Identifikasi Growth Differentiation Factor-9 (GDF-9) Pada Oosit Sapi Yang Dimaturasi Secara In Vitro Dengan
Metode Elektroforesis
(Identification of Growth Differentiation Factor-9 (GDF-9) from Bovine Oocytes in Vitro Maturation with Elektroforesis Method)
Widjiati, Epy. M. L. 1), Zaenal. Mustakim2), Lianny Nangoi3) Fakultas Kedokteran Hewan Unair
Kampus C Unair, Jl. Mulyorejo Surabaya 60115 Email : [email protected]
ABSTRACT
The aim of this research was to identification of protein Growth Differentiation Factor-9 (GDF-9) isolated from oocytes dominant follicles in in vitro maturation. Bovine ovary obtained from a slaughterhouse was aspired in its ovary dominant follicles. The oocytes were matured in Tissue Culture Medium 199 (TCM 199) then culture for 22 hours at 38,5 ºC in incubator CO2. Twenty two hours after being culture, the GDF-9 protein identification were examined using Sodium Dodecyl Sulphonate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE). Several protein fractions were obtained from the result of research. Based on calculation of regression equation resulting from protein marker to determine the molecular weight of GDF-9 protein. Eight protein fractions were determined, they are : 177 kDa, 137 kDa, 100 kDa, 73 kDa, 51 kDa, 41 kDa, 38 kDa, 27 kDa, 20 kDa. Protein appearing in the protein band the molecular weight of 51 kDa was identified as GDF-9 protein playing role in maturation process.
Key word : GDF-9, oocyte, maturation, SDS PAGE
PENDAHULUAN
Dalam rangka meningkatkan produk-tivitas ternak, banyak teknik yang di-kembangkan. Salah satu cara untuk meningkatkan produktivitas ternak tersebut adalah dengan In Vitro Fertilitation (IVF). Namun kendala yang dialami saat ini adalah tingkat ke-berhasilan IVF masih belum mampu memproduksi embrio in vitro dengan kualitas optimum. Masalah tersebut perlu dikaji secara molekuler reproduksi, mengingat pada proses maturasi oosit banyak protein diduga berperan dan sampai saat ini sintesis dan fungsi protein tersebut secara molekuler masih belum banyak diketahui (Pawshe et al., 1996).
Selain hormon ternyata diketahui ada peran growth factor selama proses
maturasi oosit. Oleh karena itu, selama proses maturasi banyak protein yang berperan dalam proses pematangan oosit seperti; Insulin-like Growth Factor (IGF), IGF-Binding Protein (IGFBP), Epidermal Growth Factor (EGF), Transforming Growth Factor Alfa (TGFα), Transform-ing Growth Factor Beta (TGFβ), Growth Differentiation Factor-9 (GDF-9). Sampai saat ini sintesis dan fungsi protein tesebut secara molekuler masih belum banyak diketahui (Widjiati dan Rimayanti, 2002).
Growth Factor merupakan faktor lokal berperan dalam peningkatan proliferasi dan diferensiasi sel granulosa, sehingga menyebabkan terjadinya ekspansi kumulus, peran sesungguhnya dari faktor lokal oosit ini belum banyak dikaji secara mendalam. Oleh karena itu,
Jurnal Ilmu Peternakan, Desember 2008, hal. 64 – 71 Vol. 3 No.2 ISSN 1907 – 2821
penting untuk mengetahui peran sitokin ini dalam proses folikulogenesis dan maturasi oosit (Widjiati, 2007). Growth factor mempunyai pengaruh penting dalam meningkatkan sekresi protein pada cairan folikel, hal ini disebabkan karena growth factor berperan dalam ningkatkan transpor asam amino me-lintasi membran sel serta meningkatkan pengikatan asam-asam amino sehingga membentuk protein (Frandson, 1992).
Growth Differentiation Factor-9 (GDF-9) merupakan salah satu growth factor yang mempengaruhi berbagai fungsi sel ovari termasuk sintesis DNA pada membrane sel granulosa dan proses penurunan cAMP sehingga proses meiosis dapat belangsung (Vitt et al., 2002). Growth Differentiation Factor-9 juga berfungsi sebagai regulator pada pertumbuhan dan diferensiasi pada jaringan embrional maupun jaringan dewasa. Growth Differentiation Factor-9 disintesis oleh sel somatik ovum yang secara langsung berefek pada per-tumbuhan dan fungsi oosit. Keberadaan dan peran GDF-9 pada oosit sangat dibutuhkan pada proses maturasi dan folikulogenesis ovarium.
