Uji aktivitas sitotoksik tanaman eceng gondok (Eichornia crassipes (Mart.) Solms) terhadap sel HeLa

(1)

i

UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK

TANAMAN ECENG GONDOK (Eichornia crassipes (Mart.) Solms) TERHADAP SEL HeLa

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Srudi Farmasi

Oleh :

Natasha Queen Ferdinand NIM : 138114045

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

(2)

ii

HALAMAN JUDUL

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Srudi Farmasi

Oleh :

Natasha Queen Ferdinand NIM : 138114045

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

(3)

(4)

(5)

v

HALAMAN PERSEMBAHAN

Dan segala sesuatu yang kamu lakukan dengan perkataan atau perbuatan, lakukanlah semuanya itu dalam nama Tuhan Yesus, sambil mengucap syukur oleh

Dia kepada Allah, Bapa kita. ~ Kolose 3:17

I saw they were gone time by time. I tought that i was alone, but

than I realize, God have His plan for everything I did!

Karya ini kupersembahkan kepada:

Tuhan Yesus Kristus dan Bunda Maria yang selalu membimbing dan menyertaiku

Papi, Suster dan Keluargaku yang selalu memberi dukungan doa dan semangat

Sahabat dan teman-teman seperjuangan

Dan almamater tercintaku, Sanata Dharma

Practice the pause.

(6)

(7)

(8)

viii PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa karena atas kasih dan rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi berjudul UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK TANAMAN ECENG GONDOK (Eichornia crassipes (Mart.) Solms) TERHADAP SEL HeLa sebagai syarat untuk memperoleh gelar sarjana farmasi (S.Farm) di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Keberhasilan dalam penulisan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dukungan berbagai pihak. Oleh karena itu dengan kerendahan hati penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:

1. Ibu Aris Widayanti, M.Si., Ph.D., Apt. selaku dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah mendukung penelitian ini.

2. Ibu Dr. Puji Astuti, M.Sc., Apt. selaku dosen pembimbing yang telah memberikan bimbingan selama penelitian, saran dan kritik dari awal hingga akhir proses penyusunan skripsi ini.

3. Ibu Yunita Linawati, M.Sc., Apt. selaku dosen penguji yang telah mendukung terlaksananya penelitian dan penyusunan skripsi ini serta selalu memberikan saran serta arahan yang berharga bagi penulis.

4. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah mendukung terlaksananya penelitian dan penyusunan skripsi ini serta selalu memberikan saran serta arahan yang berharga bagi penulis.

5. Bapak F. Dika Octa Riswanto. M.Sc. selaku Dosen Pembimbing Akedemik yang senantiasa membimbing dari awal hingga akhir dan terus memberika semangat dan motivasi.

6. Segenap dosen dan seluruh staff Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah membantu proses pembelajaran selama perkuliahan dari awal hingga akhir.

(9)

ix

8. Bapak Wagiran selaku laboran laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Mas Sigit selaku penanggung jawab kebun Herbal dan seluruh laboran Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah membantu proses pembelajaran selama perkuliahan dari awal hingga akhir dan membantu pelaksanaan penelitian skripsi penulis.

9. Ibu Wisni selaku Tata Usaha Unit II Fakultas Farmasi dan Mbak Juanna selaku pembimbing penelitian di Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada yang telah membantu dalam proses dan pelaksanaan penelitian skripsi ini serta selalu memberikan arahan yang berguna bagi penulis.

10.Bapak Eko selaku staff Universitas Kristen Duta Wacana yang membantu penulis dalam proses pelaksanaan penelitian skripsi.

11.Sr. Leoni OSU, suster, wali dan orang tua yang tidak pernah lelah utuk memberikan dukungan semangat dan doa yang selalu menguatkan hati penulis dalam menyelesaikan perkuliahan S1 ini.

12.Papi Yanto Santoso, yang selalu memberi dukungan baik secara materi maupun semangat dan doa sehingga membuat penulis sadar untuk selalu bertanggung jawab dalam menjalankan perkuliahan ini.

13.Keluarga tercinta Papa, Tante, Kakak dan Saudara penulis selalu memberikan motivasi, saran dan dukungan doa dari awal hingga akhir penyusunan skripsi ini.

14.Theodorus Kristianto Dau, teman seperjuangan dalam penyelesaian skripsi yang selalu membantu, memberi semangat dan motivasi, juga selalu sabar menghadapi penulis dalam proses menyelesaikan skripsi ini.

15.Ajeng Dwi Kartika, Gracia Elwy Nona, Dewita Cici dan Sari Kusuma sebagai teman dan sahabat yang selalu memberikan dorongan dan motivasi yang sangat berarti selama perkuliahan khususnya dalam proses penyelesaian skripsi penulis.

(10)

x

17.Seluruh pihak yang tidak dapat diucapkan namanya satu per satu yang telah mendukung penulis selama proses penyusunan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih sangat jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun dalam perbaikan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi setiap pembacanya. Terima kasih.

