35 BAB III
METODE PENELITIAN
A.Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dan pengumpulan data dilakukan selama 2 bulan yaitu bulan April – Mei 2015. Perlakuan dan proses pengambilan sample pada tikus dilakukan di Laboratorium Hewan Coba Universitas Sebelas Maret Surakarta. Pengukuran kadar serum TNF-α dilakukan di Laboratorium Patologi Klinik RS. Dr. Moewardi Surakarta.
B. Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan desain eksperimental murni dimana di dalamnya dilakukan randomisasi anggota kelompok yang masuk sebagai kelompok perlakuan maupun kelompok kontrol. Randomisasi dilakukan dengan tujuan setiap subyek mempunyai kesempatan yang sama dalam menerima salah satu jenis intervensi. Subyek penelitian dibagi dalam tiga kelompok yaitu kelompok sepsis, sepsis dengan pemberian deksmedetomidin dan sepsis dengan pemberian klonidin. Tikus wistar digunakan sebagai obyek penelitian dengan tujuan mencari perbedaan pengaruh deksdemetomidin dan klonidin terhadap kadar TNF-α pada sepsis polimikrobial. Adapun desain eksperimental murni penelitian ini tergolong pada “posttest control group design”.
Kelompok penelitian dibagi menjadi tiga yaitu kelompok kontrol (K), dan dua kelompok perlakuan P1 dan P2, penjelasannya sebagai berikut :
K : Kelompok Kontrol, tikus wistar yang dilakukan cecal inoculum kemudian diberikan NaCl 0,9%.
P1 : Kelompok perlakuan, tikus wistar yang dilakukan cecal inoculum kemudian diberikan deksmedetomidin intravena 10 mcg/kg/6 jam
P2 : Kelompok perlakuan, tikus wistar yang dilakukan cecal inoculum kemudian diberikan klonidin intravena 15 mcg/kg/6 jam
Skema rancangan penelitian adalah sebagai berikut : Cecal inoculum Sepsis
K 72 jam, 24 jam, penghitungan TNF-α Pemberian NaCl 0,9%
Cecal inoculum Sepsis
P1 72 jam, 24 jam, penghitungan TNF-α Deksdemetomidin iv 10 mcg/kg/6 jam Cecal inoculum Sepsis
P2 72 jam, 24 jam, penghitungan TNF-α Klonidin iv 15 mcg/kg/6 jam
Untuk mendapatkan hasil yang sahih maka ketiga kelompok tersebut harus sebanding, dengan melakukan randomisasi sehingga semua variabel menjadi seimbang.
Dengan demikian apabila pada akhir penelitian terdapat perbedaan efek pada kedua kelompok maka penyebab perbedaan tersebut merupakan akibat dari perlakuan yang diberikan (Sastroasmoro dan Sofyan, 2008).
Teknik pembutaan tunggal yang dimaksud dalam penelitian ini adalah pemeriksa atau pencatat data tidak mengetahui jenis perlakuan yang diperoleh pada kedua kelompok penelitian, sehingga tidak terjadi bias dalam penelitian.
C. Sampel Penelitian
Hewan coba adalah tikus wistar yang diperoleh dari Laboratorium Hewan Coba Universitas Sebelas Maret. Penentuan besar sampel menggunakan rumus Federer (Supranto, 2007) :
(t-1 ) (n-1) > 15
Keterangan :
t : jumlah kelompok penelitian
n : jumlah sampel per kelompok penelitian
Dalam hal ini ada tiga kelompok penelitian yaitu kelompok kontrol dengan memberikan NaCl 0.9% dan kelompok perlakuan dengan memberikan deksmedetomidin dan klonidin, maka hitungannya sebagai berikut :
(t-1)(n-1) > 15 (3-1)(n-1) > 15 (2)(n-1) > 15 n-1 >7.5
n >8.5
Berdasarkan rumus tersebut, jumlah sampel untuk tiap kelompok adalah 9 ekor atau lebih (n > 8,5). Jumlah kelompok ada tiga, sehingga penelitian ini membutuhkan minimal 27 ekor tikus wistar.
1. Kriteria Inklusi :
a. Tikus wistar keturunan murni b. Berjenis kelamin jantan
c. Belum pernah digunakan untuk penelitian d. Umur dua setengah sampai tiga bulan e. Berat badan 200 – 250 gram
f. Tikus wistar yang sepsis setelah disuntik cecal inoculum dengan kriteria: tanda-tanda piloerection, periocular discharge, tampak lesu/tidak aktif bergerak, penurunan nafsu makan dan minum, demam dan diare (Diding et al., 2008)
2. Kriteria Eksklusi
a. Mencit sakit selama masa adaptasi 7 hari (gerakan tidak aktif) b. Tikus wistar betina
c. Umur kurang dari dua setengah bulan atau lebih dari dua bulan d. Berat badan kurang dari 200 gram atau lebih dari 250 gram 3. Drop out:
a. Tikus wistar mati selama perlakuan berlangsung
b. Tikus wistar tidak sepsis setelah disuntik cecal inoculum intra peritoneal.