Growth Differentiation Factor-9 (GDF-9) adalah suatu glikoprotein yang termasuk dalam Subfamili dari (TGF-β) yang disekresi oleh oosit dengan berat molekul 51kDa. Seperti ligan-ligan family Transforming Growth Factor-β (TGF-β) lainnya, ligan GDF-9 diketahui berhubungan dengan serine kinase. Growth Differentiation Factor-9 mem-punyai kemampuan untuk merangsang proliferasi sel granulosa dan menghambat diferensinya.
Growth Differentiation Factor-9 berperan dalam proses pematangan sel telur yang merupakan ligan spesifik reseptor TGF-β. Sekresi GDF-9 akan memacu sekresi TGF-β sehingga akan menghalangi tranfer cAMP dari
granulosa ke oosit akibatnya cAMP dalam oosit turun dan proses maturasi dapat berjalan. Kekurangan GDF-9 akan mengganggu proses pematangan sel telur.
Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui profil GDF-9 yang selama proses maturasi, karena sangat mempengaruhi kualitas oosit sebagai bank oosit untuk sumber produksi embrio yang dihasilkan secara in vitro.
MATERI DAN METODE
Penelitian ini dilakukan kurang lebih selama tiga bulan mulai bulan Juli-September 2007 di laboratorium In Vitro Fertilitation (IVF) Fakultas Kedokteran Hewan Unair dan laboratorium Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Brawijaya.
Bahan penelitian
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah ovarium sapi yang di peroleh dari Rumah Potong Hewan. Media kimia yang diperlukan antara lain : Tissue Culture Media 199 (TCM-199), NaCl fisiologis dan Diionized Water (DW), Gentamisin Sulfat, Glutamin, Follicle Stimulating Hormone (FSH), Luteinizing Hormone (LH), Mineral Oil, Bovine Serum Albumin (BSA), Phosphat Buffer Salin (PBS).
Alat penelitian
Alat yang digunakan untuk penelitian ini antara lain adalah : gunting, pinset, spuite disposible 5 cc, jarum ukuran 18 G, cawan petri disposible, erlemeyer, pipet pasteur, pipet ependorf, tabung ependrof, alat centrifuge, freezer, incubator CO2, gelas ukur, mikroskop
inverted, refrigerator, elektroforesis, elektro buffer.
Tahapan Penelitian Koleksi Oosit
Ovarium sapi yang diperoleh dari Rumah Potong Hewan (RPH). Oosit diambil secara aspirasi dengan meng-gunakan jarum ukuran 18 G yang di-hubungkan dengan spuit 5 ml berisi 1 ml TCM. Pengambilan sampel oosit ber-dasarkan diameter permukaan, yaitu folikel dominan dengan ukuran 6-8 mm.
Maturasi Oosit
Untuk proses maturasi oosit diper-gunakan Tissue Culture Medium 199 (TCM 199). Sepuluh sampai dua puluh oosit berdasarkan ukurannya dikultur dalam 100 ul medium tetes dan ditutup dengan mineral oil. Pematangan oosit dilakukan pada suhu 38,5ºC didalam inkubator CO2 5% selama 22 jam
(Pawshe et al., 1996).
Isolasi Protein Oosit yang telah dimaturasi
Isolasi protein yang dilakukan adalah sebagai berikut : sampel oosit yang telah dikoleksi diambil sebanyak 200µL ditambah larutan Phospate Buffer Saline Tween (PBST) yang mengandung 0.05 M Phenyl Metil Sulfonil Flouride (PMSF) sampai lima kali volume sampel. Sampel oosit yang telah diencerkan kemudian dilakukan sonifikasi selama 10 menit dan dilanjutkan dengan sentrifugasi 10.000 rpm pada suhu 4°C selama 15 menit untuk memisahkan antara endapan dan supernatan. Supernatan yang dihasilkan ditambahkan etanol absolut dengan perbandingan 1:1, kemudian dimasukkan ke dalam refrigerator selama 12 jam.
Selanjutnya disentrifugasi 6000 rpm pada suhu 4ºC selama 10 menit untuk memisahkan endapan dan supernatan. Endapan yang diperoleh dimasukkan ke
dalam freezer selama lima menit. Endapan yang dihasilkan tersebut kemudian ditambah Tris Cl 50µL dan disimpan di freezer sebelum digunakan sebagai bahan isolat Fraksi Protein Oosit.
