengaruhi viabilitas sel A549, terlihat dari grafik after entry dan full time yang mengalami penurunan.
Pengukuran Titer Virus Setelah Perlakuan After Entry dan Full Time
Dari hasil plaque assay, terdapat penurunan titer virus seiring dengan kenaikan konsentrasi [6]-gingerol (p<0,0001). IC50 [6]-gingerol pada perlakuan after entry dan full
time adalah 0,032 mM dan 0,038 mM.
Viru s onl y Vehi cle 0, 1% 0.05 m M 0.1 m M 0.2 m M 0 2 4 6 8 Konsentrasi [6]-Gingerol (mM) T ite r V ir u s (L og o f P F U /m l) After Entry Full Time
Gambar 4 Hasil plaque assay setelah perlakuan after entry dan full time menunjukkan
penurunan titer virus seiring dengan penambahan konsentrasi [6]-gingerol.
JKD, Vol. 6, No. 2, April 2017 : 1217-1227
Gambar 5 Uji One-Way ANOVA titer virus setelah perlakuan (A) after entry dan (B) full time **** **** **** **** **** **** *** *** **** **** **** ** *** (B) (A) P value ** = <0,01 *** = <0,001 **** = <0,0001 *** 1223
JKD, Vol. 6, No. 2, April 2017 : 1217-1227 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0 50 100 150 Konsentrasi [6]-Gingerol (mM) T it er V ir u s (% ) After Entry Full Time 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 -50 0 50 100 150 Konsentrasi [6]-Gingerol (mM) T ite r V ir u s (% ) Y = -410.3*X + 63.64 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 -50 0 50 100 150 Konsentrasi [6]-Gingerol (mM) T ite r V ir u s (% ) Y = -423.3*X + 66.26
Gambar 6 Grafik pengaruh perlakuan (A) after entry dan full time (B) after entry (C) full time terhadap titer virus menunjukkan bahwa titer virus lebih mengalami penurunan pada
perlakuan after entry daripada full time.
DISKUSI
Senyawa [6]-gingerol merupakan suatu zat kimia yang banyak ditemukan pada jahe (Zingiber officinale). Kadar subtoksik [6]-gingerol supaya galur sel A549 tidak mati karena efek dari [6]-gingerol ditentukan terlebih daluhu sebelum melakukan perlakuan. Hasil dari penelitian ini menunjukkan CC50 [6]-gingerol terhadap galur sel A549 pada durasi inkubasi 24 jam dan 48 jam adalah 0,34 mM dan 0,21 mM. Diketahui dari penelitian lain, CC50
[6]-(B)
(C) (A)
JKD, Vol. 6, No. 2, April 2017 : 1217-1227
gingerol terhadap galur sel HepG2 pada durasi inkubasi 24 jam dan 48 jam adalah 0,56 mM
dan 0,42 mM.12 CC50 [6]-gingerol terhadap galur sel A549 lebih rendah dibandingkan terhadap galur sel HepG2.
Viabilitas sel A549 terpengaruhi dengan pemberian berbagai konsentrasi [6]-gingerol, terutama pada konsentrasi 0,2 mM (gambar 15). Hasil tidak sesuai dengan hipotesis. Hal ini dimungkinkan karena konsentrasi [6]-gingerol yang digunakan dalam penelitian ini sangat dekat dengan CC50 [6]-gingerol, 0,34 mM (24 jam) dan 0,21 mM (48 jam). Padahal IC50
[6]-gingerol hanya sebesar 0,032 mM pada perlakuan after entry dan 0,038 mM pada perlakuan full time. Namun demikian, penurunan titer virus pada penelitian ini bukan dikarenakan
kematian sel akibat gingerol, melainkan karena pengaruh kemampuan antiviral [6]-gingerol. Dari data post-hoc Tukey’s multiple comparisons test, penurunan viabilitas sel pada konsentrasi [6]-gingerol 0,05 mM tidak signifikan, baik pada perlakuan after entry maupun
full time. Ini menandakan bahwa konsentrasi [6]-gingerol 0,05 mM tidak mempengaruhi
viabilitas sel. Penurunan viabiltas sel pada grafik kontrol dikarenakan sifat CPE virus yang membuat viabilitas sel akan menurun tanpa perlakuan apapun.