4. Besar Sampel
Besar sampel dihitung dengan menggunakan rumus diatas. Dengan rumus tersebut diperoleh minimal sampel tiap kelompok yaitu 9 (sembilan) ekor tikus.
5. Randomisasi
Minimal 27 ekor tikus dikelompokkan secara random menjadi tiga kelompok yaitu:
Kelompok K : minimal 9 ekor tikus Kelompok P1 : minimal 9 ekor tikus Kelompok P2 : minimal 9 ekor tikus D. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel Penelitian
a. Variabel bebas: deksmedetomidin dan klonidin.
b. Variabel tergantung: kadar serum TNF-α.
c. Variabel luaran: umur, berat badan, jantan
2. Definisi Operasional
a. Tikus wistar dengan sepsis polimikrobial
Definisi : tikus wistar adalah tikus albino yang sering dipakai dalam penelitian yang merupakan spesies Rattus norvegicus. Pada penelitian ini digunakan tikus wistar jantan dengan berat badan berkisar antara 200 – 250 gram, usia 2.5-3 bulan.
Sepsis polimikrobial adalah kondisi sepsis yang diciptakan dengan metode cecal inoculum. Tikus wistar yang sepsis setelah disuntik cecal inoculum selama 3 hari (Sini, 2015) dengan kriteria: tanda-tanda piloerection, periocular discharge, tampak lesu/tidak aktif bergerak, penurunan nafsu makan dan minum, demam dan diare (Diding et al., 2008)
Alat ukur : -
Satuan : ekor b. Deksmedetomidin
Definisi : Deksmedetomidin adalah agonis reseptor α-2adrenergik yang sangat selektif. Deksmedetomidine dengan sediaan @ vial Precedex mengandung 100 mcg/ml. Pemberian injeksi intravena dengan dosis 10 mcg/kgBB setelah dilakukan cecal inoculum. Dosis deksdemetomidin 1 – 2 mcg/kgBB pada manusia ditranslasikan ke tikus wistar menggunakan formula sesuai dengan body surface area (BSA) (Shaw et al., 2007)
HED (mg/kg) = Animal dose (mg/kg) x Animal Km
Human Km
Keterangan:
HED : Human Equivalent Dose, deksmedetomidin 1-2 mcg/kg Animal Km : Faktor konversi hewan, tikus = 6 Human Km : Faktor konversi manusia, dewasa = 37
Dosis translasi deksdemetomidin pada tikus wistar yang didapatkan dengan rumus ini adalah 6.1 sampai 12. 2 mcg/kgBB yang setara dengan 1-2 mcg/kgBB pada manusia dengan berat badan 60 kg
Alat ukur yang digunakan adalah spuit tuberkulin 1 ml
Satuan microgram
Data ordinal
c. Klonidin
Definisi : Klonidin adalah agonis adrenergik α-2 parsial selektif yang bekerja secara sentral. Pemberian injeksi intravena dengan dosis 15 mcg/kgBB setelah dilakukan cecal inoculum. Dosis klonidin 1-3 mcg/kgBB/12 jam pada manusia ditranslasikan ke tikus wistar menggunakan formula sesuai dengan body surface area (BSA) (Shaw et al., 2007)
HED (mg/kg) = Animal dose (mg/kg) x Animal Km
Human Km
Keterangan:
HED : Human Equivalent Dose, klonidin 1-3 mcg/kg
Animal Km : Faktor konversi hewan, tikus = 6 Human Km : Faktor konversi manusia, dewasa = 37
Dosis translasi klonidin pada tikus wistar yang didapatkan dengan rumus ini adalah 6.15–18.45 mcg/kgBB yang setara dengan 1-3 mcg/kgBB pada manusia dengan berat badan 60 kg
Alat ukur yang digunakan adalah spuit tuberkulin 1 ml
Satuan microgram
Data ordinal d. TNF-α
Definisi : TNF-α merupakan sitokin proinflamasi yang sangat berperan dalam keadaan sepsis dan peradangan.
Alat ukur : ELISA
Satuan : pg/ml
Data : Rasio
Data : ordinal E. Alat dan Bahan Penelitian
1. Bahan untuk perlakuan
Hewan coba adalah tikus wistar dengan umur 2,5 sampai 3 bulan dan berat 200- 250 gram. Tikus wistar adalah salah satu galur ratus-ratus, hidup di benua Amerika.
Banyak digunakan sebagai hewan coba dalam penelitian di bidang kedokteran, pengobatan, dan kedokteran hewan.
