GINJAL TIKUS (Rattus norvegicus) YANG DIINDUKSI DIABETES DENGAN ALOKSAN
SKRIPSI
ANNISA NURASYAH 160805092
PROGRAM STUDI S1 BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN 2021
GINJAL TIKUS (Rattus norvegicus) YANG DIINDUKSI DIABETES DENGAN ALOKSAN
SKRIPSI
Diajukan untuk melengkapi tugas dan memenuhi syarat mencapai gelar Sarjana sains
ANNISA NURASYAH 160805092
PROGRAM STUDI S1 BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN 2021
GINJAL TIKUS (Rattus norvegicus) YANG DIINDUKSI DIABETES DENGAN ALOKSAN
ABSTRAK
Penelitian tentang pengaruh ekstrak etanol daun sikkam (Bischofia javanica) terhadap gambaran histologi ginjal tikus (Rattus norvegicus) yang diinduksi diabetes dengan aloksan telah dilakukan dari bulan Februari 2020 sampai dengan November 2020. Daun sikkam merupakan tumbuhan herba yang dimanfaatkan sebagai antidiabetes. Efek daun sikkam dalam mengobati kerusakan ginjal diabetes masih perlu diteliti. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol daun sikkam pada histologi ginjal yaitu mengurangi penebalan membran basalis dan jumlah sel mesangial glomerulus. Penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang terdiri dari 6 perlakuan, yaitu kontrol K(-) kontrol aloksan K(+), dan empat kelompok perlakuan yaitu perlakuan ekstrak etanol daun sikkam 300 (K1), 600 (K2), 900 (K3) dan glibenklamid 0,45 mg/KgBB (K4). Perlakuan dilakukan selama 28 hari kemudian tikus dibedah untuk diambil organ ginjal, ditimbang dan dibuat preparat menggunakan metode parafin dengan pewarnaan Hematoxylin dan Eosin (HE). Hasil pemberian ekstrak etanol daun sikkam berpengaruh terhadap berat ginjal dan morfometri ginjal, terutama pada P3 yang memiliki rata-rata lebih tinggi dari perlakuan lain. Ekstrak etanol daun sikkam memberikan penurunan terhadap ketebalan membran basalis glomerulus, dan jumlah sel mesangial glomerulus ginjal sehingga dapat memperbaiki kerusakan pada organ ginjal akibat diabetes.
Kata kunci: Diabetes, daun sikkam (Bischofia javanica), ginjal, membran basalis glomerulus, sel mesangial
FEATURE OF THE KIDNEY IN ALLOXAN-INDUCED DIABETIC RAT (Rattus norvegicus)
ABSTRACT
The effect of an ethanol extract of bishopwood (Bischofia javanica) leaves on the histological feature of the kidney in the alloxan-induced diabetic rat (Rattus norvegicus) was studied from February 2020 to November 2020. Bishopwood is an herbaceous plant that is traditionally used as an antidiabetic. The effect of bishopwood leaves on diabetic kidneys still needs to be studied. The purpose of this study is to determine the effect of ethanol extract of bishopwood leaves on kidney histology, especially in reducing basement membrane thickess and the number of mesangial cells in the glomerulus. The experiment used a completely randomized design (CRD) which consisted of 6 treatments, with three control groups (negative control, alloxan control, and glibenclamide group of 0.45 mg/Kg BW) and three extract groups, where rats were given bishopwood leaves ethanol extract of 300, 600, or 900 mg/kg body weight. The treatment was carried out for 28 days, then the rats were dissected, the kidneys were taken to be weighed, made tissue section using the paraffin method stain with Hematoxylin and Eosin (HE staining). The treatment affected kidney weight and morphometry, especially on the 900 mg/kg body weight group, which had a higher average than other groups. The ethanol extract of bishopwood leaves decreased the glomerular basement membrane's thickness and kidney glomerular mesangial cells. The result indicates that the ethanol extract of bishopwood leaves could positively affect the kidney's damage caused by diabetes.
Keywords : Diabetic, bishopwood (Bischofia javanica), kidney, glomerular basement membrane, mesangial cells.
Puji dan syukur penulis ucapkan kepada Allah SWT atas karunia dan nikmat yang telah diberikan. Shalawat berangkaikan salam penulis sampaikan kepada Nabi besar Muhammad SAW, yang telah membwa kita dari zaman kegelapan ke zaman yang terang seperti saat ini, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan judul “Pengaruh Ekstrak Daun Sikkam (Bischofia javanica) Terhadap Gambaran Histologis Ginjal Tikus (Rattus norvegcicus) Yang Diinduksi Diabetes Dengan Aloksan”.
Penelitian dan penulisan skripsi ini dapat diselesaikan dengan baik dikarenakan dukungan dan masukan dari beberapa pihak. Kesempatan yang berbahagia ini penulis ingin mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada:
1. Bapak Dr. Salomo Hutahaean, M.Si selaku dosen pembimbing yang telah meluangkan waktunya dalam memberikan ilmu, saran, dan bimbingan. Ucapan terimakasih penulis kepada Bapak Prof. Dr Syafruddin Ilyas, M.Biomed selaku dosen penguji 1 dan Ibu Dr.
Saleha Hannum, M.Si selaku dosen penguji 2 yang telah memberikan arahan, saran serta ilmu untuk meyempurnakan penulisan skripsi ini.