Kandungan [6]-gingerol pada jahe (Zingiber officinale) mempunyai aktivitas antiviral virus dengue pada kultur galur sel A549 yang diinfeksikan DENV. Hasil menunjukkan bahwa dengan penambahan [6]-gingerol, titer virus mengalami penurunan (gambar 16).
After entry melihat kerja [6]-gingerol pada penghambatan replikasi DENV. Full time
melihat kerja [6]-gingerol pada proses perlekatan DENV. Hasil menunjukkan bahwa perlakuan pada after entry mengalami penurunan titer virus yang lebih dari perlakuan full time. IC50 [6]-gingerol terhadap galur sel A549 pada perlakuan after entry dan full time adalah 0,032 mM dan 0,038 mM. Pada konsentrasi 0,05 mM [6]-gingerol didapatkan penurunan titer virus yang lebih pada perlakuan after entry dibandingkan pada perlakuan full time. Ini menunjukkan bahwa [6]-gingerol dapat menghambat virus baik sebelum virus masuk ke dalam sel atau setelah virus masuk ke dalam sel, tetapi [6]-gingerol cenderung lebih menghambat virus pada proses replikasinya (setelah virus masuk ke dalam sel).
Penelitian mengenai pengaruh jahe segar pada hRSV menunjukkan bahwa jahe segar lebih efektif bekerja sebelum inokulasi virus pada galur sel A549.13 Terjadi perbedaan letak keefektifan kerja kemungkinan dikarenakan variabel bebas yang digunakan pada penelitian ini adalah senyawa yang dominan pada jahe segar, yaitu [6]-gingerol bukan jahe segar. Penelitian ini juga melihat pengaruhnya pada DENV bukan pada hRSV.
JKD, Vol. 6, No. 2, April 2017 : 1217-1227 Kelemahan penelitian ini adalah hanya melihat pengaruh [6]-gingerol pada DENV-1, tidak pada semua serotipe. Hal ini dikarenakan keterbatasan waktu peneliti. Selain itu, setelah ditemukan CC50 [6]-gingerol peneliti tidak melakukan uji one way ANOVA terlebih dahulu sehingga tidak diketahui bahwa pada konsentrasi [6]-gingerol 0,1 mM dan 0,2 mM didapatkan penurunan viabilitas sel A549 yang signifikan sehingga selanjutnya perlu diteliti mengapa pada konsentrasi tersebut terdapat penurunan viabilitas sel yang signifikan.
Penelitian ini hanya menunjukkan hasil bahwa [6]-gingerol cenderung lebih efektif menghambat DENV pada proses replikasinya, namun tidak melihat secara spesifik letak kerja dari [6]-gingerol dalam menghambat virus. Maka sebaiknya perlu dinilai juga kadar FASN pada galur sel A549 untuk mengetahui pengaruh [6]-gingerol pada kadar FASN galur sel A549.
Penelitian ini dilakukan in vitro sehingga pengaruh [6]-gingerol pada manusia belum tentu sama. Akan lebih baik bila penelitian dilakukan in vivo pada tikus AG129 agar lebih mendekati terapi adjuvan infeksi virus dengue.
KESIMPULAN
CC50 [6]-gingerol terhadap galur sel A549 pada durasi inkubasi 24 jam dan 48 jam adalah 0,34 mM dan 0,21 mM. Titer virus pada galur sel A549 yang digunakan pada infeksi virus dengue mengalami penurunan seiring dengan penambahan konsentrasi [6]-gingerol. IC50
[6]-gingerol terhadap galur sel A549 pada perlakuan after entry dan full time adalah 0,032
mM dan 0,038 mM.
DAFTAR PUSTAKA
1. WHO. Dengue and Severe Dengue. WHO; 2015 [updated May 2015]; Available from:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs117/en/.
2. WHO. Dengue: Guidelines For Diagnosis, Treatment, Prevention, and Control. 2009. 3. Umar Fahmi Achmadi PS, Supratman Sukowati, Tri Yunis Miko Wahyono, Budi
Haryanto, Sigit Mulyono, dan Andrio Adiwibowo. Demam Berdarah Dengue. Buletin Jendela Epidemiologi. 2010; 2.
