·
..
Laporan Hasil Penelitian
PELESTAR
P
A NUTFAH RUMPUT LAUT
Kappaphycus al
var
ezi"
(Doty).
ELALUIINDUKSI KALUS
DAN E
I GE E S SECARA INVITRO
Personil Pelaksana
Peneliti Utan a EMMA UR ATI Anggota Peneliti 1 Andl Tennulo
2- Bunga Rante Tampangalo
BALAI R ET PERJ N BUDIDA VA AIR PAYAU PUS T RISET PE JKANAN B DIDAYA KE E TERJAN .LAUTAN DAN ERIKANAN
Laporan Hasil Penelitian
PELESTARIAN PLASMA NUTFAH RUMPUT LAUT
Kappaphycus alvarezii (Doty)
.
MELALUI INDUKSI KALUS
DAN EMBRIOGENESIS SECARA
INVITRO
Personil Pelaksana
Peneliti Utama EMMA SURYATI Anggota Peneliti 1. Andi Tenriulo
etahui: .~
L
EMBARIDENTITAS
DAN PENG
E
SAHAN
Judul Riset PELESTARIAN PLASMA NUTFAH RUMPUT LAUT Kappaphycus
alvarezi; (Doty).MELALUI INDUKSI KALUS DAN EMBRIOGENESIS
SECARA INVITRO
Peneliti Utama : Ora. Emma Suryati, M.Si Jenis kelamin : Perempuan
Bidang priorotas : Ketahan pangan
Program : Insentif Peningkatan Kemampuan Peneliti dan Perekayasa Jenis priorotas : Riset Terapan
ama riset : 1 (Satu) tahun Tahun mulai riset : 2010
Maros, November 2010 nan Budidaya Air Payau
RINGKASAN
Pengumpufan plasma nutfah rum put raut Kappaphycus alvarezii (Ooty) dilakukan
dalam rangka pelestarian dan penyediaan benih yang bermutu dan mempunyai keunggulan tertentu, induksi kalus dan embriogenesis menggunakan beberapa media dan penambahan kondisi lingkungan berbeda, serta penambahan hormon pertumbuhan yang diintroduksi ke dalam media kultur untuk memacu induksi kalus dan pertumbuhan embrio. Media kultur yang digunakan adalah media semi solid yang diperkaya dengan pupuk pada pertumbuhan mikro algae antara lain Conwy, PES, ES, dan Miguel. Hormon perangsang tumbuh yang digunakan untuk memacu pertumbuhan kalus dan filamen embrio yaitu 1M (Indol acetic acid), kinetin dan auxilin dengan konsentrasi
berkisar 0,4-1 ppm. Pemeliharaan embrio dilakukan pad a media cair dengan komposisi :Jupuk yang sama pada induksi kalus dan embriogenesis. Penelitian ditujukan sebagai paya pelestarian plasma nutfah rumput laut dari beberapa sentra budidaya di
..
·
PRAKATA
Puji syukur kami panjatkan kepada Allah Subhanahu Wataala, atas karunia-Nya lah penelitian yang berjudul" PELESTARIAN PLASMA NUTFAH RUMPUT LAUT Kappaphycus alvarezii (Doty).MELALUI INDUKSI KALUS DAN EMBRIOGENESIS SECARA INVITRO' dapat terlaksana melalui Program Insentif Pen·,ngkatan dan Kemampuan Penelitian dan Perekayasaan tahun anggaran 2010.
Kegiatan penelitian dilakukan di Laboratorium Biotekn%gi dan Kultur Jaringan Balai Riset Perikanan Air Payau serta beberapa sentra budidaya rumput laut yang ada di Sulawesi Selatan.
Kegiatan ini tidak dapat terlaksana dengan baik tanpa bantuan dan kerjasama dari rekan-rekan peneJiti yang terlibat, serta dukungan pimpinan dan staf administrasi yang membantu menyelesaikan administrasi dan keuangan. Untuk itu perkenankanlah dalam kesempatan ini kami menghaturkan terima kasih yang sebesar-besamya.
Akhir kata mudah-mudahan penelitian yang dilakukan ini dapat bermanfaat bagi kita semua terutama dalam rangka pelestarian plasma nutfah rumput laut yang dewasa ini belum diketahui karakter serta taksonomi yang paling tepat.
Wassalam
DAFTAR lSI
Halaman LEM8AR rOENnrAS OAN PENGESAHAN ... ... .... ..
RINGKASAN '" ... ... '" ... ... ... ... ... ... ii
PRAKATA ... .. ... . .. ... . . .. .. ... . . .. .. . . .. ... .. . . .. ... ... . . . .. . ... . .. ... ... .. . . .. ... . . .. .. . iii
DAFTAR lSi ....... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... iv
DAFTAR TABEL .... ... ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... v
DAFT AR GAM BAR ... ,. ... ... ... ... ... ... ... vi
BASI PENDAHULUAN ..... ... ... ... ... ... . 1
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... , ... . 1
BAB JJI TUJUAN DAN MANFAAT ...... . 3
BABIV METODOLOG/.......... .............. .............. . 3
BABV HASIL DAN PEMBAHASAN ... ... ... .. ... ... ... 6
BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN ... ... ... ... ... 16
·
..