Yogyakarta, 9 Oktober 2016

(11)

xi DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL ... i

HALAMAN JUDUL ... ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... iii

HALAMAN PENGESAHAN ... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ... v

LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... vi

LEMBAR PERYATAAN PUBLIKASI ... ix

PRAKATA ... x

DAFTAR ISI ... xi

DAFTAR TABEL ... xii

DAFTAR GAMBAR ... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ... xiv

ABSTRAK ... xv

ABSTRACT ... xvi

PENDAHULUAN ... 1

METODE PENELITIAN ... 2

PEMBAHASAN DAN HASIL ... 5

KESIMPULAN ... 13

DAFTAR PUSTAKA ... 14

LAMPIRAN ... 16

(12)

xii

DAFTAR TABEL

Tabel I. Nilai IC50 Senyawa Uji Tanaman Eceng Gondok dan Pelarut DMSO

1% ... 8 Tabel II. Hasil Perkiraan Golongan Senyawa pada Fraksi Etil Asetat Daun Eceng Gondok ... 12 Tabel III. Hasil Prediksi Golongan Senyawa pada Fraksi Etil Asetat Daun Eceng

(13)

xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Prinsip Pembentukan Kristal Formazan Berwarna Ungu pada Metode

MTT ... 6

Gambar 2. Kontrol Sel HeLa ... 7

Gambar 3. Hasil Elusi dengan Fase Gerak Optimasi ... 9

Gambar 4. Identifikasi Senyawa Flavonoid ... 10

Gambar 5. Identifikasi Senyawa Alkaloid ... 10

Gambar 6. Identifikasi Senyawa Polifenol ... 11

(14)

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Determinasi Tanaman Eceng Gondok (Eichornia crassipes (Mart.)

Solms) ... 16

Lampiran 2. Ethical Clearance ... 17

Lampiran 3. Tanaman Eceng Gondok Untuk Determinasi ... 18

Lampiran 4. Data Penimbangan Ekstraksi dan Fraksinasi ... 19

Lampiran 5. Hasil Ekstraksi dan Fraksinasi ... 20

Lampiran 6. Pembuatan Stok Sampel Uji ... 22

Lampiran 7. Menghitung Kepadatan Sel ... 23

Lampiran 8. Hasil Uji Sitotoksik ... 24

Lampiran 9. Perhitungan Nilai IC50 ... 29

(15)

xv

Natasha Queen Ferdinand

Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Kampus III Paingan, Maguwoharjo, Depok, Sleman, Yogyakarta, 55282, Indonesia.

Telp. (0274) 883037, Fax. (0274) 886529

[email protected]

ABSTRAK

Tanaman eceng gondok (Eichornia crassipes (Mart.) Solms) merupakan tanaman dengan proses pertumbuhan sangat cepat yang tumbuh di air dan termasuk gulma yang dapat merusak lingkungan perairan. Pada penelitian sebelumnya telah diketahui kandungan senyawa metabolit sekunder tanaman eceng gondok diantaranya adalah tannin, alkaloid, terpenoid, flavonoid dan senyawa fenolik.

Setelah melakukan determinasi, tanaman eceng gondok diekstrak menggunakan etanol 70%. Fraksi n-heksana, etil asetat dan metanol dari ekstrak etanol 70% tanaman eceng gondok didapatkan dengan sistem fraksinasi bertingkat. Hasil ekstrak dan fraksi-fraksi diuji aktivitas sitotoksiknya terhadap sel HeLa dengan metode MTT.

Dalam metode MTT, garam tetrazolium yang berwarna kuning akan dipecah menjadi kristal formazan berwarna ungu sehingga dapat dibaca absorbansinya menggunakan plate reader untuk memperoleh nilai IC50.

Didapatkan nilai IC50 paling baik pada fraksi etil asetat daun tanaman eceng

gondok sebesar 31,75µg/mL. Fraksi etil asetat daun tanaman eceng gondok mengandung senyawa yang dapat berpendar pada deteksi sinar UV366nm.

Kata kunci: IC50, metabolit sekunder, sel HeLa, sitotoksisitas, tanaman eceng

(16)

xvi ABSTRACT

Water hyacinth plant (Eichornia crassipes (Mart.) Solms) is a plant with a very rapid growth process that grows in water and include weeds that can damage the aquatic environment. In previous studies has been known that water hyacinth plant contain secondary metabolites such as tannins, alkaloids, terpenoids, flavonoids and phenolic compounds.

After performing determination, the water hyacinth plant extracted using 70% ethanol. The fraction of n-hexane, ethyl acetate and methanol from 70% ethanol extract of water hyacinth plants obtained by fractionation system stratified. Results of extracts and fractions were tested cytotoxic activity against HeLa cells with MTT method.

In the method of MTT, a yellow tetrazolium salt will be split into a purple formazan crystals that can be read using a plate reader absorbance to obtain IC50

values. IC50 values obtained are best in ethyl acetate fraction of the water hyacinth

plant leaves 31,75μg / mL. The fraction of ethyl acetate leaves of water hyacinth plant contains fluorescent compounds on the detection of UV366nm rays.

Keywords:Cytotoxicity, HeLa cells, IC50, Secondary metabolites, Water hyacinth

(17)

1 PENDAHULUAN

Kanker merupakan penyebab kematian kedua terbesar di dunia. Terapi penyakit tersebut menyebabkan efek samping yang berat, sehingga dilakukan penelitian untuk menemukan sumber alternatif pengobatan kanker dengan efek samping lebih rendah (Lenora et al, 2015). Kanker ditandai dengan proliferasi sel secara abnormal dimana terjadi pembelahan sel yang tidak dapat dihentikan. Perkembangan kanker timbul dari berlebihnya proliferasi sel, tidak cukupnya apoptosis, ataupun kombinasi keduanya (Abdul et al, 2009). Kanker serviks atau kanker leher rahim, merupakan penyakit kanker yang terdapat pada serviks. Setelah kanker payudara, kanker serviks termasuk penyakit kanker kedua yang paling banyak diderita (Kementerian Kesehatan RI, 2015). Dinyatakan bahwa terdapat 528.000 kasus penyakit kanker serviks pada tahun 2012, dan mayoritas terjadi di negara berkembang (GLOBOCAN, 2012). Di Indonesia prevalensi penyakit kanker pada

penduduk semua umur tahun 2013 sebesar 1.4‰ atau sekitar 347.792 orang (Kementerian

Kesehatan RI, 2015).