4. Indonesia KKR. Demam Berdarah Biasanya Mulai Meningkat di Januari. 2015; Available from: http://www.depkes.go.id/article/view/15011700003/demam-berdarah-biasanya-mulai-meningkat-di-januari.html.
5. Levinson W. Review of Medical Microbiology & Immunology, Eleventh Edition. United States of America: The McGraw-Hill Companies, Inc.; 2010.
JKD, Vol. 6, No. 2, April 2017 : 1217-1227 6. Lt Col M.S. Mustafa CVR, Col S. Jain, Lt Col V. Gupta. Discovery of fifth serotype of dengue virus (DENV-5): A new public health dilemma in dengue control. Medical Journal Armed Forces India. 2014; 71.
7. Hadinegoro SRS. The Revised Who Dengue Case Classification: Does The System Need To Be Modified? Paediatrics and International Child Health. 2012; 32.
8. WHO. WHO Traditional Medicine Strategy : 2014-2023. 2013.
9. Pribadi ER. Usahatani Dan Pemasaran Jahe. Status Teknologi Hasil Penelitian Jahe. 10. Hala El-Adawi ME-DaAAE-W. Some Medicinal Plant Extracts Exhibit Potency Against
Viral Hepatitis C. Journal of Bioscience And Technology. 2011; 2.
11. Suzanna M. Zick ZD, Mack T. Ruffin, Amie J. Litzinger, Daniel P. Normolle, Sara Alrawi, Meihua Rose Feng, and Dean E. Brenner. Pharmacokinetics of 6-Gingerol, 8-Gingerol, 10-Gingerol, and 6-Shogaol and Conjugate Metabolites in HealthyHumanSubjects. Cancer Epidemiol Biomarkers 2008.
12. Hathaichanok Impheng LR, Dumrongsak Pekthong, C Norman Scholfield, Sutatip Pongcharoen, Ittipon Pungpetchara, Piyarat Srisawang. [6]-Gingerol Inhibits De Novo Fatty Acid Synthesis and Carnitine Palmitoyltransferase-1 Activity which Triggers Apoptosis in Hepg2. Am J Cancer Res. 2015; 5:1319-36.
13. Jung San Chang KCW, Chia Feng Yeh, Den En Shieh, Lien Chai Chiang. Fresh ginger (Zingiber officinale) has anti-viral activity against human respiratory syncytial virus in human respiratory tract cell lines. Journal of Ethnopharmacology 2013.
14. Sotianingsih Haryanto RFH, Benediktus Yohan, Lanceria Sijabat, Ifo F. Sihite, Sukmal Fahri, Febrina Meutiawati, Jonathan A.N. Halim, Stefanie N. Halim, Amin Soebandrio, R. Tedjo Sasmono. The Molecular and Clinical Features of Dengue During Outbreak In Jambi, Indonesia In 2015. Pathogens and Global Health. 2016.
15. B. Yohan RIK, K. Mutia, A. Bowolaksono, A. R. Harahap, R. Tedjo Sasmono. Growth Characteristics and Cytokine/Chemokine Induction Profiles of Dengue Viruses in Various Cell Lines. Acta virologica. 2014; 58:20-7.
16. Kala Jessie MYF, Shamala Devi, Sai Kit Lam, and K. Thong Wong. Localization of Dengue Virus in Naturally Infected Human Tissues, by Immunohistochemistry and In Situ Hybridization. The Journal of Infectious Diseases. 2004; 189:1411-18.
17. Racaniello V. Detecting Viruses: The Plaque Assay. 2009; Available from:
http://www.virology.ws/2009/07/06/detecting-viruses-the-plaque-assay/.
18. Virapur. Virus Plaque Assay Protocol: Available from:
http://www.virapur.com/protocols/Virus Plaque Assay Protocol.pdf.
![Gambar 4 Hasil plaque assay setelah perlakuan after entry dan full time menunjukkan penurunan titer virus seiring dengan penambahan konsentrasi [6]-gingerol](https://thumb-ap.123doks.com/thumbv2/123dok/4334315.2918371/6.892.270.559.715.963/gambar-setelah-perlakuan-menunjukkan-penurunan-penambahan-konsentrasi-gingerol.webp)