...
DAFTAR TABE LHal. Tabel 1. Organisme Kontaminan Pada Pelestarian Plasma Nutfah Rumput
Laut Kappaphycus alvarezii (Doty) Melalui Induksi Kalus dan
Embriogenesis Secara In Vitro. .... ... ... .... ... .... ... ... .... 15 Tabel 2. Identifikasi Morfologi Organisme Kontaminan Yang Tumbuh Pada
Pelestarian Plasma Nutfah Rumput Laut Kappaphycus Alvarezii
(Doty) Melalui Induksi Kalus Dan Embriogenesis Secara In
Vitro... ... .. 16
...
·
DAFTAR GAM BAR
Hal. Gambar 1. Varietas rumput laut K.alvarezii dan E. Oenticulatum.................. 6 Gambar 2. Rumput laut K.alvarezii yang disiapkan untuk isolasi DNA... ... ... 7
Gambar 3. Amplifikasi DNA menggunakan beberapa primer (M = marker 100 bp DNA ladder plus; 1-2= CA-1; 3-4 = CA-2; 5-6= P-40; 7-8 = P-50;
9-10
=
DALRP; 11-12=
DALRP-221) ... ... ... 7 Gambar 4. Hasil elektroforesis genom DNA rumput laut Kappaphycus alvarezii, M =Marker Hind III dan sumur 1-14
=
genom DNA... ... 8Gambar 5. Hasi} amplifikasi DNA rumput laut K. alvarezii,dengan menggunakan primer Ca-1(1-2); Ca-2 (3-4); P-40 (5-6); P-50 (7-8); DALRP (9-10); dan DALP221
(11-12) M = GeneRuler 100pb DNA Ladder Plus... ... 9
Gambar 6. Pol a fragmen DNA rumput laut K.alvarezii dari beberapa sentra budidaya yang diamplifikasi menggunakan primer P-40. GeneRuler 100pb DNA Ladder Plus (M1); GeneRuler 100pb DNA Ladder (M2) sampel dari
Bufukumba (1-3); Jeneponto(4-6); Takafar (7-9) dan Bantaeng (10-12)... 9 Gambar 7. Kluster UPMGA dari rumput laut K. alvarezii dari berbagai sentra budidaya
menggunakan primer P-40 ; Bulukumba (1) Jeneponto (2) Takalar (3) dan
Bantaeng (4). ... ... ... 10 3ambar 8.Grafik sintasan embrio rumput laut K.alvarezii yang dikultur pada media
dengan pupuk yang berbeda )... .... .. .. ... 12
3ambar 9.Grafik kepadatan media PES 1/20 semi solid yang digunakan untuk
pemeliharaan embrio rumput laut K. alvarezii................ .......... 12 .3.ambar 10. Perkembangan embrio rum put (aut pada media semi sofid yang diperkaya
dengan pupuk PES 1/20 serta kombinasi ZPT dari golongan auksin dan
,
.
BABI. PENQAHULUAN
Rumput laut K. alvarezii merupakan salah satu komoditas unggulan penghasil karaginan yang banyak dimanfaatkan dalam industri kertas, tekstil, fotografi, pasta dan pengalengan ikan. Keragaman mutu genetik serta varitas yang ada di Indonesia bel urn dapat ditata dan dilestarikan sebagai kekayaan milik bangsa Indonesia tercinta ini. Upaya yang telah dilakukan untuk itu antara lain melalui penelusuran variasi genetik dan karakteristik rumput laut juga telah dilakukan untuk meningkatkan produksi serta koleksi varitas yang unggul yang nantinya dapat digunakan sebagai induk yang sesuai (Parenrengi et a/2004 ).
8eragamnya varietas rumput laut yang ada di Indonesia khususnya K.alvarezii sampai saat ini belum dapat teridentifikasi dengan baik, penggunaan bibit dari daerah satu ke daerah yang lain mengakibatkan terjadinya pencampuran baik secara fenotif maupun secara genetik, juga pengaruh lingkungan yang menyebabkan perubahan pada fisik dan penampakannya.
Identifikasi taksonomi dari spesies rumput laut ini mutlak diperlukan, karakteristik genetik serta baik secara genetika maupun fenotifnya, koteksi varietas rumput laut dari beberapa sentra budidaya serta benih dari alam perlu dibuat buat koleksi sebagai plasma nutfah rumput laut yang perlu dilindungi dan dilestarikan.