Tanaman banyak digunakan untuk pengobatan di berbagai negara dan merupakan sumber dari banyak obat yang potensial. Kandungan zat aktif dari obat herbal yang telah ditemukan berasal dari senyawa metabolit sekunder tanaman. Untuk mengobati kanker, kandungan zat aktif tanaman memiliki aktivitas yang berbeda-beda dalam menangani sel kanker, di antaranya adalah menghambat proliferasi sel, menginduksi apoptosis sel maupun kombinasi keduanya (Wang et al, 2012). Kandungan tersebut adalah senyawa alkaloid, flavonoid, fenolik, dan polifenol (Einen et al, 2014). Tanaman eceng gondok (Eichhornia crassipes (Mart.) Solms), merupakan tanaman liar/ gulma yang tumbuh di air (Grodowitz, 1998). Kandungan senyawa metabolit sekunder pada tanaman eceng gondok adalah alkaloid, terpenoid (Enein et al, 2014), tannin, flavonoid dan senyawa fenolik (Umar and Mohammed, 2013).

(18)

2 METODE PENELITIAN

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan meliputi alat-alat gelas, cawan porselen, vial, ependorf, tabung konikal, 96-well plate, tissue culture bottle, plate reader, neraca analitik, sentrifuge, inkubator 37 ºC 5% CO2, BioSafety Cabinet kelas II, tangki nitrogen cair, haemocytometer, object glass, mikroskop inverted (olimpus), mikropipet (5µl-20µl, 20µl-200µl, 200µl-1000µl, tip (putih, biru, kuning), lemari asam, pisau stainless steel, saringan 40 mesh, orbital shaker, kertas saring, pompa vakum, blender, lemari pendingin, votex, oven, rotary evaporator serta lampu UV254nm dan UV366 nm.

Bahan utama yang digunakan adalah tanaman eceng gondok (Eichhornia crassipes (Mart.), aquadest, etanol 70%. n-heksana, etil asetat dan methanol, kultur sel HeLa (laboratorium parasitologi kedokteran UGM), media komplit (MK), Phosphat Buffer Saline (PBS), DMSO, 3-(4,5-dimetilthiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromide (MTT), reagen stopper (natrium deosil sulfat dalam 0,1 N HCL), Silika gel 60 F254, fase gerak

(n-heksana : etil asetat) dan pereaksi semprot (dragendorff, FeCl3, liebermann burchard,

serum IV sulfat dan AlCl3).

Determinasi tanaman

Determinasi tanaman eceng gondok menggunakan seluruh bagian tanaman yang diambil di kebun obat Farmasi Universitas Sanata Dharma, Kampus III Paingan, Yogyakarta. Determinasi dilakukan oleh tenaga ahli dari Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada.

Preparasi bahan uji

Bahan uji yang digunakan adalah tanaman eceng gondok, dicuci menggunakan air mengalir sampai bersih, kemudian dipotong tipis-tipis menggunakan pisau stainless steel. Dipisahkan antara daun dan batang tanaman. Bahan uji yang telah dipotong dikeringkan menggunakan oven pada suhu 50oC. Pengeringan dilakukan hingga tanaman eceng gondok mudah dipatahkan. Hasil pengeringan diblender dan diayak menggunakan ayakan nomor mesh 40.

Ekstraksi tanaman eceng gondok

(19)

3

dengan bantuan pompa vakum. Filtrat disimpan dalam kondisi penyimpanan yang sesuai. Residu yang diperoleh di re-maserasi selama 24 jam. Maserasi dilakukan 3 kali hingga filtrat menjadi bening (Anggraeni dan Erwin, 2015). Ekstrak Etanol 70% diuapkan pada suhu ± 60°C menggunakan rotary evaporator dan dilanjutkan dengan diuapkan di atas waterbath hingga diperoleh ekstrak etanol kental dan dicatat bobotnya.

Fraksinasi ekstrak etanol 70%

Dilakukan fraksinasi bertingkat dari pelarut yang bersifat non-polar (n-heksana), semi polar (etil asetat) dan polar (metanol) secara berturut-turut. Ekstrak etanol 70% diambil sebanyak 1 gram, dimasukan ke dalam tabung reaksi dan dilarutkan menggunakan 10 mL pelarut n-heksana. Kemudian di vortex selama 10 menit dan disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2000 rpm. Hasilnya akan membentuk dua fase, berupa padatan (residu) dan cair. Diambil fase cair sebagai fraksi n-heksana. Residu yang didapat di fraksinasi kembali dengan pelarut n-heksana hingga pelarut menjadi bening. Residu hasil fraksinasi n-heksana kemudian di fraksinasi menggunakan pelarut etil asetat untuk mendapatkan fraksi etil asetat, sedangkan residu hasil fraksinasi etil asetat di fraksinasi menggunakan pelarut metanol. Hasil fraksi n-heksana, fraksi etil asetat dan fraksi metanol diuapkan di atas waterbath dan dicatat bobotnya.