Preperasi Protein Growth Differention Factor 9 dengan SDS PAGE
Elektroforesis adalah gerakan partikel (koloid) yang bermuatan listrik melalui suatu gel karena pengaruh medan listrik (Aulanni‟am, 2004). Elektroforesis ini dapat digunakan untuk menentukan titik isoelektrik dan berat molekul dari protein. Sampel protein yang berasal dari oosit ditambah dengan larutan buffer kemudian disimpan pada suhu - 10ºC. Selanjutnya menyiapkan separating gel pada alat SDS-PAGE yaitu memasukan larutan gel ke dalam alat pembentuk gel menggunakan pipet. Tambahkan butanol kurang lebih 1ml dan biarkan selama 30 menit dan keluarkan comb.
Sampel protein 10-20 µL dimasukan ke dalam lubang cetakan pada stacking gel. Selanjutnya plate yang telah berisi sampel dimasukan ke alat biorab dan anoda dihubungkan pada reservoir bawah dan katoda dihubungkan pada reservoir atas. Power supply dihubungkan dengan arus listrik 30 mA.
Tahap pewarnaan yang dipakai ada-lah larutan staining diletakkan dalam cawan petri dan ditunggu dalam lima menit sambil digoyangkan sampai terlihat warna.
Tahap pencucian menggunakan larut-an destaining yang membutuhkan waktu lebih lama yaitu sampai jel terlihat jernih. Kemudian hasil elektroforesis difoto atau discan.
HASIL PENELITIAN
Hasil identifikasi protein GDF-9 dari oosit sapi yang telah dimaturasi dilakukan dengan metode SDS-PAGE,
sehingga didapatkan hasil yang dinyata-kan dalam satuan berat molekul yaitu kDa. Hasil SDS-PAGE ditampilkan dengan pewarnaan commasie blue R-250.
Gambar 1. Hasil analisis protein dengan metode SDS-PAGE. Keterangan :
A : sebelum pemurnian protein. B : setelah pemurnian protein.
S : sampel berasal dari oosit sapi yang dikoleksi dari dominan folikel. M : marker.
Menurut Aulanni‟am (2004), penentuan molekul relatif dilakukan dengan bantuan protein standar (marker). Untuk menentukan molekul relatif protein dilakukan dengan menghitung
nilai Retardation Factor (Rf) dari masing-masing pita dengan rumus :
Jarak pergerakan protein dari tempat awal Rf =
Jarak peergerakan warna dari tempat awal
170 130 95 72 55 43 34 26 17
S
S
M
170 130 95 72 55 43 34 26 17M
A BS
Tabel 1. Penghitungan persamaan regresi protein marker.
No Marker
A B Rf Mr marker (log Y Da) Mr marker (kDa)
1 15,9 mm 118 mm 0,134 5,2304 170 2 22,3 mm 118 mm 0,188 5,1139 130 3 31 mm 118 mm 0,263 4,9777 95 4 40,5 mm 118 mm 0,343 4.8573 72 5 52 mm 118 mm 0,441 4,7404 55 6 66 mm 118 mm 0,559 4,6335 43 7 83 mm 118 mm 0,703 4,5315 34 8 98 mm 118 mm 0,8305 4,4150 26 9 118 mm 118 mm 1 4,2304 17
Tabel 2. Perhitungan standarisasi protein marker.
No Marker
A B Rf Mr marker (log Y Da) Mr marker (kDa)
1 15,9 mm 118 mm 0,134 5.228 169,0 2 22,3 mm 118 mm 0,188 5.118 129,5 3 31 mm 118 mm 0,263 4.977 94,8 4 40,5 mm 118 mm 0,343 4.852 71,9 5 52 mm 118 mm 0,441 4.743 55,3 6 66 mm 118 mm 0,559 4.635 43,2 7 83 mm 118 mm 0,703 4.524 33,5 8 98 mm 118 mm 0,831 4.419 26,2 9 118 mm 118 mm 1 4.228 16,9 Keterangan :
A : jarak pergerakan protein dari tempat awal B : jarak pergerakan warna dari tempat awal
Penghitungan molekul relatif dari pita-pita protein (Gambar 1) yang terdapat pada gel dilakukan dengan jalan membandingkan antara molekul relatif dari marker dengan Rf. Selanjutnya dibuat kurva standar dengan nilai logaritma molekul relatif sebagai sumbu y. Molekul relatif GDF-9 dari oosit yang dimaturasi secara in vitro ditentukan
berdasarkan persamaan regresi yang dihasilkan dari analisis Statistical Program for Social Science 13 (SPSS 13) dari marker protein adalah Y=5.602-3.228X2+3.728X2-874X3 artinya garis yang dibentuk akan melewati titik-titik dari Rf dan log marker, sedang Y adalah nilai logaritma masa molekul relatif.