9AB II. TINJAUAN PUST AKA
Rumput laut
K.
alvarezi; merupakan salah satu komoditas unggulan ':Jenghasil karaginan yang banyak dimanfaatkan dalam industri kertas, tekstil, . :ografi, pasta dan pengalengan ikan. Keragaman mutu genetik serta varitas _ gada di Indonesia belum dapat ditata dan dilestarikan sebagai kekayaanbangsa Indonesia tercinta ini.
I penelitian yang telah dilakukan beberapa tahun terakhir yaitu kultur an rum put laut dan anal isis genetik rumput taut K.alvarezii, diperoleh
..
·
2002} serta ~karakter genetik dari beberapa varietas rumput laut K. alvarezii yang ada di Indonesia pada umumnya (Parenrengi et al 2004). Pada tanaman tingkat tinggi regenerasi tanaman secara invitro dapat dilakukan melalui induksi tunas (organogenesis) atau induksi embrio somatik (embriogenesis somatik). Teknik kultur jaringan yang dapat menginduksi embrio somatik lebih diinginkan karena dapat berasal dari satu sel pada jaringan somatik yang perkembangannya serupa dengan embrio normal. Regenerasi melalui jalur embriogenesis somatik
mudah diregenerasikan menjadi embrio bipolar, yaitu mempunyai dua kutub
yang langsung sebagai bakal tunas dan akar pada tanaman tingkat tinggi
(Oamayanti et al 2007}.Teknik perbanyakan benih melalui kultur jaringan melalui
induksi kalus dan perbanyakan embrio telah berhasil dilakukan pada tanaman
tingkat tinggi, dengan penambahan hormon perangsang tumbuh baik 9010n9a
auxin maupun sitokinin. Pada induksi kalus dan pembentukan embrio pada rum put laut telah dilakukan oleh Reddy, et al 2003 menggunakan NAA (Naphtalen acetic acid) dan BAP (Benzil amino purin) untuk memacu pembentukan embrio pada tallus rumput laut dapat berhasil dengan baik. Namun masih ada hormon perangsang tumbuh jenis lain yang memiliki sifat yang hampir sama yang dapat dieksplor pemanfaatannya pada kultur dan induksi kalus rumput laut seperti IAA, auxilin dan kinetin yang sering digunakan pad a induksi alus dan pertumbuhan embrio pada tanaman tingkat tinggi secara invitro endaryono et a/1994}. Pada regenerasi rumput laut K.alvarezii melalui induksi alus dan embrio perlu diketahui pengaruh dan konsentrsai hormon yang dapat
: -g nakan serta pemanfaatan lainnya pad a kultur jaringan rum put laut terhadap bentukan embrio, serta kelangsungan hidup embrio pada media padat dan ..cI serta pemeliharaan anakan hingga mencapai ukuran yang dapat
BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT
Keanekaragaman varietas rumput laut Kappaphycus alvarezii (Doty) yang ada di Indonesia perlu ditata dan dikoleksi sebagai plasma nutfah yang nantinya dimanfaatkan sebagai induk dan koleksi untuk membackup varietas yang dibudidayakan oleh masyarakat luas serta dapat dimanfaatkan sebagai kolektor pada perbaikan mutu genetik rumput laut pad a masa yang akan datang
BAB
IV.
METODOLOGIa.
Koleksi SampelRumput laut K. alvarezii dikoleksi dari beberapa sentra budidaya di Sulawesi Selatan yakni Jeneponto, Takalar, Bantaeng, dan Bulukumba (Gambar 1). Identifikasi secara morfologi dilakukan sebagai dasar pengelompokan jenis rumput laut sebe/um analisis genetika. Sampel rumput laut dalam bentuk segar (± 50 mg) dipreservasi dengan menggunakan 250 uL TNES-Urea buffer (Asahida et aI. , 1996) dalam tabung eppendorf 1,5 ml. Sampe/ disimpan da/am suhu ruangan sampai dilakukan ekstraksi DNA.
b. Ekstraksi DNA
Genom DNA rurnput laut K. alvarezii diekstraksi dengan menggunakan metode konvensional fenol-k/orofom yang telah dikembangkan pada ikan kerapu (Parenrengi, et al. 2000) dengan sedikit modifikasi. Modifikasi metode dilakukan dengan penambahan kalium asetat 5 M da/am proses ekstraksi. Untuk mengetahui keberhasilan ekstraksi, campuran 7,5 uL genom dan 2,5 uL loading dye dielekroforesis dalam 0,8% (w/v) gel agarose pada larutan Tris-Boric acid EOTA (TBE) dan tegangan 50 volt selama 2 jam. Gel direndam dalam 0,5g/mL
_rutan ethidium bromida agar pita genom dapat terlihat pada cahaya utra violet an selanjutnya untuk keperluan dokumentasi secara digital. Hind III marker digunakan sebagai standar marker genom yang telah diekstraksi.