Uji sitotoksik terhadap sel HeLa

Uji sitotoksik dilakukan berdasarkan protokol yang dikeluarkan Cancer Chemoprevention Research Center (CCRC) nomor CCRC-03-010-02 tahun 2013 Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada. Sel kanker HeLa diambil dari penyimpanan (refrigerator suhu -80oC atau nitrogen cair) dan dipindahkan ke dalam tabung konikal kemudian ditambahkan medium komplit (MK). Sel disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 2000 rpm. Supernatan dibuang, pellet diresuspensi dengan MK dan ditumbuhkan dalam inkubator. Diamati dibawah mikroskop hingga konfluen jumlah sel berkisar 60%-70%. Jika belum konfluen, sel diinkubasi kembali dalam inkubator CO2.

(20)

4

sel. Sel diinkubasi dalam inkubator CO2 selama 24 jam hingga konfluen jumlah sel

70%-80%. Setelah dipastikan sel dalam keadaan normal kembali, dibuat seri konsentrasi sampel untuk perlakuan (termasuk kontrol sel dan kontrol media) yang berasal dari larutan stok dimana stok dibuat dari sampel sebanyak 10 mg yang dilarutkan dalam DMSO steril 100 µl sehingga di peroleh konsentrasi 100.000 ppm atau 100.000 µg/ml.

Plate yang telah berisi sel, diambil dari inkubator CO2, kemudian media sel

dibuang. Seri konsentrasi sampel dari pengenceran stok yaitu 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,6; 7,8 µg/ml (Garbi et al., 2015; López et al., 2012; Gomha et al., 2015) dimasukkan ke dalam sumuran (triplo) dan diinkubasi di dalam inkubator CO2. Lama inkubasi adalah 24

jam. Sebagai kontrol sel digunakan 100 µl suspensi sel ditambah media, kontrol media tanpa pemberian suspensi sel.

Reagen MTT (0,5 mg/ml) disiapkan dengan cara mengambil 1,0 ml stok MTT dalam PBS (5 mg/ml), diencerkan dengan medium komplit sampai 10,0 ml. Media sel dibuang, dicuci menggunakan PBS 1x, kemudian ditambahkan 100 µl reagen MTT ke setiap sumuran. Sel diinkubasi selama 4 jam di dalam inkubator CO2 pada suhu 37oC

dilakukan sampai terbentuk Kristal formazan berwarna ungu (CCRC, 2013). Kondisi sel diperiksa dengan mikroskop inverted. Jika formazan telah jelas terbentuk, ditambahkan reagen stopper 100 µl SDS 10% dalam HCl 0,1 N. Plate dibungkus alumunium foil/kertas dan diinkubasi di tempat gelap pada temperatur kamar selama semalam. Absorbansi masing-masing sumuran dibaca dengan plate reader pada panjang gelombang 595 nm dan kemudian dihitung nilai IC50.

Identifikasi profil metabolit dengan KLT

Dilakukan optimasi fase gerak dengan pelarut n-heksana:etil asetat. Fase gerak yang telah dioptimasi digunakan untuk mengelusi senyawa uji yang memiliki aktivitas antikanker berdasarkan hasil perhitungan IC50 yang paling rendah, pada uji MTT yang

telah dilakukan sebelumnya. Senyawa uji ditotolkan pada fase diam silika gel 60 F254

dengan laju elusi 10 cm. kemudian dijalankan pada fase gerak n-heksana: etil asetat hasil optimasi hingga tanda batas. Diberikan reagen semprot yang sesuai untuk mengidentifikasi kandungan fitokimia pada senyawa uji dan dilihat di bawah sinar UV254nm dan UV366nm.

(21)

5 Tata Cara Analisis Hasil

Analisis kuantitatif

Data absorbansi hasil pembacaan oleh plate reader dalam uji aktivitas sitotoksik dengan metode MTT dikonversikan ke dalam bentuk persentase viabilitas sel untuk melihat proliferasi sel, yang dihitung menggunakan rumus:

_{̅ ̅} ̅ ̅

(Fawwaz, et al., 2013). Data dianalisis dengan program Microsoft Excel 2010 untuk mendapatkan

linearitas (r) antara log konsentrasi bahan uji versus persentase sel yang viabel, serta untuk menghitung nilai IC50.

HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi Tanaman Eceng Gondok

Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi karena dalam pengerjaan dan alat yang dibutuhkan sederhana serta tidak melibatkan pemanasan yang dapat menyebabkan kerusakan zat aktif yang tidak tahan panas. Digunakan pelarut etanol karena relatif aman dibandingkan dengan metanol, dan etanol yang digunakan adalah etanol 70% karena kandungan air yang lebih banyak dibanding etanol 96% memungkinkan apabila dikonsumsi di masyarakat sebagai bahan obat. Total bobot ekstrak yang didapatkan untuk daun tanaman eceng gondok adalah 6,15 gram sedangkan total bobot ekstrak untuk batang tanaman eceng gondok adalah 5,57 gram.

Fraksinasi Ekstrak Etanol 70%

Metode fraksinasi yang digunakan adalah partisi padat-cair menggunakan tabung reaksi dengan bantuan sentrifugasi karena prosesnya yang cepat, tidak membutuhkan sampel dalam jumlah banyak dan sederhana. Pelarut pertama yang digunakan dalam fraksinasi adalah n-heksana yang bersifat non polar diharapkan dapat mengambil senyawa yang bersifat non polar. Dan untuk pelarut etil asetat diharapkan dapat mengambil senyawa yang bersifat semi polar sedangkan pelarut metanol dapat mengambil senyawa yang bersifat polar.

