AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI GELATIN TULANG IKAN PATIN
BERAT MOLEKUL TINGGI TERHADAP
ENZIM DIPEPTIDYL PEPTIDASE-IV
SKRIPSI
SELAWATI
15106015
PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS BIOINDUSTRI
UNIVERSITAS TRILOGI
JAKARTA
ii
AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI GELATIN TULANG IKAN PATIN
BERAT MOLEKUL TINGGI TERHADAP
ENZIM DIPEPTIDYL PEPTIDASE-IV
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Teknologi Pangan
Pada
Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan
SELAWATI
15106015
PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS BIOINDUSTRI
UNIVERSITAS TRILOGI
JAKARTA
vi
ABSTRAK
Selawati. Aktivitas Inhibisi Fraksi Gelatin Tulang Ikan Patin Berat Molekul Tinggi Terhadap Enzim Dipeptidyl Peptidase-IV. Dibimbing oleh Yoni Atma, 2020.
Gelatin adalah bahan pendukung dalam industri pangan, farmasi dan kosmetika. Gelatin digunakan sebagai pengemulsi dan penstabil. Sumber alternatif gelatin yang paling potensial adalah yang berasal dari limbah produk pengolahan ikan terutama kulit dan tulang. Salah satu ikan yang menghasilkan limbah tulang dalam kuantitas besar yakni ikan patin. Gelatin dari tulang ikan dapat dihidrolisis lebih lanjut menjadi hidrolisat-hidrolisat gelatin yang memiliki bioaktivitas tinggi. Hidrolisat gelatin diperoleh dari hasil hidrolisis gelatin secara enzimatik dengan memanfaatkan enzim protease. Flavourzyme merupakan enzim komersil yang banyak digunakan pada pembuatan hidrolisat gelatin ikan. Penelitian ini bertujuan untuk menguji aktivitas antidiabetes fraksi hidrolisat gelatin tulang ikan patin. Penelitian diawali dengan mengekstraksi gelatin tulang ikan patin yang dilanjutkan dengan hidrolisis enzimatik menggunakan 3% enzim flavourzyme. Setelah itu, hidrolisat dipisahkan dengan ultrafiltrasi kombinasi sentrifugasi 4000 rpm. Fraksi > 3kDa yang diperoleh dimurnikan menggunakan kolom kromatografi yang mengandung gel filtrasi fase diam sephadex G-25. Analisis meliputi aktivitas inhibisi terhadap enzim DPP-IV, uji kadar protein, bobot aktivitas dan konsentrasi hambat setengah maksimal (IC50). Hasil
penelitian menunjukkan bahwa fraksi dengan berat molekul tinggi yang dimurnikan dengan kolom gel filtrasi memiliki aktivitas penghambatan terhadap Dipeptidyl Peptidase-IV sebesar 51,53% -67,86%. Fraksi ini memiliki kandungan protein 0,04 mg/mL–0,23 mg/mL. Dan bobot aktivitas 1170 sampai 268. IC50 dari hidrolisat gelatin tulang ikan
dengan berat molekul tinggi sekitar 0.0142 mg/mL.
vii
ABSTRACT
Selawati. Inhibitory Activity of High Molecular Weight Fractions Derived From Bone of Pangasius Catfish Gelatin Hydrolysate Toward Dipeptidyl Peptidase-IV. Supervised by Yoni Atma, 2020.
Gelatin is biomaterial used in food, medicine and cosmetic industries. The main faction function of gelatin is as an emulsifier and stabilizer. The most potential alternative source of gelatin is coming from fish processing by products especially skin and bone. Pangasius catfish is one of fish that remain bone in large quantity during their filleting process. Previously, gelatin from fish bones were hydrolyzed into gelatin hydrolysates which have bioactivities. Gelatin hydrolysates obtained through of enzymatic hydrolysis by protease action. Flavourzyme was used widely in order to produce fish gelatin hydrolysates. In this study was measured the anti-diabetic bioactivity of fish gelatin fractions from bone of pangasius sutchi. The research was began by extracting gelatin from bone of fish, then followed by enzymatic hydrolysis using flavourzyme at enzyme substrate ratio of 3%. After that, the hydrolysates separated by ultrafiltration coupled with centrifugation 4000 rpm. The > 3kDa fraction which obtained was purified using chromatography column contained stationary phase gel filtration (sephadex G-25). The analysis covering inhibitory activity, protein content, value activity and the half maximal inhibitory concentration (IC50). The result shows that high molecular weight fractions which purified by gel filtration have inhibitory activity rage against dipeptidyl peptidase-IV around 51.53%-67.86%. They have protein content 0.04 mg/mL–0.23 mg/mL. And value activity 1170-268. The IC50 of high molecular weight fish bone gelatin hydrolisate was 0.0142 mg/mL.
viii
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah dengan judul “Aktivitas Inhibisi Fraksi Gelatin Tulang Ikan Patin Berat Molekul Tinggi Terhadap Enzim Dipeptidyl Peptidase-IV” berhasil diselesaikan. Skripsi disusun sebagai syarat untuk menyelesaikan pendidikan dan memperoleh gelar Sarjana Teknologi Pertanian pada Program Studi Teknologi Pangan Universitas Trilogi.