Kemurnian genom hasil ekstraksi selain dianalisis secara kualitatif dengan
etode elektroforesis juga diukur secara kuantitatif me/alui metode UV
..
·
spektrofoto~ter pada rasio absorban 260 nm dan 280 nm (00200'00280).
Sedangkan konsentrasi genom DNA dihitung berdasarkan rumus Linacero et al.,
(1998).
c. Persiapan eksplan
Kappaphycus alvarezii dikumpulkan dari kebun petani di Kabupaten Takalar, Bantaeng, Jeneponto, dan Bulukumba dibawa ke laboratorium Balai
Riset Perikanan Budidaya Air Payau (BRPBAP) dalam wadah yang ditutup
dengan kain yang dibasahi dengan air laut. Tallus rumput laut yang sehat dari penyakit dan bersih dari lumut dipotong sekitar 5 cm dan dibersihkan dengan air laut yang disaring dengan membran filter. Untuk inisiasi dan penyesuaian pada kondisi laboratorium, eksplan yang telah dipotong dikultur pada air laut steril yang diperkaya dengan pupuk Conwy. Untuk menghilangkan diatom
digunakan Ge02 (10 ppm) ditambahkan untuk semua media kultur selama 2
minggu pertama kultur. Fluktuasi cahaya yang digunakan yaitu gelap: terang
=
12: 12 jam. Fragmen yang dipilih untuk kultur jaringan, disterilkan dengan metoda sterilisasi permukaan (Polne-Fuller dan Gibor 1984, Huang dan Fujita 1997a). Eksplan dibersihkan dengan sikat di bawah mikroskop, kemudian dimasukkan ke dalam 0.5% deterjen cair dalam air laut steril selama 10 menit, kemudian dengan betadin 2% wlv di dalam air laut steril selama 3 menit untuk menghilangkan mikroba permukaan, kemudian disterilisasi menggunakan campuran antibiotik 3% di dalam media kultur Conwy selama 2 hari. Untuk enguji sterilisasi dikonfirmasi dengan menumbuhkan pada media agar dan isimpan pada inkubator.
..
·
sebanyak 5 ~ksplan pada setiap cawan. Setelah 2 minggu, kalus terbentuk pada bagian epidermis yang mengandung pigmen, kemudian menebal dan membentuk filamen, lalu dihitung pertumbuhan kalusnya. Setelah 30 hari kemudian dipindahkan ke dalam media kultur yang baru. Setelah 2 bulan kalus embrio dipindahkan ke dalam media kultur yang baru dengan kondisi yang sama.
e. Media kultur yang digunakan dengan kepadatan agar, cahaya dan
hormon perangsang tumbuh.
Untuk memperoleh induksi kalus, pertumbuhan eksplan yang konsisten dan optimal, perlu standarisasi media kultur dengan komposisinya seperti pup uk yang digunakan, kepadatan agar, pengatur pertumbuhan, dan f1uks foton intensitas cahaya. Media kultur diperkaya dengan pupuk pad a budidaya makroalgae seperti PES 1/20, Conwy, dan SSW. Untuk mengetahui kebutuhan cahaya f1uks yang optimal, maka digunakan intensitas cahaya dengan kisaran 500, 1000, 1500, dan 2000 lux, sedangkan untuk kepadatan agar digunakan 0,6; 0,8; 1.0; dan 1.2%, hormon pengatur tumbuh yang digunakan antara lain IAA, auxilin dan kinetin dengan konsentrasi 0.4-1.0 ppm.
Terjadinya induksi kalus ditentukan setelah 2 minggu pemeliharaan dan akan terbentuk embryogenik dan somatik embryogenesis pada bagian pig men atau kulit bagian luar . Setelah 60 hari pemeliharaan, kalus perlu dipindahkan dengan mengiris embrio dengan hati-hati, pada media kultur yang baru dengan kepadatan 0.4% bacto-agar atau 0.6% agarose. Embrio yang diiris dipindahkan kedalam cawan petri yang berisi 20 mL medium kultur dengan gelling agar rendah, dengan kondisi pemeliharaan yang sama seperti diatas. Pada pemeliharaan perlu diperhatikan untuk menghindari pergatian temperatur yang terlalu drastis. Pergatian media kultur dilakukan dengan interval 40-45 hari.
..
·
f. Pemelihaljlan anakan rumput laut pada media cair
Embrio somatik kecil yang dihasilkan dari kalus yang berkembang menjadi anakan, diiris dengan pisau steril, dibilas dengan air laut steril kemudian dimasukkan ke dalam botol kultur yang berisi 20 mL media kultur yang diperkaya dengan hormon perangsang tumbuh dengan konsentrasi tertentu.
Botol kultur ditempatkan pada shaker dengan kecepatan 100 rpm selama 1
bulan, kemudiannya pindahkan ke da/am botol nonaxenic, hingga tumbuh sampai anakan mencapai 3-5 em. Seiama kultur mieropropagule, media diganti dengan interval mingguan.