Tabel 3. Perhitungan Massa Molekul Relatif (Mr).
No Oosit yang Dimaturasi Secara In Vitro
A B Rf Mr sampel (log Y Da) Mr sampel (kDa)
1 17 mm 118 mm 0,127 5.248 177 2 21 mm 118 mm 0,178 5.135 137 3 32 mm 118 mm 0,271 4.963 100 4 40 mm 118 mm 0,339 4.863 73 5 56 mm 118 mm 0,475 4.709 51 6 69 mm 118 mm 0,585 4.614 41 7 75 mm 118 mm 0,636 4.575 38 8 97 mm 118 mm 0,822 4.427 27 9 111 mm 118 mm 0,941 4.304 20 Keterangan :
A : jarak pergerakan protein dari tempat awal B : jarak pergerakan warna dari tempat awal
Berdasarkan penghitungan persamaan regresi dari marker protein untuk menentukan massa molekul relatif protein didapatkan 9 fraksi protein yaitu : 177kDa, 137kDa, 100kDa, 73kDa, 51kDa, 41kDa, 38kDa, 27kDa, 20kDa. Hasil yang di dapat dari penghitungan massa molekul relatif sampel, maka pita protein dengan berat molekul 51kDa sebagai protein GDF-9 yang berasal dari oosit yang telah dimaturasi secara in vitro.
PEMBAHASAN
Pada penelitian ini telah dilakukan identifikasi protein GDF-9 menggunakan metode elektroforesis dengan Sodium Dodecyl Sulphonat Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) yang me-rupakan standar metode pengujian ter-hadap molekul relatif protein, struktur sub unit dan kemurnian protein. Teknik ini digunakan karena sederhana, murah, dan sampel yang digunakan relatif sedikit (Rantam, 2003).
Metode SDS-PAGE dilakukan dengan menentukan perbedaan letak pita pada gel yang dibandingkan dengan marker protein yang berkisar antara 17-170kDa. Marker yang digunakan adalah marker medium karena molekul relatif berkisar antara 0-200kDA
Preparasi sampel diambil dari oosit yang dimaturasi secara in vitro dengan metode SDS-PAGE 12%. Perhitungan berat molekul dari pita-pita protein pada gel poliakrilamid dengan jalan mem-bandingkan molekul relatif dari marker. Hasil didapatkan beberapa pita protein yaitu protein dengan molekul relatif 177kDa, 137kDa, 100kDa, 73kDa, 51kDa, 41kDa, 38kDa, 27kDa, 20kDa. Pada proses maturasi banyak protein yang berperan hal ini dapat terlihat pada band hasil SDS-PAGE.
Dari beberapa protein diatas, protein dengan molekul relatif 51kDa di-identifikasi sebagai protein GDF-9 yang berperan pada proses maturasi secara in vitro karena protein tersebut berasal dari oosit dan dengan bantuan persamaan regresi dapat ditentukan molekul relatifnya.
Oosit yang dikoleksi dari folikel sangat kecil menunjukan tingkat keber-hasilan maturasi dan fertilisasi yang rendah diakibatkan oleh faktor intrinsik oosit (Yang dan Roy., 2001). Growth Differentation Factor-9 mempengaruhi berbagai sel ovari termasuk sintesis DNA pada membran sel granulosa (Jayawardana et al., 2006). Growth Differentation Factor-9 mereduksi cAMP yang distimulasi FSH pada proses steroidogenesis sehingga proses meiosis
dapat berlangsung. Growth Differentation Factor-9 memungkinkan terjadinya ekspansi kumulus komplek dan pe-ningkatan reseptor LH dalam sel granulosa dan memproduksi asam hialuronat yang dapat diindikasi pada oosit yang telah matang (Vitt et al., 2000). Kerja biologis dari GDF-9 diperantai oleh reseptor tipe I dan II TGF β bersama dengan kerja serine kinase yang diikuti dengan faktor phosphorylasi intrasel (Mazerbourgh et al., 2003).