Uji Sitotoksik Terhadap Sel Hela

(22)

6

sel kanker untuk bertahan hidup karena adanya senyawa uji yang di berikan. Kemampuan sel untuk bertahan hidup dapat diartikan sebagai tidak hilangya metabolik atau proliferasi sel yang dapat diukur dari jumlah sel yang hidup setelah diberikan senyawa uji.

Metode yang digunakan pada uji sitotoksik ini adalah metode MTT. Dalam metode MTT, mitokondria sel yang masih aktif akan memecah garam tetrazolium yang berwarna kuning menjadi Kristal formazan berwarna ungu oleh reaksi reduksi pada jalur respirasi sel mitokondria. Warna ungu pada Kristal formazan akan memberikan absorbansi yang dapat dibaca menggunakan plate reader pada panjang gelombang 595nm kemudian dicari nilai IC50.

Gambar 1. Prinsip pembentukan Kristal formazan berwarna ungu pada metode MTT.

Sumber: Ebada et al, 2008

Pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel adalah DMSO dengan konsentrasi 1%. DMSO digunakan karena sifatnya yang dapat meningkatkan kelarutan suatu senyawa sehingga dipastikan bahwa seluruh sampel dapat terlarut seluruhnya dalam pelarut. Konsentrasi DMSO yang digunakan adalah 1% karena DMSO bersifat toksik terhadap sel. Apabila digunakan terlalu banyak maka jumlah sel HeLa yang mati menjadi tidak pasti. Untuk mengetahui efek sitotoksik dari DMSO maka perlu dilakukan uji sitotoksik kontrol pelarut DMSO 1% (Lampiran 9 dan tabel I) dan terbukti bahwa pelarut DMSO 1% tidak bersifat toksik dengan nilai IC50 = 876,13µg/mL.

(23)

7

sel di mana hampir seluruh sel hidup dan tidak ada permukaan media pertumbuhan yang tersisa (Geraghty, et al., 2014). Jumlah sel dihitung dengan menggunakan haemocytometer dan didapatkan kepadatan sel 175,5x104 sel/100µL MK (Lampiran 7).

Kontrol sel bertujuan untuk melihat apakah sel yang mati benar-benar disebabkan oleh sampel uji, bukan disebabkan oleh pelarut. Kontrol pelarut bertujuan untuk melihat apakah selama perlakuan dilakukan secara aseptis sehingga tidak tumbuh bakteri ataupun jamur. Sebelum setiap setiap sel diberi senyawa uji perlu dilakukan inkubasi sel selama 24 jam, menggunakan incubator CO2, untuk conditioning sel sehingga dipastikan bahwa sel

tidak stress setelah mengalami pengenceran dan pencampuran serta dapat menyesuaikan diri seperti semula. Inkubasi selama 4 jam setelah pemberian reagen MTT dianggap merupakan waktu maksimal terbentuknya Kristal. Apabila Kristal belum terbentuk waktu inkubasi maksimal 6 jam (CCRC, 2013). Reagen stopper berfungsi untuk menghentikan reaksi yang terjadi antara sel dan MTT. Pengukuran intensitas warna ungu Kristal formazan sel HeLa menggunakan plate reader pada panjang gelombang 595nm. Semakin besar konsentrasi senyawa uji, maka nilai absorbansi (intensitas warna ungu) semakin rendah. Menandakan bahwa semakin besar konsentrasi senyawa maka semakin banyak sel yang mati (nilai absorbansi rendah). Dapat dilihat dari nilai r (koefisien korelasi yang didapatkan dari persamaan linear. Jika nilai r lebih besar dari r tabel (r = 0,8783) menunjukan linearitas seri konsentrasi. Semakin besar konsentrasi maka efek sitotoksik terhadap sel juga meningkat.

Gambar 2. (a) Kontrol sel HeLa sebelum pemberian reagen MTT, (b) Kontrol sel HeLa setelah

pemberian reagen MTT yang menghasilkan Kristal formazan berwarna ungu

(24)

8

fraksi n-heksana; fraksi etil asetat; fraksi metanol batang tanaman eceng gondok yang kemudian dihitung nilai % sel hidup.

Dibuat kurva grafik % Sel Hidup VS Konstrasi senyawa uji dari masing-masing senyawa uji sehingga akan didapatkan persamaan kurva baku. Persamaan kurva baku digunakan untuk menghitung nilai IC50. Nilai IC50 menggambarkan konsentrasi suatu

senyawa yang dapat menyebabkan 50% kematian sel dalam suatu populasi. Semakin kecil nilai IC50 maka semakin tinggi aktivitas senyawa dalam menyebabkan kematian sel. Nilai

IC50 dapat dihitung dengan mencari nilai x pada persamaan kurva baku dan mengganti nilai

y dengan 50. Nilai IC50 masing-masing senyawa uji dapat dilihat pada tabel I (dan

Lampiran 9).

Dari data pada tabel I dapat dilihat bahwa senyawa yang paling tinggi aktivitasnya adalah fraksi etil asetat daun eceng gondok dengan nilai IC50= 31,75µg/ml.

Tabel I. Nilai IC50 senyawa uji tanaman eceng gondok dan pelarut DMSO 1%

Daun Tanaman Eceng Gondok Batang Eceng Tanaman Gondok

r

*Sumber: National Cancer Institute, 2017.