BAB V. HASIL DAN PEMBAHASAN
a. Analisis dan Karakteristik DNA rumput laut Kalvarezii
Hasil yang telah dicapai hingga bulan Juli 2010 antara lain: Telah dapat diko/eksi rumput laut Kappaphycus alvarezii dari sentra budidaya rumput laut antara lain perairan pantai se/atan Kab Bu/ukumba, Bantaeng, Jeneponto, dan Taka/ar. Ko/eksi yang terkumpul merupakan varietas yang ditanam oleh masyarakat petani dan nelayan. Penamaan dari rumput laut sering kali berdasarkan kebiasaan dan penampakan dari rumput laut tersebut dengan nama lokal seperti kajompi, maumere, tambalang dll
dimanfaatkan~ sebagai induk dan koleksi untuk memback-up varietas yang dibudidayakan oleh masyarakat luas serta dapat dimanfaatkan sebagai kolektor pada perbaikan mutu genetik rumput laut pada masa yang akan datang.
Gambar 2. Rumput laut Kalvarezii yang disiapkan untuk isolasi DNA.
Genom DNA rumput Jaut teJah berhasil diektraksi, dan kemudian dilakukan skrining primer untuk menentukan jenis primer yang akan digunakan untuk karakteristik genetik (Gam bar 3).
Gambar 3. Amplifikasi DNA menggunakan beberapa primer (M
=
marker 100 bp DNA ladder plus; 1-2=
CA-1; 3-4=
CA-2; 5-6=
P-40; 7-8=
P 50; 9-10=
DALRP; 11-12=
DALRP-221,da empat jenis primer yang memberikan hasil pemisahan yang baik yaitu : Ca P-40, DALRP dan DALRP-221 Keempat primer ini selanjutnya akan unakan untuk mengetahui karakteristik genetik rumput laut K. alvareziii (Doty)
_ari beberapa daerah sentra budidaya rumput laut.
..
·
...
Keragaman genetik plasma nutfah rumput taut Kappaphycus alvarezii
berdasarkan analisis penanda RAPD.
Isolasi DNA dilakukan dengan metode fenol kloroform yang telah dimodifikasi dengan penambahan Kalium asetat. Metode ini juga telah digunakan ektraksi rumput laut Gracillaria verrucosa oleh Parenrengi et al.,(2004). Hasil ekstraksi menunjukkan fragen tunggal genom yang relatit sama.
Gambar 4. Hasil elektroforesis genom DNA rumput laut Kappaphycus alvarezii, M
=
Marker Hind III dan sumur 1-14 = genom DNASelanjutnya dilakukan amplitikasi dengan PCR untuk menyeleksi primer yang akan digunakan untuk analisis RAPD. Dari enam jenis primer yang digunakan, ada lima jenis primer yang memberikan hasil amplifikasi yang bersih yaitu Ca-1, P-40, P-50, DALP221 , dan DALRP. Perbedaan primer yang digunakan menunjukkan has;1 amplifikas; DNA yang berbeda dan
·
..
Gambar 5. Hasil amplifikasi DNA rumput laut K. alvarezii,dengan menggunakan primer Ca-1 (1-2); Ca-2 (3-4); P-40 (5-6); P-50 (7-8); DALRP (9-10); dan DALP221 (11-12) M = GeneRuler 100pb DNA Ladder Plus.
Profil fragmen DNA yang dihasilkan pada amplifikasi dengan menggunakan
primer P-40 menghasilkan 13 fragmen dengan ukuran antara 200- 1200 bp. Kemampuan primer menghasilkan fragmen-fragmen menggambarkan berbagai ukuran DNA yang terparasi dan menggambarkan jumlah nilai 1 (presence).
Gam bar 6. Pol a trag,nan Di\lA iumput laut K. aJvarezi; oari beberapa sentra budidaya yang diamplifikasi me gg akan primer P-40. GeneRuler 100pb DNA Ladder Plus (M1); GeneRuler 100pb DNA Ladder (M2) sampel dari Bulukurnba (1-3); Jenepon 0(4-6); Takalar (7-9) dan Bantaeng (10-12).
.
·
Analisi~~ data dilakukan pada ada tidaknya fragmen. Profil fragmen DNA yang dihasilkan diterjemahkan ke dalam data biner dengan ketentuan nilai 2 untuk tidak ada fragmen dan nilai 1 untuk adanya fragmen pada posisi yang sama dari individu yang dibandingkan. Pengelompokan data matriks (cluster analysis) dan pembuatan dendogram dilakukan dengan Unweighted Pair-Group Method dengan program TFPGA.
0.600 0.450 11.300 0.150 0.000
r - - - 3
~---2
Gambar 7. Kluster UPMGA dari rumput laut K. alvarezii dari berbagai sentra budidaya menggunakan primer P-40 ; Bulukumba (1) Jeneponto (2) Takalar (3) dan Bantaeng (4).