2. Bapak Doni Aldo Samuel Siahaan, S.Si, M.Si selaku dosen penasihat akademik yang selalu memberikan motivasi.
3. Ibu Dr. Saleha Hannum, M.Si dan Bapak Riyanto Sinaga, S.Si, M.Si selaku ketua dan sekretaris departemen Biologi USU.
4. Seluruh Pengajar dan staff departemen Biologi USU.
5. Ibu Mizawarti, S.Si, M.Si selaku dosen pembimbing pengabdian masyarakat 2019/2020 yang telah mmeberikan dukungan, semangat dan motivasi pada penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.
6. Seluruh staf ahli dan asisten laboratorium struktur hewan FMIPA USU, serta rekan-rekan mahasiswa 2016 S1 Biologi USU.
Secara khusus penulis mengucapkan terimakasih kepada orang tua penulis yaitu Muhammad Ishak dan Nilawati atas doa serta jasa-jasa beliau membesarkan dan mendidik serta memberi dukungan sepenuhnya kepada penulis sehingga
doa dan dukungan sepenuhnya kepada penulis. Penulis juga mengucapkan banyak terimakasih kepada Kak Cheryl Grace Pratiwi Rumahorbo yang telah memberi dukungan, perhatian, dan motivasi pada penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.
Terimakasih sebanyak-banyaknya penulis ucapkan kepada sahabat dan teman seperjuangan Silvia yang selalu memberi semangat, dukungan, motivasi, dan selalu bersama dengan penulis sehingga dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulis mengucapkan terimakasih kepada sahabat dan teman seperjuangan “Carbon Cycle”
(Sitik, Emil, Olvita, Cindy, Randi, Cege, Vini, Maudyna, Silvia, Edi, Arep, Febri, Gilang dan Ilmal) yang memberikan dukungan dan semangat kepada penulis. Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada tim “Pengabdian Horas” (Elya, Mustika, Santi, Silvia, Maudyna) yang memberikan dukungan kepada penulis.
Penulis menyadari sepenuhnya bahwa masih terdapat banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini. Kritik dan saran yang membangun sangat diharapkan demi kesempurnaan skripsi ini. Untuk segala partisipasi dan dukungannya penulis mengucapkan banyak terimakasih.
Medan, Mei 2021
Penulis
Halaman
LEMBARAN PENGESAHAN i
ABSTRAK ii
ABSTRACT iii
PENGHARGAAN iv
DAFTAR ISI vi
DAFTAR GAMBAR viii
DAFTAR LAMPIRAN ix
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang 1
1.2 Rumusan Masalah 3
1.3 Hipotesis 3
1.4 Tujuan Penelitian 3
1.5 Manfaat Penelitian 4
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tumbuhan Sikkam (Bischofia javanica) 5
2.2 Diabetes Melitus (DM) 6
2.3 Induksi Diabetes dengan Aloksan 8
2.4 Ginjal 8
2.5 Glomerulus dan Tubulus Proksimal 10
2.6 Kelainan Ginjal 11
2.7 Nefropati Diabetik 11
BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat 13
3.2 Alat dan Bahan 13
3.3 Prosedur Penelitian 14
3.3.1 Rancangan Penelitian 14
3.3.2 Pembuatan Ekstrak Daun Sikkam 15 (Bischofia javanica)
3.3.3 Pembuatan Sediaan Uji 15
3.3.4 Persiapan Hewan Percobaan 15
3.3.5 Menginduksi Diabetes Hewan Uji dengan Aloksan 15 3.3.6 Pemberian Ekstrak Etanol Daun Sikkam 16 3.3.7 Pengukuran Kadar Glukosa Darah 16 3.3.8 Pembuatan Preparat Histologi Ginjal 16
3.3.9 Parameter Pengamatan 18
3.3.10 Analisis Data 18
4.2 Morfometri Ginjal 20
4.3 Tebal Membran Basalis Glomerulus 21
4.4 Jumlah Sel Mesangial 22
4.5 Gambaran Histologi Ginjal 24
BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan 26
5.2 Saran 26
DAFTAR PUSTAKA 27
LAMPIRAN 31
Nomor Gambar
Judul Halaman
2.1 Buah dan Daun Bischofia javanica 5
2.2 Sketsa Pohon Sikkam (Bischofia javanica)
6
2.3 Struktur Ginjal 9
2.4 Histologi Ginjal 10
2.5 Sketsa Ginjal Nefropati diabetik 12
4.1 Berat Ginjal 19
4.2 Morfometri Ginjal 20
4.3 Tebal Membran Basalis Glomerulus 21
4.4 Jumlah Sel Mesangial 23
4.5 Gambaran Histologi Ginjal 24
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor Lampiran
Judul Halaman
1 Foto Alat dan Bahan 31
2 Surat Identifikasi Tumbuhan 32
3 Foto Kerja 33
4 Analisis Data 34
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Sumber daya alam yang ada di Indonesia sangat berlimpah, terutama tumbuhan yang memiliki khasiat. Tumbuhan ini dikenal dengan tumbuhan herbal.
Tumbuhan herbal digunakan masyarakat untuk menyembuhkan penyakit dan menjaga kesehatan manusia. Tumbuhan herbal diolah dengan memanfaatkan senyawa kimianya sebagai obat. Menurut Suhita et al., (2013), efek samping yang dihasilkan dari obat herbal jauh lebih kecil dibandingkan dengan obat sintesa.
Salah satu tanaman yang memilki khasiat yaitu tumbuhan sikkam (Bischofia javanica). Tumbuhan sikkam dimanfaatkan daunnya sebagai obat tradisional. Daun sikkam mengandung komponen utama yang telah diisolasi seperti; tanin, ßamyrins, asam betulinik, epifriedelinol, friedelin, luteolin, glukosida, quercetin, beta-sitosterol, stigmosterol, dan asam ursolik. Daun-daun sikkam digunakan dalam pengobatan payudara yang sakit akibat air asi, sakit tenggorokan, diare, gangguan saraf, dan untuk merangsang pertumbuhan rambut (Bachheti et al., 2013).