Identifikasi Profil Metabolit Dengan KLT

(25)

9

untuk optimasi yang digunakan adalah n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 9:1, 3:2 dan 4:1 (Lampiran 10). Dari hasil optimasi didapatkan fase gerak yang optimal adalah n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 3:2 (Lampiran 10).

Berdasarkan hasil uji sitotoksik, nilai IC50 yang paling rendah adalah fraksi etil

asetat daun eceng gondok (tabel I). Dilihat pada gambar 3, hasil elusi ekstrak etanol 70%, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat dan fraksi metanol daun eceng gondok menggunakan fase gerak n-heksana : etil asetat (3:2) memiliki perbedaan spot antara ekstrak etanol 70%, fraksi n-heksana dan fraksi metanol dibandingkan dengan spot pada fraksi etil asetat. Hal ini menjelaskan adanya perbedaan aktivitas sesuai dengan hasil uji sitotoksik bahwa fraksi etil asetat yang paling aktif karena adanya perbedaan kandungan senyawa dalam fraksi tersebut.

(a) (b) (c)

Gambar 3. Hasil elusi dengan fase gerak optimasi n-heksana : etil asetat (3:2) pada

(a) Sinar tampak; (b) Sinar UV254nm; (c) Sinar UV366nm

ket: 1. Ekstrak etanol 70%; 2. Fraksi n-heksana; 3. Fraksi etil asetat; dan 4. Fraksi metanol daun eceng

gondok

(26)

10

yang telah dielusi, disemprot dengan reagen yang sesuai untuk mengidentifikasi kandungan senyawanya.

Golongan senyawa flavonoid diidentifikasi menggunakan reagen semprot AlCl3

(gambar 3a dan 3b). Identifikasi senyawa flavonoid akan memberikan perubahan dari warna kehitaman menjadi warna kuning setelah diberi reagen semprot AlCl3 (Marby,

Markham and Thomas, 1970).

(a) (b)

Gambar 4. Identifikasi senyawa flavonoid

(a) sebelum diberi reagen semprot, (b) setelah pemberian reagen semprotAlCl3.

Keterangan: 1. Sinar tampak, 2. Sinar UV256nm, 3. Sinar UV356nm

Golongan senyawa alkaloid diidentifikasi menggunakan reagen semprot dragendorff (gambar 3c dan 3d). Setelah disemprot, plat akan menunjukan bercak coklat-jingga, orange-merah atau coklat berlatar belakang kuning (Harborne, 1987).

(a) (b)

Gambar 5. Identifikasi senyawa Alkaloid

(a) sebelum diberi reagen semprot, (b) setelah pemberian reagen semprotDragendorff.

(27)

11

Golongan senyawa polifenol diidentifikasi menggunakan reagen semprot FeCl3

(gambar 4a dan 4b). Deteksi polifenol menggunakan pereaksi FeCl3 digunakan secara luas untuk mengidentifikasi senyawa fenol, tetapi tidak dapat digunakan untuk membedakan macam-macam golongannya (Robinson, 1995). Adanya senyawa fenol dapat ditunjukan dengan bercak warna, biru kehitaman, hijau atau biru kehijauan.

(a) (b)

Gambar 6. Identifikasi senyawa Polifenol

Keterangan: 1. Sinar tampak, 2. Sinar UV256nm, 3. Sinar UV356nm

Selanjutnya untuk identifikasi golongan senyawa triterpenoid dengan menggunakan reagen semprot Lieberman-Burchard (gambar 4c dan 4d). Hasil positif apabila terdapat bercak berwarna abu-abu sampai merah kecoklatan (Wagner, 2001).

(a) (b)

Gambar 7. Identifikasi senyawa Triterpenoid

(28)

12

Setelah pemberian reagen semprot

Kandung-Deteksi Rf Keterangan

(29)

13

Tabel III. Hasil prediksi golongan senyawa pada fraksi etil asetat daun eceng gondok

Jenis Golongan Senyawa Hasil

Flavonoid -

Polifenol -

Alkaloid -

Triterpenoid -

Hasil pengamatan menunjukan bahwa fraksi etil asetat pada daun tanaman eceng gondok tidak mengandung ke empat senyawa diatas yaitu flavonoid, polifenol, alkaloid maupun triterpenoid.

KESIMPULAN DAN SARAN

Hasil uji sitotoksik pada daun dan batang tanaman eceng gondok memiliki efek sitotoksik. Pada daun tanaman eceng gondok efek sitotoksik kategori sedang didapatkan pada ekstrak etanol 70%, fraksi n-heksana dan fraksi etil asetat, sedangkan kategori rendah didapatkan pada fraksi metanol. Pada batang tanaman eceng gondok efek sitotoksik kategori sedang didapatkan pada fraksi etil asetat dengan dan kategori rendah pada fraksi n-heksana. Identifikasi kandungan senyawa dilakukan pada fraksi etil asetat daun tanaman eceng gondok, dan tidak menunjukan adanya kandungan senyawa lavonoid, polifenol, alkaloid maupun triterpenoid. Fraksi tersebut mengandung senyawa gugus kromofor yang dapat berpendar pada deteksi sinar UV366nm.

(30)

14 DAFTAR PUSTAKA

Abdul A.B., et al, 2009. In Vitro Response of Cancer Cells to the Growth-Inhibitory Effects of Dichloromethane Extract of Goniothalamus umrosus. Research Journal of Pharmacology, 3(1):1-6.