Hasil analisis kekerabatan rum put laut K. alvarezii menunjukkan ada tiga kluster yang terjadi dengan jarak genetik rata-rata adalah 0,46. Hasil ini tidak berbeda jauh dengan variasi genetik populasi rumput laut K. alvarez;i asal Pinrang yaitu 0,49 (Parenrengi, 2004). Kondisi ini kemungkinan disebabkan oleh kurangnya pertukaran benih antar sentra dan persilangan yang jarang terjadi karena sistem budidaya rumput laut biasanya dilakukan seeara vegetatif. Jarak genetik yang paling keeil yaitu asal Bantaeng dan Takalar 0,2763 dan jarak yang terjauh adalah antara antara Bulukumba dan Jeneponto 0,8618 hal ini
•
•Nilai j~rak genetik akan menentukan keberhasilan persilangan dan budidaya. Semakin besar nilai jarak genetik antara sampel maka semakin kecil keberhasilan persilangan, tetapi jika persilangan berhasil maka akan
diperoleh turunan dengan sifat genotif yang unggul.
b. Koleksi rumput laut K.alvarezii untuk Induksi kalus dan embrio plasma nutfah
Koleksi rumput laut K.alvarezii dikumpulkan dari beberapa daerah sentra budidaya di Sulawesi Selatan antara lain dari Kab. Takalar, Jeneponto,
Bantaeng, Bulukumba, dan Barru yang dikoleksi sebagai plasma nutfah.
Koleksi embrio rumput laut K. alvarezii dapat diperoleh melalui induksi kalus dan embrio dan disimpan sebagai plasma nutfah.
Kelangsungan hidup embrio rumput laut
K.
alvarezii yang ditumbuhkanpada media padat yang diperkaya dengan beberapa macam pupuk memperlihatkan bahwa media padat yang diperkaya dengan pupuk PES 1/20 dan Conwy (Liao et at. 1983); memberikan kelangsungan hidup berkisar 45
80%, sesuai dengan yang dikerjakan (Reddy et al 2003) dalam risetnya
digunakan media kultur padat yang diperkaya dengan PES untuk pembentukan
induksi kalusnya. (Gambar 1)
Media kultur yang diperkaya dengan pupuk PES 1120 memperlihatkan
pertumbuhan dan pembentukan embrio yang lebih kompak dengan filamen yang lebih pendek dibandingkan dengan embrio yang dihasilkan dari media Conwy ..
Hal ini kemungkinan disebabkan karena kebutuhan nutrient dari eksplan dapat dipenuhi dan dapat memacu pertumbuhan rumput laut tersebut walaupun ditumbuhkan pada media semi padat.
- --- - -- --- - - -- -_ -_
..
" 100 ~ ~---~---.--- -60 40 -- - -20 - O L--~---~----~--~---~----~~ Conwy sswGambar 8. Grafik sintasan embrio rumput laut K. alvarezii yang dikultur pada media dengan pupuk yang berbeda
Kepadatan media agar yang digunakan pada pemeliharaan embrio yaitu pad a kepadatan 0,8% yang paling optimal, hal ini telah dibuktikan dan diketahui bahwa kelangsungan hidup em brio yang dikultur secara invitro, penyerapan nutrien pada media padat sangat dipengaruhi oleh porositas dan kekenyalan dari
media tersebut sehingga nutrient dapat terserap dan dapat dimanfaatkan oleh
em brio rumput laut secara maksimal (Suryati et a/2008). (Gambar 5)
80 70 +-- - - 60 +- -1 , . .- - -_ _r - - - ---j 50 1---- - -- -- 4D 30 ~ 20 ---< 10 o
I
I
~_~_~___-L-~,----~--~----J--~ -A=O.4% 8=0,6% C=O.8% 0=1,0%·
..
Intens~as cahaya dibutuhkan dalam pertumbuhan dan kelangsungan
hid up dari eksplan rumput (Amini et a/ 1995), terutama dalam proses fotosintesis dan induksi kalus hingga membentuk embrio. Hasil pengamatan dari intensitas cahaya mulai dari 500-2000 lux dengan interval 500 lux memperlihatkan pertumbuhan dan kelangsungan hidup yang paling baik adalah pada intensitas cahaya 1500 lux. Pada 500 dan 1000 lux, pertumbuhan dan induksi kalus tidak terjadi, tallus rumput laut berubah menjadi pucat dan transparan kemudian berangsur-angsur mati. Sedangkan pada intensitas cahaya diatas 1500 lux
memperlihatkan adanya penguapan pada media dan dehidrasi pada eksplan
sehingga menjadi kering dan akhirnya mati (Suryati et a/ 2008).