Dalam pengobatan tradisional sikkam dimanfaatkan untuk mengobati berbagai penyakit seperti kanker, peradangan, TBC, luka bakar, difteri, faringitis, radang amandel, dan berbagai kondisi alergi. Tumbuhan sikkam berpotensi menjadi obat antidiabetik karena ditemukannya senyawa quercetin pada tanaman tersebut.
Senyawa quercetin memiliki efek antioksidan untuk mencegah kerusakan sel ß pankreas, membantu meningkatkan sekresi insulin, meningkatkan sirkulasi adipoknetik, dan menghambat aktivitas glukosidase pada usus halus (Arias et al., 2014). Ekstrak metanol daun sikkam memiliki manfaat sebagai antioksidan, antiinflamasi, dan antinosiseptif (Mai, 2017). Menurut Majeed (2019), bagian daun sikkam dijadikan sebagai obat difteri, faringitis, penyakit kulit, antileukimia, dan antidiabetes.
Diabetes melitus (DM) adalah suatu penyakit yang ditandai dengan hiperglikemia kronik, yaitu peningkatan kadar glukosa darah dalam jangka lama, dan gangguan metabolisme khususnya karbohidrat di dalam tubuh yang disebabkan kelainan sekresi insulin, kerja insulin, atau keduanya (Ningrum et al., 2017).
Hiperglikemia kronis dapat menyebabkan kerusakan berlanjut pada organ baik disfungsi ataupun kegagalan berbagai organ. Kerusakan yang ditimbulkan akibat diabetes melitus dikenal dengan mikroangiopati atau kerusakan pembuluh darah kecil yang meliputi nefropati, neuropati, dan retinopati (Kamaliani et al., 2019).
Hiperglikemia kronis juga berhubungan dengan kerusakan dalam jangka waktu lama pada saraf, jantung, pembuluh darah, mata, dan ginjal (Handani et al., 2015).
Ginjal merupakan organ penting yang berfungsi untuk membuang sisa metabolisme dan racun dalam tubuh. Organ ginjal sangat rentan terhadap pengaruh zat–zat kimia melalui sirkulasi peredaran darah yang dapat mengakibatkan perubahan patologik (Suhita et al., 2013). Ginjal berperan dalam proses ekskresi obat, yang apabila mengalami gangguan, obat tersebut akan mengalami perubahan kadar didalam darah dan kemudian diekskresikan melalui ginjal (Nurdiniyah et al., 2015). Kerusakan ginjal dapat berupa nekrosis tubulus yang disebabkan oleh bahan toksik yang direabsorbsi. Bahan toksik yang masuk mengenai secara langsung sel epitel pada tubulus, sehingga menyebabkan nekrosis tubulus (Muktti et al., 2012).
Gangguan ginjal dapat pula menimbulkan komplikasi diabetes pada ginjal yang disebut nefropati diabetik. Penyakit ini ditandai dengan albuminaria menetap (>300 mg/24 jam) pada pemeriksaan 3 sampai 6 bulan. Perubahan histologi yang terlihat pada penyakit ini dapat berupa perubahan membran basalis glomerulus, ekspansi sel- sel mesangial,dan perubahan arteriol glomerulus (Larasti, 2010).
Penyakit diabetes melitus yang terjadi karena gula darah tinggi, sudah banyak menyerang manusia. Kadar gula darah yang tinggi menyebabkan kerusakan pada struktural ginjal. Gangguan ginjal akibat diabetes melitus diindikasikan dengan peningkatan kreatinin serum, asam urat, dan nitrogen urea darah (Kamaliani et al., 2019). Gangguan akibat diabetes melitus memerlukan pengobatan yang cukup lama dan biaya mahal. Penggunaan obat-obatan kimia dapat menimbulkan komplikasi karena efek obat tersebut. Alternatif yang dapat digunakan untuk pengobatan diabetes melitus yaitu mencari obat tradisional tanpa efek samping, murah, dan terjangkau bagi masyarakat. Daun sikkam merupakan tanaman herba yang dapat dimanfaatkan kandungannya untuk mengobati penyakit diabetes melitus dan kerusakan organ akibat diabetes melitus. Pengaruh daun sikkam dalam memperbaiki kerusakan organ ginjal pada diabetes melitus belum terbukti secara ilmiah. Oleh
karena itu, peneliti tertarik untuk melakukan penelitian terhadap tanaman sikkam yang diduga dapat berpengaruh terhadap histologis ginjal diabetes melitus.
1.2 Rumusan Masalah
Permasalahan dalam penelitian ini adalah:
a. Apakah pemberian ekstrak etanol daun sikkam berpengaruh terhadap berat ginjal tikus yang diinduksi diabetes dengan aloksan?
b. Apakah pemberian ekstrak etanol daun sikkam berpengaruh dalam mengurangi ketebalan membran basalis glomerulus ginjal tikus yang diinduksi diabetes dengan aloksan?
c. Apakah pemberian ekstrak etanol daun sikkam berpengaruh dalam mengurangi jumlah sel mesangial ginjal tikus yang diinduksi diabetes dengan aloksan?