Tikus jenis wistar diperoleh dari Unit Pemeliharaan Hewan Percobaan, Universitas Sebelas Maret, Surakarta. Selama proses percobaan, hewan coba ditempatkan pada kandang dan diberi pakan standar dan minum secukupnya.
2. Bahan dan alat untuk pemeriksaan TNF-α Bahan untuk pemeriksaan TNF-α :
a. Serum dari tikus wistar
b. Quantikine® ELISA Rat TNF-α Immunassay Alat untuk pemeriksaan TNF-α:
a. Aquabidest 1,5 L.
b. Tabung reaksi/ test tube c. Gelas ukur
d. Micropipet10 µ -1000 µ + Tip pipet e. Vortex Mixer
f. Sheker 300 Rpm g. Microplate Washer
h. Microplate Reader450 NM – 630 NM F. Pelaksanaan Penelitian
Sejumlah 35 ekor tikus wistar di adaptasi selama 7 hari sebelum dibagi dalam tiga kelompok yang masing-masing terdiri dari minimal 9 ekor tikus yang ditentukan secara acak. Untuk kelompok satu (K) yang merupakan kelompok kontrol, dilakukan injeksi cecal inoculum 200 mg/kg/hari selama 3 hari untuk menginduksi sepsis kemudian dilanjutkan pemberian NaCl 0.9% 0,5 ml tiap 6 jam selama 24 jam. Untuk kelompok dua (P1) diberikan injeksi cecal inoculums 200 mg/kg/hari selama 3 hari berturut turut selanjutnya diberikan deksdemetomidin 10 mcg/kg/6 jam selama 24 jam secara intravena lewat vena kaudal. Untuk kelompok tiga (P2) diberikan injeksi cecal inoculums 200 mg/kg/hari selama 3 hari berturut turut ditambah dengan klonidin 15 mcg/kg/6 jam secara intravena lewat vena kaudal. Observasi dilakukan setelah 72 jam untuk mendapatkan tikus yang sepsis. Setelah tikus sepsis lalu dirandomisasi. Tikus – tikus sepsis tersebut kemudian diberi perlakuan, baik dengan NaCl 0.9%, deksmedetomidin, maupun klinidin dalam 24 jam. Setelah 24 jam perlakuan maka dilakukan pengambilan sampel darah intravena sebanyak 2 ml yang akan ditampung di tabung khusus untuk pemeriksaan TNF-α.
Gambar 3.1. Alur kerja G. Alur Kerja
Observasi 24 jam 27 ekor Tikus Wistar
Adaptasi 7 hari
Kelompok K (9 ekor)
Kelompok P1 (9 ekor)
Kelompok P2 (9 ekor) NaCl 0.9%
0.5 cc/6 jam
Deksdemetomidin 10 mcg/kg/6jam
Klonidin 15 mcg/kg/6jam
Sampel darah 2 ml untuk pengukuran TNF-α
Analisis Randomisasi Berhasil Gagal
Eksklusi Cecal inokulum
200 mg/kgBB/hari/i.p
Observasi selama 72 jam
Sepsis (+) Sepsis (-)
Drop out Tikus
mati
Drop out
H. Prosedur Pemeriksaan
1. Pengambilan dan penyimpanan sampel
Pada penggunaan sampel dengan bahan serum, digunakan serum separator tube dan biarkan sampel membeku selama 2 jam pada suhu ruang atau 1 malam pada 4oC sebelum dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 20 menit. Sampel bisa segera digunakan atau disimpan dahulu dalam aliquot pada suhu 4oC (bertahan untuk 5 hari), -20oC (bertahan dalam 1 bulan) atau -80oC (bertahan untuk 2 bulan). Jika sampel beku telah dicairkan maka sampel tidak dianjurkan untuk dibekukan lagi.
2. Assay Procedure
a. Sebelum dilakukan prosedur pengujian, semua reagen dan sampel disesuaikan dengan suhu ruangan.
b. Siapkan reagen, sampel, dan pengenceran standar sesuai dengan petunjuk sebelumnya.
c. Keluarkan microplate strip dari tempatnya, kemudian dikembalikan ke tempatnya yang mengandung pengering, dan disegel ulang.
d. Tambahkan 50 uL larutan pengencer RD1-63 pada setiap cawan.
e. Tambahkan 50 uL reagen standard, kontrol, atau sampel pada setiap cawan.
f. Campur perlahan-lahan dengan menekan tempat dari microplate strip tersebut selama 1 menit. Tutup dengan strip perekat yang sudah ada. Lalu diinkubasi selama 2 jam pada suhu ruangan. Desain tempat microplate tersebut disesuaikan dengan catatan sampel dan standar yang diuji.