Efek GDF-9 tergantung pada konsentrasi dan dosis 100-300 ng/ml adalah dosis maksimal yang dibutuhkan (Oja et al., 2003). Pada tikus betina sangat membutuhkan GDF-9 yang berperan pada perkembangan folikel primer sampai pada saat ovulasi oosit (Elvin et al., 2000). Efek GDF-9 pada sel target dimediasi melalui beberapa pathway paralel dan berlawanan dengan pathway yang mengaktifasi gonadotropin pada tahapan folikulogenesis. Sekresi dari GDF-9 berperan dalam proses pe-ngaturan, pertumbuhan dan deferensiasi sel pada ovarium mamalia (Oja et al., 2003).
Protein yang telah diidentifikasi melalui SDS-PAGE belum tentu mengandung protein yang diinginkan, oleh karena itu perlu uji spesifik untuk mengetahui secara spesifik protein yang dikehendaki. Salah satu uji spesifik yang digunakan adalah dengan uji Western blotting (Aulanni‟am, 2004).
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa terdapat 9 fraksi protein GDF-9 yang diisolasi dari oosit sapi yang telah dimaturasi secara in vitro. Berdasarkan persamaan regresi linear dari marker
protein maka dapat diketahui molekul relatif protein GDF-9 adalah 51 kDa.
Saran
Untuk membuktikan bahwa band protein 51 kDa adalah GDF-9 perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan western blotting.
DAFTAR PUSTAKA
Aulanni‟am. 2004. Prinsip dan Teknik Analisis Biomolekul. Edisi I. Fakultas Pertanian Universitas Brawijaya Press. Malang. 47-75.
Elvin, J. A., Yan and M. M. Matzuk 2000. Oocyte-expressed TGF-β superfamily members in female fertility. J. Mol Cell Endoc. 159:1-5.
Frandson, R.D. 1992. Anatomi dan Fisiologi Ternak. Edisi ke empat terjemahan B. Srigondo dan K. Prasno. Gajah Mada University Press, Yogyakarta: 683.
Jayawardhana, B. C., S. Takashi, N. Hiromi, K. Etsushi, T. Masafumi and M. Akio. 2006. Hormonal regulation of expression growth differentiation factor-9 (GDF-9) reseptor typeI and type II genes in vitro the bovine ovarian follicle. J. Repro. 131(3):545. Mazerbourg, S., C. Klein, A. J. Hsueh, N.
Kaivo-Oja, O. Ritvos, D. G. Motterhead and O. Korchynski. 2003. Growth differtiation factor-9 signaling is mediated by type I receptor, activin receptor-like kinase 5. J. Mol Endoc 18 : 653-665.
Oja. N. K., B. Jonas, K. Meerit, K. Janne, V. Ursula, C. Mark, V. Kaisa, P. K. Janne, M. O. Vesa, H. Masayu, M. Aristidis, P. G. Nigel, T. D. Peter, J. W. H. Aaron and R. Olli. 2003. Growth differentiation factor-9 smad2 activation and inhibin b production in cultured human granulose luteal-cells. J. Clin Endoc and Metab 88 : 755-762.
Pawshe, C. H., A. Palanisamy, M. Taniju, S. K. Jain and S. M. Totey. 1996. Comparison of Carious Maturation Treatments on In Vitro Maturation. J. Theriog. 46:971-982.
Rantam, F. A. 2003. Metode Immunologi. Cetakan pertama. Airlangga University Presss. Surabaya.
Stephanie, A. P., J. Carolina, Jorgez, and M. M. Matzuk. 2004. Growth differentiation factor 9 regulates expression of the bone morphogenetic protein antagonist gremlin. J. Biol. Chem. 31:32281-32286.
Vitt UA, S. Mazerbourg, C. Klein and A. J. W. Hsueh. 2002. Bone morphogenetic protein receptor for growth differentiation factor-9. Biology of Reproduction. 67:473-480.
Widjiati. 2007. Induksi maturasi oosit secara in vitro oleh TGF β asal oosit kumulus kompleks. [Disertasi]. Universitas Brawijaya. Malang.
Widjiati dan Rimayanti. 2002. Seleksi diameter folikel terhadap morfologi embrio kambing tahap satu sel dan angka fertilisasi in vitro. Lembaga Penilitian Universitas Airlangga, Surabaya.
Yang P. And S. K. Roy. 2001. Epidermal growth factor modulates transforming growth factor receptor mesenger RNA and protein levels in hamster prenatal follicles in vitro. J. Biol. Reprod. 65: 847-854.