Terselesaikannya skripsi ini tidak terlepas dari bantuan banyak pihak, sehingga pada kesempatan ini dengan segala kerendahan hati dan penuh rasa hormat penulis menghaturkan terima kasih yang sebesar-besarnya bagi semua pihak yang telah memberikan bantuan dalam penyusunan skripsi ini hingga selesai, terimakasih kepada :
1. Bapak Yoni Atma, S.TP., M.Si selaku Dosen Pembimbing yang telah membimbing dan memberikan arahan, waktu, tenaga dan kontribusi selama pelaksanaan penelitian dan penyelesaian proposal skripsi ini.
2. Kedua orang tua saya tercinta Ibu Hj. Etty Mulyati dan Bapak H. Armansyah serta kakak, yang telah banyak mendoakan penulis dan memberi dukungan baik segi moril maupun material.
3. Sahabat (Serendipity) Dita, Stephanie, Angel, Thasya, Dian dan Intan serta team gelatin (Dita, Yusinta, Dhea, dan Joshua) yang selalu memberikan dukungan, saran dan mendengarkan keluh kesah selama penelitian maupun penulisan skripsi ini. 4. Kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian skripsi ini yang
tidak dapat disebutkan satu per satu.
Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini masih jauh dari kata memuaskan, maka diharapkan adanya saran untuk memperbaiki dan mengembangkannya. Akhir kata, semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi semua pihak.
Jakarta, Februari 2020
ix
DAFTAR ISI
ABSTRAK vi DAFTAR ISI ix DAFTAR TABEL xi DAFTAR GAMBAR xi DAFTAR LAMPIRAN xi PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 Tujuan Penelitian 3 TINJAUAN PUSTAKA 4 Gelatin 4 Hidrolisat Gelatin 5Ultrafiltrasi dan Kromatografi Kolom Gel Filtrasi 6 Inhibitor Dipeptidyl Peptidase-IV (DPP-IV) 7
METODOLOGI 8
Waktu dan Tempat 8
Bahan dan Alat 8
Metode Penelitian 8
Persiapan Ekstraksi Gelatin Kasar 9
Hidrolisis Enzimatik 10
Ultrafitrasi 10
Kromatografi Gel Filtrasi 10
Metode Analisis 12
Aktivitas Inhibisi DPP-IV 12
Penentuan Kadar Protein 12
Bobot Aktivitas 13
Penentuan IC50 13
Analisis Data 13
HASIL DAN PEMBAHASAN 14
Ekstraksi Gelatin 14
Hasil Ultrafiltrasi dan Fraksi Kromatografi Filtrasi Gel 15 Aktivitas Inhibisi Enzim Dipeptidyl Peptidase- IV (DPP-IV) 17
x Bobot Aktivitas dan Aktivitas Penghambatan 50 persen (IC50) 19
PENUTUP 22 Kesimpulan 22 Saran 22 DAFTAR PUSTAKA 23 LAMPIRAN 27 RIWAYAT HIDUP 31
xi
DAFTAR TABEL
Tabel 1 Sifat Gelatin Berdasarkan Cara Pembuatannya 4
Tabel 2 Standar Mutu Gelatin 5
Tabel 3 Aktivitas spesifik enzim 19
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1 Diagram alir untuk mendapatkan fraksi ultrafiltrasi 8 Gambar 2 Diagram alir kromatografi filtrasi gel 11 Gambar 3 Ekstrak gelatin dengan penambahan enzim flavourzyme 3% 14
Gambar 4 fraksi >3 kDa 15
Gambar 5 Pola protein fraksi hidrolisat gelatin berat molekul tinggi setelah dimurnikan dengan kolom gel filtrasi
16
Gambar 6 Grafik aktivitas inhibisi 17 Gambar 7 Kadar Protein Gelatin Tulang Ikan Patin 18 Gambar 8 Bobot Aktivitas Penghambatan DPP-IV 19
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Tabel Kadar Protein dan Kurva Standar BSA (Bovine Serum Albumin)
27
Lampiran 2 Kurva Standar BSA 28
Lampiran 3 Hasil Analisis Statistik Uji Protein 29 Lampiran 4 Hasil Analisis Statistik Aktivitas Inhibisi 30
PURIFIKASI FRAKSI GEL FILTRASI GELATIN
TULANG IKAN PATIN DENGAN HIGH PERFORMANCE
LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) UNTUK
IDENTIFIKASI PEPTIDA BIOAKTIF
SKRIPSI
DHEANISYA QAUSARINA AIDA
15106026
PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS BIOINDUSTRI
UNIVERSITAS TRILOGI
JAKARTA
ii
PURIFIKASI FRAKSI GEL FILTRASI GELATIN
TULANG IKAN PATIN DENGAN HIGH PERFORMANCE
LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) UNTUK
IDENTIFIKASI PEPTIDA BIOAKTIF
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Teknologi Pertanian
Pada
Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan
DHEANISYA QAUSARINA AIDA
15106026
PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS BIOINDUSTRI
UNIVERSITAS TRILOGI
JAKARTA
iii
Judul Skripsi : Purifikasi Fraksi Gel Filtrasi Gelatin Tulang Ikan Patin