1.3 Hipotesis
Hipotesis dari penelitian ini adalah:
a. Pemberian ekstrak etanol daun sikkam dapat menurunkan berat ginjal tikus yang diinduksi diabetes dengan aloksan.
b. Pemberian ekstrak etanol daun sikkam dapat mengurangi ketebalan membran basalis glomerulus ginjal tikus yang diinduksi diabetes dengan aloksan.
c. Pemberian ekstrak etanol daun sikkam dapat mengurangi jumlah sel mesangial ginjal tikus yang diinduksi diabetes dengan aloksan.
1.4 Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah:
a. Untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol daun sikkam terhadap berat ginjal tikus yang diinduksi diabetes dengan aloksan.
b. Untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol daun sikkam terhadap penebalan membran basalis glomerulus ginjal tikus yang diinduksi diabetes dengan aloksan.
c. Untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol daun sikkam terhadap jumlah sel mesangial ginjal tikus yang diinduksi diabetes dengan aloksan.
1.5 Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah untuk memberikan informasi ilmiah kepada masyarakat luas pengaruh ekstrak etanol daun sikkam terhadap histologi ginjal tikus yang diinduksi diabetes dengan aloksan dan sebaga acuan refrensi bagi pihak yang membutuhkan.
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tumbuhan Sikkam (Bischofia javanica)
Sikkam berasal dari ordo Euphorbiales dan famili Filantaceae yang hidup di dataran rendah dengan ketinggian kurang lebih 1500m dari permukaan laut.
Tumbuhan sikkam berasal dari Asia selatan, Asia Tenggara, Austrlia, dan China, dan sudah menyebar luas ke barat India, selatan Jepang, timur Australia, Pasifik hinga kepulauan Indonesia. Di Indonesia tumbuhan sikkam memiliki beberapa nama daerah seperti: Cingkam (Batak); tingkeum (gayo); gadog, gintung, kerinjing (Jawa).
Di negara-negara lain disebut sebagai jitang (Malaysia), tuai (Sabah, Filipina), toem pradusom (Thailand), khom (Laos), dan nhoi (Vietnam) (Prabowo, 2019). Pada Gambar 2.1 disajikan gambar buah dan daun tumbuhan sikkam.
Gambar 2.1 Buah dan daun Bischofia javanica (Rajbongshi et al., 2014).
Pohon sikkam memiliki tinggi mencapai 40 m, diameter batang 95-150 cm, bercabang-cabang arah tumbuh tegak lurus, berkayu biasanya keras dan kuat, bentuk batang bulat, tanpa mata kayu, termasuk dalam tumbuhan menahun. Kulit batang luar memecah dan bersisik bewarna coklat kemerahan hingga keunguan, disebelah dalam warna merah jambu, meyerat, dan mengeluarkan getah bewarna merah bening, encer aga kental, seperti jeli. Daun bewarna hijau panjang 4-8 inci dengan ketebalan 7-22 mm, bentuk daun lonjong berlekuk tiga serta meruncing ke ujung daun. Letak daun spiral/melingkar, mempunyai tangkai daun panjang (3-8 inci), tepinya beringgit
hingga bergerigi halus, bertulang daun menyirip, sisi atas mengkilap. Buah tidak memecah, bulat, bergetah, bergaris tengah 1,2-1,5 cm bewarna hitam kebiruan jika masak, dengan 1-2 biji disetiap ruang, biji berwarna coklat, lonjong, panjang 5 mm (Prabowo, 2019). Pada Gambar 2.2 disajikan sketsa pohon sikkam.
Gambar 2.2 Sketsa Pohon Sikkam (Boschofia javanica) (Lemmens dan Soetjipto, 1992).
Bagian-bagian pada tumbuhan memiliki kandungan senyawa kimia yang dapat dimanfaatkan seperti flavonoid, fenolik, saponin, steroid, alkaloid, dan tannin (Ihwan et al., 2018). Pada daun sikkam juga mengandung asam ellagik, friedelin, beta sitosterol, dan vitamin C. Kandungan yang terdapat pada tumbuhan sikkam dimanfaatkan untuk mengobati beberapa penyakit. Kandungan tersebut digunakan sebagai antinematoda, antimikroba, antileukimia, antioksidan, antiinflamasi, anti alergi, anti penuaan pada kulit dan antidiabetes (Rajbongshi et al., 2014).
2.2 Diabetes Melitus (DM)
Diabetes melitus adalah penyakit yang terjadi akibat hiperglikemia dan gangguan metabolisme karbohidrat, lemak, dan protein yang berhubungan dengan kerja atau sekresi insulin. Diabetes melitus disebut juga the silent killer karena dapat meyerang dan menyebabkan kerusakan organ-organ lain dalam tubuh. Kerusakan lain yang dapat ditimbulkan dari penyakit ini antara lain gangguan penglihatan mata, katarak, penyakit jantung, sakit ginjal, impotensi seksual, luka sulit sembuh dan membusuk/gangren, infeksi paru-paru, gangguan pembuluh darah, stroke dan sebagainya (Fatimah, 2015).
Penyakit diabetes melitus menurut Internasional Diabetes Federation (IDF) telah menjadi kematian terbanyak didunia. Penderita diabetes pada tahun 2019 tercatat sebanyak 351,7 juta jiwa yang tersebar di seluruh dunia. Angka penderita diabetes akan diperkirakan terus meningkat sebanyak 417,3 hingga 486,1 juta jiwa pada tahun 2030 dan 2045. Negara dengan perekonomian sedang dan kebawah merupakan negara yang peningkatan penderita diabetes tertinggi. Indonesia merupakan negara peringkat ke tujuh penderita diabetes terbanyak dari seluruh dunia. Pada tahun 2019, Indonesia tercatat 10,7 juta jiwa terkena diabetes dan diperkirakan akan terus meningkat hingga 2045. Kenaikan penderita diabetes pada 31 provinsi Indonesia mencapai angka 93,9% dan terus meningkat setiap tahunnya (Internasional Diabetes Federation, 2019).