Anggraeni, D. dan Erwin, 2015. Uji Fitokimia dan Uji Toksisitas (Brine Shrimp Lethality Test) Ekstrak Daun Kelakai (Stenochlaena palustris). Prosiding Seminar Tugas Akhir FMIPA UNMUL, ISBN : 978-602-72658-0-6.

CCRC-03-010-02; CCRC, Putri, H., 2013. CCRC-03-010-02 - Protokol Uji Sitotoksik Metode MTT. Cancer Chemoprevention Research Center, 23 (April), 2.

Ebada, S.S. et al., 2008. Methods for Isolation, Purification and Structural Elucidation of Bioactive Secondary Metabolites from Marine Invertebrates. Nature Protocol, 3(12):1820-31.

Enein, A.M.A. et al., 2014. Cytotoxic and Antioxidant Properties of Active Principals Isolated From Water Hyacinth Against Four Cancer Cells Lines. BMC Complementary and Alternative Medicine, 14:397.

Fawwaz, M., Wahyudin,E. dan Djide,M.N., 2013. Identifikasi Genistein Dan Efek Isoflavon Hasil Fermentasi Kedelai (Glycine max (L) MERILL) Terhadap Proliferasi Sel Osteoblast Secara In Vitro. JST Kesehatan, 3(4):395 – 402.

Freshney, R.I., 1986. Animal Cell Culture a Practical Approach. IRL Press Limited. Oxford, 183-185.

Garbi, M.I., Osman, E.E., and Kabbashi, A.S., 2015. Anticancer Activity of Bauhinia rufescens (Lam) leaf Extract on MCF-7 Human Breast Cancer Cells. Journal of Medicinal Plants Studies, 3 (5), 103-106.

Geraghty,R.J., et al., 2014. Guidelines for The use of Cell Lines in Biomedical Research. British Journal of Cancer, 111:1021–1046.

GLOBOCAN, 2012. Cervical Cancer Estimated Incidence, Mortality and Prevalance Worldwide in 2012, http://globocan.iarc.fr/old/FactSheets/cancers/cervix-new.asp. International Agency for Research on Cancer (IARC) accessed June 1, 2016.

Gomha, S.M., et al., 2015. Antimicrobial and Anticancer Evaluation of a Novel Synthetic Tetracyclic System Obtained by Dimroth Rearrangement. Journal the Serbian Chemical Society, 80 (10), 1251-1264.

Grodowitz, M. J., 1998. An active approach to the use of insect biological control for the management of non- native aquatic plants. Journal of Aquatic Plant Management, 36: 5761-5763.

Harborne, J.B., 1984. Phytochemical Methods A Guide To Modern Techniques of Plant Analysis. 2nd ed, London: Chapman and Hall.

Kementerian Kesehatan RI., 2015. Pusat Data dan Informasi Kementerian Kesehatan RI. Lenora, L.M., et al, 2015. Anticancer Activity Of Water Hyacinth (Eichornia Crassipes

(Mart) Solms) On Human Cervical Cancer Cell LinE. Octa Journal of Environmental Research, 3(4):327-331.

López, T., et al., 2012. Preparation and Characterization of Copper Compounds Co-Gelled with Nanostructured TiO2 Materials to be Used in Cancer Treatment. Science of Advance Materials, 4 (5), 579-582.

Mabry, T.J., Markham, K.R. and Thomas, M.B., 1970. The Systematic Identification of Flavonoids. Berlin, New York.

National Cancer Institute, 2017. http://www.cancer.gov/about-cancer accessed March 19, 2017.

(31)

15

Sastrohamidjojo, H., 1991. Kromatografi. Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada.

Umar, I. and Mohammed, B. A., 2013. Effect of Water Hyacinth (Eichhornia Crassipes (Mart) Solms) Leaf Extract on the Juvenile Mortality of Meloidogyne Incognita. IOSR Journal of Agriculture and Veterinary Science, 2319-2380,2319-2372.(4)46-48.

Wagner, H. and Bladt, S., 2001, 2nd ed. Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chomatography Atlas.Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, p. 328. Wang, H., et al, 2012. Plants Against Cancer: A Review on Natural Phytochemicals in

(32)

16

(33)

17

(34)

(35)

19

(36)

20

Lampiran 4. Data Penimbangan untuk Ekstraksi dan Fraksinasi Serbuk simplisia daun Serbuk simplisia batang

Bobot wadah : 78,93 g Bobot wadah : 83,46 g

Fraksi n-heksana batang 33,83 31,71 2,07 Fraksi etil asetat daun 27,73 29,79 2,06 Fraksi etil asetat batang 31,79 33,77 1,98

Fraksi metanol daun 34,52 36,63 2,11

(37)

21 Lampiran 5. Hasil Ekstraksi dan Fraksinasi

Ekstrak etanol 70% daun Ekstrak etanol 70% batang

Fraksi n-heksana daun Fraksi n-heksana batang

(38)

22

(39)

23 Lampiran 6. Pembuatan stok sampel uji

Konsentrasi awal stok sampel uji = 100,000 µg/mL

Fraksi n-heksana daun 0,9495 0,9605 0,0110 110 Fraksi n-heksana batang 0,9404 0,9513 0,0109 109 Fraksi etil asetat daun 0,9447 0,9554 0,0107 107 Fraksi etil asetat batang 0,9498 0,9614 0,0116 116 Fraksi mehanol daun 0,9350 0,9467 0,0117 117 Fraksi metanol batang 0,9357 0,9490 0,0133 133

Pembuatan stok sampel uji 500 µg/mL (untuk uji sitotoksik)

sampel uji + 995 µL MK

(40)

24 Lampiran 7. Menghitung kepadatan sel

Gambar a. Haemocytometer dan, b. Perbesaran dengan mikroskop Menghitung kepadatan sel menggunakan haemocytometer dengan rumus:

∑

Kemudian ditentukan jumlah sel yang harus diambil per well dengan rumus: ∑ ∑

∑

∑ Maka didapatkan:

∑

Uji sitotoksik per well 104

∑ ∑ ∑

(41)

25 Lampiran 8. Hasil Uji Sitotoksik

(a) (b)

Gambar sel HeLa (a) setelah pemberian senyawa uji, dan (b) setelah pemberian MTT, ekstrak etanol 70% daun eceng gondok konsentrasi 62,5µg/mL.