dengan High Performance Liquid Chromatogrphy (HPLC) untuk Identifikasi Peptida Bioaktif
Nama : Dheanisya Qausarina Aida
NIM : 15106026
Penguji: Dr. M. Rizal Taufikurrahman, M.Si dan Hermawan Seftiono, S.Si., M.Si Tanggal Lulus: 7 Februari 2020
vi
ABSTRAK
Dheanisya Qausarina Aida. Purifikasi Fraksi Gel Filtrasi Gelatin Tulang Ikan Patin dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) untuk Identifikasi Peptida Bioaktif. Dibimbing oleh Yoni Atma dan Apon Zaenal Mustopa, 2020.
Penelitian ini mengenai purifikasi fraksi gel filtrasi gelatin tulang ikan patin menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) dan uji aktivitasnya dalam menghambat enzim dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV). Tujuannya ialah untuk mengetahui aktivitas penghambatan dari fraksi gel filtrasi yang dimurnikan dengan metode High Performance Liquid Chromatography preparatif. Penelitian terdiri atas empat tahapan yaitu (1) separasi fraksi hidrolisat dari hasil hidrolisis 3% flavourzyme (rasio enzim:substrat [E/S]) dengan gel filtrasi, (2) purifikasi fraksi gel filtrasi terpilih dengan HPLC, (3) uji aktivitas penghambatan, (4) uji kadar protein dan IC50 (Inhibitory Concentration of 50%). Hasil pemurnian dengan HPLC didapatkan dua puncak utama pada menit ke-3.1 dan 4.07. Hasil uji aktivitas penghambatan oleh ketujuh fraksi HPLC berada di bawah 30%, fraksi HPLC 3 dan 4 sebagai puncak utama memiliki aktivitas penghambatan lebih rendah daripada fraksi HPLC 1, 2, dan 5. Aktivitas penghambatan tertinggi ada pada fraksi HPLC 1 sebesar 26.50%. Hasil uji kadar protein menunjukkan antara sampel fraksi gel filtrasi dengan fraksi HPLC memiliki perbedaan sangat nyata (p<0.05). Kadar protein tertinggi sebesar 1.57 mg/ml pada sampel 3% F4, dan terendah sebesar 0.13 mg/ml pada sampel fraksi HPLC 1. Hasil pengukuran aktivitas spesifik enzim menunjukkan nilai bobot tertinggi ada pada fraksi HPLC 1 sebesar 203.85 kemudian diikuti oleh fraksi HPLC 2 sebesar 101.61, untuk nilai bobot terendah sebesar 5.29 pada sampel 3% fraksi 1. Hasil pengukuran IC50 pada sampel fraksi gel filtrasi diperoleh sebesar 1.03 mg/ml, dan pada sampel fraksi HPLC sebesar 0.33 mg/ml.
vii
ABSTRACT
Dheanisya Qausarina Aida. Purification of gel filtration fraction of fish bone gelatin from Pangasius catfish using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) for identification a bioactive peptide. Supervised by Yoni Atma and Apon Zaenal Mustopa, 2020.
This study aims to purify of gel filtration fraction of fish bone gelatin from Pangasius catfish using High Performance Liquid Chromatography (HPLC), and measured their activities against dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV). Purification stage was done by HPLC preparative equipment. The research conducted in four stages including (1) hydrolysate >3 kDa (from 3% [E/S] ratio) separation through gel filtration chromatography, (2) purification of selected gel filtration fraction, (3) activity measurement, (4) protein content and IC50 determination. The result shown that HPLC purification provide two main peaks at time retention of 3.1 and 4.07 minutes. All of purification fractions was below 30%, while fraction 3 and 4 (at retention time 3.01 and 4.075) have inhibitory activity lower than fractions 1, 2, and 5. The highest inhibitory activity from HPLC fraction was 26.50%. It is come from fraction 1 (F1) (at retention time of 1.55 minutes). In addition the protein content both of fraction; gel filtration and HPLC were significant different (p<0.05). The highest protein content was from fraction 4 of HPLC which about 1.57 mg/ml, while the lower ones was from fraction 1 with concentration of 0.13 mg/ml. In addition, the activity value was also measured by dividing percent inhibition with protein concentration. In this research, the highest activity value was F1, F2, and the lower was F5 namely 203.85, 101.61, and 5.29 respectively. The IC50 from gel filtration and HPLC fraction were 1.03 mg/ml and 0.33 mg/ml respectively.