Pemberian zat perangsang tumbuh (ZPT) pad a media kultur, memacu
terjadinya induksi kalus dan embrio pada rumput laut membentuk filament, NAA dan SAP (Senzil amino purin), telah digunakan untuk memacu pertumbuhan dan
pembentukan embrio rumput laut (Reddy et al 2003). Hasil pengamatan dari pemberian hormon Auxilin (giberelin),
1
M
,
dan Kinetin memperlihatkanpertumbuhan dan kelangsungan hidup yang berbeda. Kelangsungan hidup eksplan rumput laut yang diperkaya dengan kombinasi
1M dan kinetin
denganperbandingan 2 :3 memperlihatkan nilai yang paling tinggi (84%) dibandingkan
dengan kombinasi yang lain, Kinetin dan kontrol tanpa pemberian hormon (Suryati et al 2008).
1M dan ISA merupakan horm
on tanaman yang termasuk golongan auxin, sedangkan kinetin termasuk golongan sitokinin dan auksilin merupakan turunan dari giberelin. Kedua golongan hormon tersebut dibedakandari fungsinya yaitu pad a golongan sitokinin dapat mengatur proses fisiologi tumbuhan antara lain berpengaruh terhadap sintesa protein dan mengatur aktivitas enzim walaupun dengan konsentrasi rendah. Sedangkan pada golongan auxin seperti 1M dan ISA berperan didalam pembelahan sel pada j~ringan, diferensiasi unsur-unsur trakheal dan diferensiasi sel sewaktu
!
membentang (Hendaryono et a/1994).
Pada induksi kalus dan pembentukan embrio rumput laut K.alvarezii, pemberian hormon perangsang tumbuh memper1ihatkan kelangsungan hidup
..
·
dan pertumQuhan yang berbeda pada proses embriogenesis di dalam media kultur diferensiasi.
Konsentrasi 1M yang digunakan berkisar antara 0,4 hingga 1,0 ppm dan yang memberikan pertumbuhan paling baik yaitu pada konsentrasi 0,4 ppm, sedangkan kinetin 0,6 ppm. Pada konsentrasi yang lebih tinggi memperlihatkan pertumbuhan yang semakin menurun. Hal ini disebabkan karena kebutuhan hormon pertumbuhan pada rumput laut relatif keeil maka dengan peningkatan konsentrasi, eksplan rumput laut mengalami degradasi dan menyebabkan kematian. Sehingga pada induksi kalus rumput laut K.alvarezii konsentrasi 1.0 ppm sudah dapat memenuhi kebutuhan untuk diferensiasi jaringan, sedangkan pada konsentrasi yang lebih tinggi dapat menyebabkan terjadinya peraeunan pada jaringan yang dapat menyebabkan kematian (Hendaryono et a/1994).
Gambar 10. Perkembangan embrio rumput laut pada media semi solid yang diperkaya dengan pupuk PES 1/20 serta kombinasi ZPT dari go long an auksin dan sitokinin
c.
Pemantauan Organisme Kontaminan Pada Pelestarian Plasma NutfahRumput Laut Kappaphycus alvarezii (Doty) Melalui Induksi Kalus dan
..
·
demikian pul a dengan eksplan yang ditanam di media agar. Untuk lebih
jelasnya, kemunculan kontaminan dan bentuk kontaminasi yang terjadi dapat dilihat pada tabel berikut:
Tabel 1. Organisme Kontaminan Pada Pelestarian Plasma Nutfah Rumput Laut
Kappaphycus alvarezii (Ooty) Melalui Induksi Kalus dan Embriogenesis
Secara In Vitro
Kode Media TgJ Tanam TgJ
Munculnya kontamlnan
Sentuk Kontaminas;
Kappaphycus
alvarezii
merah
Cair 23 Juni 2010 6 Juli 2010 Rumput laut menjadi
berwarna pucat, sebagian putih dan luka
CWC+ EC Agar 22 oktober
2010
18 Nop. 2010
Muncul koloni bakteri di
sekitar eksplan rumput
laut BAN PES BN Agar 13 Nop 2010 18 Nop
2010
Muncul koloni bakteri di
sekitar eksplan rumput laut
CWD Agar 3 Nop 2010 18 Nop
2010
Muncul koloni bakteri di sekitar eksplan rumput laut DM Ca MV CW Agar 1 Oktober 201 0 18 Nop 2010
Muncul koloni bakteri
dan jamur di sekitar
ekspJan rumput Jaut K KM CMV CW Agar 1 Oktober 201 0 18 Nop 2010 Muncul koloni jamur di sekitar eksplan rum put laut
Berdasarkan tabel diatas, maka terlihat bahwa pada umumnya bila
menggunakan media cair, kontaminan muncul setelah 14 hari sehingga perlu untuk melakukan penggantian media sedang pada bila menggunakan media
agar yang ditambah media ConWy bisa hingga 1 bulan sedang yang ditambah
media PES harus lebih cepat lagi dilakukan pergantian media. Dari hasil
pengamatan, beberapa diantara eksplan dapat tumbuh bersama-sama dengan
kontaminan yang telah ada, terutama bila kontaminan itu berupa jamur. Adapun
ciri morfologi dari organisme kontaminan yang tumbuh pada penelitian ini dapat dilihat pada tabel 2.