Diabetes melitus sebagai penyakit kronis terjadi akibat ketidakmampuan kerja fungsi insulin. Kegagalan fungsi insulin disebabkan oleh gangguan atau defisiensi insulin oleh sel-sel beta langerhans kelenjar pankreas, atau kurangnya respon sel-sel tubuh terhadap insulin. Seseorang dikatakan diabetes apabila glukosa darah lebih dari 120 mg/dL pada keadaan puasa atau lebih dari 200 mg/dL untuk 2 jam setelah makan (Yosmar et al., 2018). Penyakit diabetes ditimbulkan akibat pola hidup yang tidak sehat seperti diet yang tidak seimbang, kurang ativitas fisik, berat badan yang lebih (obesitas), hipertensi, dan konsumsi alkohol serta kebiasan merokok. Selain faktor pola hidup, penyakit diabetes disebabkan oleh faktor usia, jenis kelamin, dan keturunan (Toharin et al., 2015).
Penyakit diabetes melitus diklasifikasikan menjadi beberapa tipe yang dikelompokkan berdasarkan penyebab dan usia penderitanya. Diabetes melitus tipe 1 merupakan penyakit yang biasa menyerang pada anak-anak dan dewasa muda. Tipe ini terjadi akibat adanya destruksi sel-β dan defisiensi insulin. Diabetes melitus tipe 2 merupakan penyakit yang diakibatkan oleh karena gaya hidup yang salah seperti jarang olahraga, obesitas, dan pola makan yang tidak teratur. Tipe ini ditandai dengan defisiensi insulin, gangguan sekresi insulin, serta resistensi insulin (Larasti, 2010).
Peningkatan kadar glukosa yang tinggi pada diabetes melitus menjadi penyebab kerusakan struktur ginjal. Keadaan angiopati menyebabkan penyempitan dan penyumbatan pembuluh darah, diikuti dengan plasma darah memiliki kekentalan
yang tinggi. Pengantaran oksigen dan nutrisi melalui pembuluh darah ke jaringan menjadi berkurang dan menyebabkan nekrosis atau kematian sel pada organ ginjal.
Nekrosa dengan siat lokal dapat diperbaiki melalui proses regenerasi sel apabila penyebabnya dihilangkan, sementara nekrosa dengan sifat difusa, sel yang mati digantikan oleh jaringan ikat (Kamaliani et al., 2019).
2.3 Induksi Diabetes dengan Aloksan
Aloksan adalah bahan kimia yang digunakan untuk menginduksi hewan percobaan untuk menghasilkan kondisi diabetik secara cepat. Pemberian aloksan pada hewan coba dapat dilakukan secara intravena, intraperitoneum, dan subkutan.
Aloksan yang diberikan tergantung dengan kadar insulin pada hewan coba untuk menyebabkan kondisi diabetes. Pada hewan coba tikus dihasilkan diabetes dengan menginjeksikan aloksan sebanyak 120-150 mg/kg bobot badan (Handani et al., 2015). Aloksan merupakan senyawa hidrofilik yang tidak stabil. Waktu paro pada suhu 37oC dan pH netral adalah 15 menit dan bisa lebih lama pada suhu yang lebih rendah. Aloksan bersifat selektif toksik terhadap sel beta pankreas karena aloksan yang terakumulasi melalui transpor glukosa yaitu GLUT2 (Irdalisa et al., 2015).
Pemberian aloksan meningkatkan pelepasan insulin dan protein sel beta pankreas yang tidak berpengaruh pada sekresi glukagon. Efek diabetik yang dihasilkan oleh aloksan merusak membran sel beta dengan meningkatkan permeabilitas. Aksi toksik aloksan pada sel beta diinisiasi oleh radikal bebas dengan reaksi redoks, sehingga meningkatkan konsentrasi kalsium sitosol yang menyebabkan destruksi cepat sel beta (Yuriska, 2009). Mekanisme kerja aloksan secara in vitro menginduksi pengeluaran mitokondria dan ion kalsium. Pengeluaran ini menyebabkan proses oksidasi sel terganggu dan gangguan homeostatis yang berakibat pada kematian sel (Akrom et al., 2014).
2.4 Ginjal
Ginjal adalah organ vital dalam tubuh yang mempertahankan kestabilan tubuh. Ginjal memiliki warna cokelat kemerahan dengan permukaan yang halus.
Pada bagian luar ginjal dibungkus oleh simpai jaringan fibrosa tipis. Tepi medial pada ginjal yang cekung terdapat celah vertikal yang disebut hilum renal dimana
tempat arteri renalis masuk dan vena renalis serta pelvis renalis keluar. Ginjal memiliki dua daerah utama yaitu korteks pada bagian luar dan medula pada bagian dalam. Tikus mempunyai ginjal yang unilobar atau unipiramidal. Pada ginjal terdapat nefron yang terdiri dari bagian yang melebar, korpuskulus ginjal, tubulus kontortus proksimal, segmen tebal dan tipis ansa henle, dan tubulus kontortus distal (Putri, 2018).