(c) (d)

(42)

26

(e) (f)

Gambar sel HeLa (e) setelah pemberian senyawa uji, dan (f) setelah pemberian MTT, fraksi n-heksana batang eceng gondok konsentrasi 62,5µg/mL.

(g) (h)

(43)

27

(i) (j)

Gambar sel HeLa (i) setelah pemberian senyawa uji, dan (j) setelah pemberian MTT, fraksi etil asetat daun eceng gondok konsentrasi 62,5µg/mL.

(k) (l)

(44)

28

(m) (n)

Gambar sel HeLa (m) setelah pemberian senyawa uji, dan (n) setelah pemberian MTT, fraksi metanol daun eceng gondok konsentrasi 62,5µg/mL.

(o) (p)

(45)

29

(q) (r) (s)

(46)

30 Lampiran 9. Perhitungan Nilai IC50

Data hasil absorbansi

(Diambil 5 seri konsentrasi 250; 125; 62,5; 31,25; 15,6 µg/mL)

_{̅ ̅} ̅ ̅

Absorbansi

SD

Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rata-rata

Kontrol sel 0,512 0,535 0,544 0,530 0,02 Kontrol

media

(47)

31 Ekstrak etanol 70% daun terhadap sel HeLa

Konsentrasi (µg/mL)

Ekstrak etanol 70% daun Absorbansi

%Sel Hidup VS Konsentrasi Ekstrak

Etanol 70% Daun Eceng Gondok

(48)

32 Ekstrak etanol 70% batang terhadap sel HeLa

Ekstrak etanol 70% batang Absorbansi

951,6317 0,8544 0,8783 Tidak toksik

y = -0.043x + 90.806

%Sel Hidup VS Konsentrasi Ekstrak

Etanol 70% Batang Eceng Gondok

(49)

33 Fraksi n-heksana daun terhadap sel HeLa

Konsentrasi

%Sel Hidup VS Konsentrasi Fraksi

N-Heksana Daun Eceng Gondok

(50)

34 Fraksi n-heksana batang terhadap sel HeLa

Konsentrasi

%Sel Hidup VS Konsentrasi Fraksi

N-Heksana Batang Eceng Gondok

(51)

35 Fraksi etil asetat daun terhadap sel HeLa

Fraksi etil asetat daun Absorbansi

%Sel Hidup VS Konsentrasi Fraksi Etil

Asetat Daun Eceng Gondok

(52)

36 Fraksi etil asetat batang terhadap sel HeLa

Fraksi etil asetat batang Absorbansi

%Sel Hidup VS Konsentrasi Fraksi Etil

Asetat Batang Eceng Gondok

(53)

37 Fraksi metanol daun terhadap sel HeLa

Konsentrasi

%Sel Hidup VS Konsentrasi Fraksi

Metanol Daun Eceng Gondok

(54)

38 Fraksi metanol batang terhadap sel HeLa

Konsentrasi

1848,7455 0,8889 0,8783 Tidak toksik

y = 0.0279x + 101.58

%Sel Hidup VS Konsentrasi Fraksi

Metanol Batang Eceng Gondok

(55)

39 Kontrol pelarut DMSO 1% terhadap sel HeLa

Konsentrasi

% Sel Hidup VS Konsentrasi Pelarut

DMSO 1%

% Sel Hidup VS Konsentrasi Pelarut DMSO 1%

(56)

40 Lampiran 10. Optimasi Fase Gerak

Menghitung nilai Rf:

(a) (b) (c)

Gambar optimasi fase gerak (a). n-heksana : etil asetat (9:1), (b). n-heksana : etil asetat (3:2) dan (c). n-heksana : etil asetat (4:1)

(57)

41

Tabel nilai Rf optimasi fase gerak n-heksana : etil asetat Fase gerak

n-heksana : etil asetat

Nilai Rf

Sinar UV254nm Sinar UV365nm

9 : 1

(58)

42

(a) (b) (c)

(d) (e) (f)

Gambar hasil fase gerak optimasi n-heksana : etil asetat (3:2) sebelum pemberian reagen

semprot serum IV sulfat, (a). Sinar tampak; (b). Sinar UV254nm; (c). Sinar UV366nm dan

n-heksana : etil asetat (3:2) setelah diberi reagen semprot, (d). Sinar tampak; (e). Sinar

UV254nm; (f). Sinar UV366nm. ket: 1. Ekstrak etanol 70%; 2. Fraksi n-heksana; 3. Fraksi etil asetat; dan 4.

(59)

43

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi bernama lengkap Natasha Queen Ferdinand dengan judul skripsi “Uji Aktivitas Sitotoksik Tanaman Eceng Gondok (Eichornia crassipes (Mart.) Solms)