·
..
Tabel 2. IQentifikasi Morfologi Organisme Kontaminan Yang Tumbuh Pada
Pelestarian Plasma Nutfah Rumput Laut Kappaphycus Alvarez;; (Doty) Melalui Induksi Kalus Dan Embriogenesis Secara In Vitro.
Kode Media Morfologi (bentuk, tepian, elevasi dan Persenta
warna) se
(%)
Kappaphycu MA - Tak beraturan, tepian bergelombang, data, 20
s
alvarezii krem40
merah - Tak beraturan, tepian cilia, timbul, putih 40
kekuningan
- Bulat, liein, eembung, kuning keeoklatan
CWC + EC MA - Difuse, bergelombang, , datar, transparant
50
- Difuse, tidak beraturan, datar, kuning
50
BAN PES MA -Tidak beraturan ,licin, putih kekuningan
100
B
N
CWD MA
-
Bulat, bergerigi, datar, transparant kuning,100
agak kering
OM Ca MV MA - Bulat, bergerigi, cembung, agak kering,
100
CW merah
100
- Jamur , seperti benang dengan warna hitam putih
K KM CMV MA - Jamur, seperti gulungan benang, warna
100
CW hitam kecoklatan.
Semua koloni bakteri yang tumbuh ini sementara di uji biokimia, uji yang telah selesai adalah oksidasi fermentasi, TSIA, SIM, King A dan King B, sementara yang belum diuji adalah uji MR-VP, Oksidase dan katalase.
BABVI KESIMPULAN DAN SARAN
1. Hasil analisis keragaman genetika diperoleh informasi tentang kekerabatan rumput laut yang berasal dari Bulukumba dengan Jeneponto memiliki jarak genetik yang paling besar yaitu 0,86 dan jarak genetik yang paling kecil 0,28 adalah Bantaeng dengan Takalar
lit ..
DAFTAR PUSTAKA ....
Amini, S., M. Amin, dan A. Parenrengi. 1995. Penelitian kultur jaringan rumput laut, Kappaphycus alvarezii secara vegetatif. Laporan hasil penelitian
ARMP Balitkandita, Maros.
Damayanti, D., Sudarsono, I. Mariska, dan M. Herman. 2007. Regenerasi pepaya melalui kultur in vitro. Jurnal Agro Biogen . Volum 3 No 2 hal 49
54
Hendaryono, D.P.S dan A. Wijayani. 1994. Teknik Kultur jaringan. Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif-Modern. Kanisius
Jogyakarta 139 hal.
Hung, W. & Fujita, Y. 1997. Callus induction and thallus regeneration of the red
alga Meristotheca papulosa (Rhodophyta, Gigartinales).Bot. Mar. 40:55
61.
Liao, I.C, H.M. Su, and J.H. Lin. 1983. Larval foods for penaeid prawns p.43-69. In Mc Vey, J.P. and J.R. Moore (Eds.). CRC Handbook of Mariculture, Crustacean Aquaculture volume I, CRC Press Inc. Boca Raton, Florida.
Parenrengi, A., Sulaeman, E. Suryati dan A. Tenriulo, 2004. Variasi genetika rumput laut Kappap/1ycus alvarezii yang dibudidayakan di Sulawesi
Selatan. Laporan hasil penelitian Balai Riset Perikanan Budidaya Air
Payau, 17 pp
Polne-Fuller, M. & Gibor, A. 1984. Developmental studies in Porphyra.1. Blade
differentiation in Porphyra perforata as expressed by morphology, enzymatic digestion and protoplast regeneration. J. Phycol. 20:609-16.
Reddy, C. R. K, G. Raja Krishna Kumar, A. K. Siddhanta, and A. Tewari, 2003. In Vitro Somatic Embriogenesis and Regeneration of Somatic Embryos from Pigmented Callus of Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty (Rhodophyta, Gigartinales). J. Phycol. 39, 610-616
Suryati, Sulaeman, A. Dalfiah dan Rifka Pasande. 2002. Teknik Kultur Jaringan
Rumput Laut Eucheuma sp dalam Rangka Penyediaan Benih pad a Budidaya. Seminar Nasioanal Rumput Laut dan Mini Simposium
Mikroalgae dan Kongres Ikatan Fikologi Indonesia. 8 hal
Suryati, E, Rosmiati dan A Tenriulo. 2007. Kultur Jaringan rumput laut (Gracillaria sp) dari sumber tallus yang berbeda sentra Jumal Riset
Akuakultur Vol 2 No 2