Bentuk ginjal seperti biji kacang dan hilum pada ginja menghadap ke tulang punggung. Sisi luarnya cembung. Pembuluh-pembuluh pada ginjal masuk dan keluar melalui hilum. Letak ginjal berada pada dinding posterior abdomen, disebalah kanan dan kiri tulang belakang. Ginjal dibungkus oleh lapisan lemak tebal, dibelakang peritoneum. Kedudukan ginjal diperkirakan dari belakang, mulai dari ketinggian vertebrata torkalis terakhir sampai vertebrata lumbalis ketiga. Letak ginjal kanan lebih rendah dari ginjal kiri, karena hati menduduki banyak ruang disebelah kanan (Pearce, 2009). Pada Gambar 2.3 disajikan struktur ginjal normal.
Gambar 2.3 Struktur Ginjal (Jones et al., 1986).
Ginjal merupakan organ tubuh yang memiliki beberapa fungsi penting. Ginjal berfungsi dalam mengatur darah yang masuk untuk kemudian di metabolisme untuk pengeluaran zat sisa seperti urin, dan zat-zat beracun yang masuk melalui makanan dan obat-obatan. Ginjal memproduksi sel darah merah dalam sumsum tulang dan mengatur tekanan darah dengan melepaskan enzim renin. Fungsi lain ginjal adalah pengaturan konsentrasi ion-ion tubuh, pengendalian asam basa tubuh, dan pengaturan ekskresi asam amino dan glukosa darah yang berlebih pada tubuh (Sloane, 2004).
2.5 Glomerulus dan Tubulus Proksimal
Ginjal terbentuk oleh unit yang berjumlah 1 sampai 1,2 juta nefron. Nefron adalah unit fungsional dari ginjal. Nefron terdiri atas kapsula bowman, tumbai kapiler glomerulus, tubulus kontortus proksimal, lengkung henle, dan tubulus kontortus distal. Unit nefron dimulai dari kapiler yang bersifat sebagai saringan yang disebut glomerulus (Price, 1995). Glomerulus adalah anastomosis kapiler-kapiler fenestrata yang berasal dari arteri renalis. Glomerulus dibungkus oleh kapsul bowman. Glomerulus terdiri dari sel endotel kapiler dengan membentuk taut yang erat yang dikelilingi oleh membran basalis (Baqarizky et al., 2015). Pada glomerulus terjadi pengikatan sel-sel darah, keping darah, dan protein plasma. Zat yang terlarut pada plasma darah seperti glukosa, asam amino, natrium, kalium, bikarbonat, garam, dan urea disaring dan menjadi suatu endapan (Utomo, 2015).
Tubulus proksimal adalah saluran yang berkelok-kelok yang letaknya mendominasi pada korteks renal. Fungsi utama tubulus kontortus proksimal adalah absorbsi yaitu berupa air dan Na, glukosa, asam amino darah, dan protein. Epitel sel tubulus kontortus proksimal adalah kuboid atau kolumnar selapis. Epitel ini berbentuk epitel rendah bila filtrat meningkat dan berbentuk epitel tinggi apabia filtrat menurun (Gerhastuti, 2009). Sel epitel tubulus proksimal sangat peka terhadap zat toksik. Tubulus kontortus proksimal yang terpapar zat toksik terus menerus akan menyebabkan cedera sel sehingga dapat terjadi kematian sel (nekrosis) (Maisaroh, et al., 2017). Pada Gambar 2.4 disajikan histologi ginjal pada tikus normal.
Gambar 2.4 Histologi Ginjal Tikus Normal dengan perbesaran 100x10 (Christensen et al., 2002).
2.6 Kelainan Ginjal
Gangguan pada ginjal dapat diketahui dengan adanya poliferasi glomerulus yang disebabkan oleh pembengkakan dan penambahan sel endotel kapiler. Poliferasi pada glomerulus menyebabkan perubahan korpuskulum renal meliputi diameter glomerulus, ruang urinari, dan diameter kapsula bowman (Soeksmanto, 2003).
Kerusakan yang terjadi pada glomerulus dapat menyebabkan terganggunya proses filtrasi. Kerusakan ini disebut dengan atrofi glomerulus yang berujung pada gagal ginjal atau berkurangnya kemampuan menyaring darah (Hasnisa et al., 2014).
Nefrotoksin pada ginjal dapat menyebabkan perubahan fungsi. Kerusakan ini dapat mengenai tubulus, glomerulus, ataupun intertisiumnya. Pada glomerulus dapat mengakibatkan glomerulonefritis, glomerular lipidosis, dan amiloidosis. Istilah lain kerusakan ini adalah nefrosis yaitu kelainan ginjal degenaratif (Juhryah, 2008).
Kerusakan pada tubulus proksimal dapat terjadi akibat akumulasi senyawa kimia yang direabsorbsi dalam urin melalui sel epitel tubulus dengan konsentrasi tinggi (Roslizawaty et al., 2013).
Gangguan sistem urania dapat terjadi karena adanya inflamasi pada ginjal.
Beberapa penyakit akibat inflamasi terdiri dari glomerulonefritis, plelonefritis, dan sistisis. Glomerulonefritis adalah penyakit dengan inflamasi pada nefron.
Plelonefritis adalah inflamasi pada pelvis ginjal karena adanya infeksi bakteri. Sistitis adalah penyakit dengan inflamasi pada kandung kemih yang disebabkan oleh bakteri Escherecia coli. Gangguan ginjal yang terjadi karena retensi garam, air, zat buangan nitrogen (urea dan kreatinin), penurunan volume urin (oliguria) hingga hilangnya fungsi ginjal akan berakhir dengan penyakit gagal ginjal yang sulit untuk disembuhkan (Sloane, 2004).