viii
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah Subhanahu Wata’ala atas segala rahmat dan karunia-Nya, sehingga dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul “Purifikasi Fraksi Gel Filtrasi Gelatin Tulang Ikan Patin dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) untuk Identifikasi Peptida Bioaktif”. Sholawat beserta salam penulis panjatkan untuk Rasulullah Muhammad Salallahu ‘Alaihi Wasalam. Karya ilmiah ini disusun sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Teknologi Pertanian pada Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan, Universitas Trilogi.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Yoni Atma, S.TP., M.Si dan Bapak Dr. Apon Zaenal Mustopa., M.Si selaku pembimbing atas bimbingan, waktu, tenaga, saran, dan kontribusinya yang luar biasa terhadap penyelesaian karya ilmiah ini. Penghargaan dan ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada kedua orang tua, abang Eiryl, Kak Evan Prasetya selaku laboran di Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan, seluruh teman dan pegawai di Laboratorium RGTDP, teman halaqoh, teman sebimbingan (Sella, Dita, Yusi, Josua), seluruh kawan di Fakultas Bioindustri khususnya Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan angkatan 2015, Anggun, Dina, serta Khairia atas doa, kerjasama, dan dukungannya selama penelitian.
Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini masih jauh dari kata memuaskan, maka diharapkan adanya masukan serta saran untuk memperbaiki dan mengembangkannya. Akhir kata, semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi yang membutuhkannya.
Jakarta, Februari 2020
ix
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI ix DAFTAR TABEL x DAFTAR GAMBAR x DAFTAR LAMPIRAN x PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 Tujuan 2 TINJAUAN PUSTAKA 3Gelatin Tulang Ikan 3
Fraksi Gel Filtrasi Gelatin sebagai Antidiabetes 5
Purifikasi 7
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 8 Pengukuran Konsentrasi Protein 9
Peptida Bioaktif 10
METODOLOGI 11
Waktu dan Tempat Pelaksanaan 11
Bahan dan Alat 11
Rancangan Percobaan dan Analisis Data 11
Metode Penelitian 12
Kromatografi Gel Filtrasi 12 Purifikasi Protein Fraksi Gel Filtrasi Gelatin Tulang Ikan Patin
menggunakan High Performance Liquid Chromatography 13 Uji Aktivitas Inhibisi terhadap DPP-IV (dipeptydil peptidase-IV) 13 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Bradford 14 Pengukuran Aktivitas Spesifik 14
Penentuan Nilai IC50 14
HASIL DAN PEMBAHASAN 15
Purifikasi Protein 15
Uji Aktivitas Inhibisi terhadap DPP-IV (dipeptydil peptidase-IV) 18 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Bradford 19
SIMPULAN DAN SARAN 23
Simpulan 23
Saran 23
DAFTAR PUSTAKA 24
LAMPIRAN 29
x
DAFTAR TABEL
Tabel 1 Sumber Peptida Bioaktif 10
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1 Skema Alur Penelitian 12 Gambar 2 Kromatogram dari Kolom Filtrasi Gel dengan Matriks
Sephadex G-25 15
Gambar 3 Aktivitas Penghambatan Enzim DPP-IV oleh Fraksi Gel Filtrasi 16 Gambar 4 Kromatogram dari Kolom HPLC C-18 17 Gambar 5 Ketujuh Fraksi HPLC Hasil Koleksi dengan Waktu Retensi,
Luas Area Puncak, dan Konsentrasi Protein Berbeda 18 Gambar 6 Aktivitas Penghambatan Enzim DPP-IV oleh Fraksi HPLC dan
Fase Gerak 19
Gambar 7 Kadar Protein pada Sampel Fraksi Gel Filtrasi dan Fraksi HPLC 20 Gambar 8 Aktivitas Spesifik Enzim pada Sampel Fraksi Gel Filtrasi dan
Fraksi HPLC 21
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Kurva Standar BSA dan Kadar Proteinnya 29 Lampiran 2 Kurva Regresi IC50 Sampel Fraksi Gel Filtrasi 30 Lampiran 3 Kurva Regresi IC50 Sampel Fraksi HPLC 31 Lampiran 4 Analisis Ragam ANOVA dan Uji Duncan 32 Lampiran 5 Dokumentasi Penelitian 34