g. Aspirasi setiap cawan kemudian dibilas, ulangi pembilasan sebanyak empat kali sehingga didapatkan jumlah total pembilasan sebanyak lima kali. Pembilasan dilakukan dengan mengisi tiap cawan dengan Wash Buffer (400 uL) menggunakan botol semprot, sejenis dispenser, atau autowasher. Menghilangkan sisa pelarut pada setiap cawan merupakan langkah yang baik. Setelah pembilasan terakhir, sisa Wash Buffer dihilangkan dengan aspirasi atau decanting. Bagian sebaliknya dari tempat microplate tersebut lalu diusap dengan handuk kertas yang bersih.
h. Tambahkan 100 uL TNF-α Conjugate tikus pada masing-masing cawan. Tutup dengan strip perekat yang baru. Inkubasi selama 2 jam pada suhu ruangan.
i. Ulangi aspirasi / pembilasan seperti langkah 5.
j. Tambahkan 100 uL Substrat Solution pada tiap cawan. Inkubasi selama 30 menit pada suhu ruangan. Lindungi dari cahaya.
k. Tambahkan 100 uL Stop Solution pada tiap cawan. Tekan tempat microplate pelan- pelan agar pencampurannya merata.
l. Tentukan densitas optik pada tiap cawan dalam 30 menit dengan menggunakan microplate reader yang diatur pada 450 nm. Jika tersedia korektor panjang gelombang, maka diatur ke 540 nm atau 570 nm. Jika tidak tersedia korektor panjang gelombang, kurangi pembacaan ke 540 nm atau 570 nm dari pembacaan di 450 nm. Pengurangan ini akan mengoreksi ketidaksempurnaan optik di microplate. Pembacaan langsung yang dibuat pada 450 nm tanpa koreksi mungkin akan didapatkan hasil yang lebih tinggi dan kurang akurat.
I. Cara Pengumpulan dan Analisis Data 1. Cara Pengumpulan Data
Setelah semua sampel dimasukkan dalam instrumen Vidas, akan diperoleh nilai TNF-α masing-masing sampel. Data akan dibandingkan antara kelompok K , P1, dan P2.
2. Analisis Data
Setelah data terkumpul, data dianalisis dengan menggunakan program SPSS 17.0.
Untuk menguji perbedaan rata-rata nilai TNF-α diantara ketiga kelompok dan statistik diuji dengan uji Anova dilanjutkan dengan Post Hoc Test dengan syarat data normal dan homogen. Bila uji prasyarat tersebut tidak terpenuhi maka diuji alternative dengan Kruskal-Wallis Test dan dilanjutkan dengan Mann Whitney Test. Dan dianggap memiliki kemaknaan statistik apabila nilai p yang diperoleh adalah p ≤ 0,05. Setelah data terkumpul dilakukan data cleaning, coding dan tabulasi. Analisis data meliputi analisis deskriptif dalam bentuk rerata, SD, median dan grafik dan uji hipotesis.
J. Etika Penelitian
Penelitian ini telah diajukan ke komisi etik penelitian kesehatan fakultas kedokteran universitas sebelas maret surakarta dengan menerapkan prinsip tiga R dalam protokol penelitian, yaitu:
1. Replacement, adalah keperluan memanfaatkan hewan percobaan sudah diperhitungkan secara seksama, baik dari pengalaman terdahulu maupun literatur untuk menjawab pertanyaan penelitian dan tidak dapat digantikan oleh makhluk hidup lain seperti sel dan biakan jaringan.
2. Reduction, adalah pemanfaatan hewan dalam penelitian sesedikit mungkin tetapi tetap mendapatkan hasil yang optimal. Dalam penelitian ini sample dihitung berdasarkan rumus Federer yaitu (n-1) (t-1) ≥ 15, dengan n adalah jumlah hewan yang diperlukan dan t adalah jumlah kelompok perlakuan.
3. Refinement, memperlakukan hewan percobaan secara manusiawi dengan prinsip dasar membebaskan hewan coba dalam beberapa kondisi.
a. Bebas dari rasa lapar dan haus. Pada penelitian ini hewan coba diberikan pakan standar dan minum secara et libitum.
b. Bebas dari ketidaknyamanan, pada penelitian ini hewan coba di tempatkan di animal house dengan suhu terjaga antara 20-25°C, kemudian hewan coba terbagi menjadi 10 ekor tiap kandang. Animal house berada jauh dari gangguan bising dan aktivitas manusia serta kandang dijaga kebersihannya sehingga mengurangi stress pada hewan coba.
Prosedur pengambilan sampel pada akhir penelitian telah dijelaskan dengan mempertimbangkan tindakan manusiawi dan anasthesia serta euthanasia dengan manusiawi oleh orang yang terlatih untuk meminimalisasi atau bahkan meniadakan penderitaan hewan coba (Schapiro dan Everiit, 2006)
K. Jadwal Penelitian
Bulan April Mei Juni Juli Agustus September
Pengambilan data Pengolahan dan analisa data
Penyusunan laporan penelitian
Presentasi hasil penelitian