2.7 Nefropati Diabetik
Nefropati diabetik merupakan penyakit komplikasi yang dialami penderita diabetes. Kerentanan terhadap nefropati diabetik dipengaruhi oleh etnis, jenis kelamin, serta umur saat diabetes timbul. Gejala yang terjadi pada penyakit ditandai dengan perubahan fungsional dan morfologi ginjal. Perubahan fungsional terjadi dengan peningkatan laju filtrasi glomerulus dan ekskresi albumin dan urin.
Peningkatan laju filtrasi glomerulus akhirnya akan menyebabkan hilangnya
kemampuan ginjal untuk membersihkan atau meyaring darah atau gagal ginjal (Putri, 2015).
Peningkatan laju filtrasi glomerulus pada nefropati diabetik disebabkan oleh dilatasi arteriol aferen oleh efek glukosa. Kadar glukosa yang tinggi menyebabkan terjadinya glikolisis protein membran basalis yang berakibat pada penebalan selaput membran basalis. Hal demikian menyebabkan kapiler-kapiler glomerulus terdesak dan aliran darah terganggu. Nefropati diabetik secara histopatologik meliputi perubahan pada glomerulus yang mengenai kapiler glomerulus membran basalis dan kapsul, perubahan pada vaskular ginjal yaitu arterioklerosis, perubahan pada tubulus proksimal, deposit glikogen pada tubulus proksimal, atropi tubulus dan fibrosis intersitial (Rivandi dan Yonata, 2015).
Nefropati diabetik menimbulkan beberapa perubahan pada pembuluh kapiler dan arteri, penebalan selaput endotelial, trombosis yang merupakan akibat dari mikroangiopati. Perubahan pertama yang terlihat pada ginjal adalah ukuran ginjal yang mengalami pembesaran dan hiperfiltrasi. Glukosa yang difiltrasi akan direabsrobsi oleh tubulus ginjal dan sekaligus membawa natrium, bersamaan dengan efek insulin yang merangsang reabsorbsi tubuler natrium, sehingga meyebabkan volume ekstra sel meningkat dan terjadilah hiperfiltrasi. Hiperfiltrasi glomerulus pada kondisi diabetes melitus selalu disertai dengan peningkatan bobot ginjal (Fahrianti et al., 2015). Pada Gambar 2.5 disajikan sketsa ginjal nefropati diabetik
Gambar 2.5 Sketsa Ginjal Nefropati Diabetik (Radia et al., 2017).
BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Februari 2020 sampai dengan bulan November 2020 di Laboratorium Struktur Hewan dan Fisiologi Hewan, Departemen Biologi, Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan, dan Laboratorium Patologi dan Anatomi Rumah Sakit Umum H. Adam Malik.
3.2 Alat dan Bahan
Alat dan bahan pada penelitian ini dapat dilihat pada Lampiran 1. Alat yang digunakan adalah kandang tikus, botol ekstrak, botol sampel, timbangan digital, jarum gavage, rotary evaporator, spuit, blender, autocheck, strip, disecting set, bak bedah, camera digital, botol balsem, beaker glass, pinset, kuas kecil, botol winkler, botol canada balsem, pisau mikrotom, mikrotom, oven, hot plate, holder, objek glass, cover glass, staining jar, mikroskop, cutter, dan botol reagen, cawan petri, gelas ukur, pulpen, kertas, buku tulis, tempat preparat, dan grafik.
Bahan yang digunakan adalah tikus jantan (Rattus novergicus), daun sikkam (Bischofia javanica) yang telah diidentifikasi dan hasil identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 2, aloksan, CMC, glibenklamid, pelet, aquades, Larutan Fisiologi Nacl 0,9%, Etanol, Xylol, Parafin, Toluol, larutan bouin, air hangat, kotak-kotak penanaman, Hematoksilin, eosin, strip KGD, kertas label, albumin meyer, dan canada balsem.
3.3 Prosedur Penelitian
Kegiatan yang dilakukan pada penelitian ini dapat dilihat pada Lampiran 3.
Penleitian ini terdiri dari beberapa prosedur sebagai berikut:
3.3.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan metode Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan menggunakan 6 perlakuan dan 6 ulangan. Perlakuan terdiri dari :
Tabel 3.1 perlakuan yang digunakan dalam penelitian
Perlakuan Suntik Aloksan (125 mg/KgBB)
Ekstrak etanol Daun Sikkam (mg/KgBB) Glibenklamid (0,45 mg/
KgBB)
300 600 900
K(-) - - - - -
K(+) ✓ - - - -
P1 ✓ ✓ - - -
P2 ✓ - ✓ - -
P3 ✓ - - ✓ -
P4 ✓ - - - ✓
Penentuan jumlah ulangan pada setiap perlakuan penelitian menggunakan rumus Federer (1963) yaitu :
(n-1)(t-1)≥15
Keterangan :
t= banyak perlakuan, n= banyak ulangan
(n-1)(6-1) ≥ 15
(5n-5) ≥15
5n ≥ 20 𝑛 = 4
Menurut hasil perhitungan menggunakan rumus federer didapatkan jumlah ulangan minimum yang terdapat pada setiap kelompok perlakuan adalah 6 ekor.
3.3.2 Pembuatan Ektrak Daun Sikkam (Bischofia javanica)
Daun sikkam segar sebanyak 10 kg dicuci bersih, dan dipisahkan dari rantingnya. Daun dikeringkan selama kurang lebih 7 hari atau hingga daun kering tanpa disinari cahaya matahari langsung untuk mengurangi kerusakan kandungan fitokimia (Farmakope Indonesia, 1995). Daun yang sudah kering kemudian diblender sampai menjadi serbuk. Diperoleh berat kering sebanyak 650 gram. Serbuk daun sikkam 650 gram dengan 4,5 L etanol dimaserasi selama 5 hari yang terlindung dari cahaya matahari. Ampas dari hasil maserasi dicampurkan dengan etanol hingga 6 L untuk dimaserasi kembali selama dua hari. Hasil maserasi disaring dan dilakukan pemekatan menggunakan rotary evaporator pada suhu 40oC. Selanjutnya,diuapkan di waterbath pada suhu 40oC sampai diperoleh ekstrak kental.
3.3.3 Pembuatan Sediaan Bahan Uji
Sediaan uji didapatkan dengan mencampurkan ekstrak etanol dengan CMC 1%. Ektrak etanol daun sikkam ditimbang sebanyak 0,3 g, 0,6 g, dan 0,9 g.
Kemudian dicampurkan dengan CMC 1% sebanyak 1 ml. Penentuan volume larutan CMC sebagai berikut:
ml larutan CMC = dosis Ekstrak (g) X BB (g) x 100
1000 konsentrasi ekstrak
3.3.4 Persiapan Hewan Percobaan
Penelitian ini menggunakan tikus jantan (Rattus novergicus) yang berumur 2- 3 bulan dengan berat-rata 150-250 gram. Tikus diaklimatisasi selama 14 hari dengan kandang beralaskan sekam. Tikus diberi periode penyinaran selama 12 jam terang dan 1 jam gelap didalam ruangan yang bersuhu 24-28oC dengan kelembaban 60- 75%. Tikus diberi makan dan minum secara ad libitum, dan dilakukan pembersihan kandang dengan mengganti sekam tikus selama 3 hari sekali.
3.3.5 Menginduksi Diabetes Hewan Uji dengan Aloksan
Hewan uji yang diinduksi diabetes menggunakan aloksan dilakukan dengan mencampurkan NaCl 0,9% dan aloksan dengan perbandingan 8:1. Aloksan diberikan dengan menyuntikkan sebanyak 125 mg/KgBB secara intraperitonial. Pada hari ke-3
setelah pemberian aloksan, diukur kadar glukosa darah dengan glukometer. Tikus yang memilki kadar glukosa darah lebih tinggi dari 200mg/dl dipisahkan dan siap untuk diberi perlakuan. Tikus dengan kadar glukosa darah rendah, kemudian diinduksi kembali dengan aloksan.
3.3.6 Pemberian Ekstrak Etanol Daun Sikkam
Tikus jantan sebanyak 36 ekor dibagi menjadi 6 kelompok perlakuan yaitu kontrol negatif, kontrol aloksan, perlakuan ekstrak etanol daun sikkam dengan konsentrasi yang berbeda-beda, dan perlakuan dengan glibenklamid. Tikus diberi tanda terlebih dahulu sesuai dengan kelompok perlakuan menggunakan marker pada ekor. Kelompok yang diberi perlakuan ekstrak etanol daun sikkam adalah K2,K3,dan K4 dengan konsentrasi 300 mg/KgBB, 600 mg/KgBB, dan 900 mg/KgBB, kelompok K5 diberikan glibenkamid sebanyak 0,45 mg/ Kg BB. Pemberian ekstrak etanol daun sikkam dilakukan setiap hari selama 28 hari secara gavage. Tikus yang sudah diberi perlakuan kemudian dapat dilihat kadar glukosa darahnya selama satu minggu sekali.
3.3.7 Pengukuran Kadar Glukosa Darah
Pengukuran kadar glukosa darah hewan uji dilakukan dengan menggunakan alat glukometer. Kadar glukosa darah hewan uji diukur dengan mengambil sedikit darah pada bagian ekor tikus. Ekor tikus dibersihkan terlebih dahulu dengan air hangat menggunakan kapas, lalu digunting atau disayat ujung ekornya untuk mengeluarkan darah. Darah diteteskan ke strip glukometer, kemudian kadar glukosa darah pada tikus akan terlihat pada alat glukometer. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan selama seminggu sekali yakni hari ke 0, 7, 14, 21, dan 28. Tikus dipuasakan terlebih dahulu selama 18 jam sebelum pengukuran kadar glukosa darah.
Setelah periode pemberian ektrak etanol daun sikkam selesai, selanjutnya tikus diambil organ ginjalnya untuk pembuatan preparat histologi (Szkudelski, 2001).
3.3.8 Pembuatan Preparat Histologi Ginjal
Tikus jantan (Rattus novergicus) dianastesi dengan kloroform, dibedah dan diambil organ ginjalnya. Organ ginjal kemudian dibersihkan dari darah dengan larrutan fisiologi Nal 0,9%. Ginjal kemudian dimasukkan ke dalam larutan fiksatif
yaitu larutan bouin. Organ dicuci dengan alkohol 70% berkali-kali hingga warna kuning hilang. Selanjutnya organ didehidrasi untuk menarik molekul air dengan alkohol bertingkat yaitu 70%, 96%, dan alkohol absolut dengan waktu 30 menit setiap konsentrasi. Tahap berikutnya, organ didealkoholisasi dengan xilol dan alkohol absolut dengan perbandingan 1:3, 1:1, 3:1 selama 60 menit setiap perbandingan. Organ selanjutnya dimasukkan kedalam xilol murni selama 4-10 jam.
Proses infiltrasi dilakukan pada oven bersuhu 56o C, dimana organ dimasukkan kedalam xilol dan parafin dengan perbandingan 3:1, 1:1, 1:3 selama 30 menit setiap perbandingan. Organ dimasukkan kedalam parafin murni selama 60 menit. Parafin cair dituangkan kedalam kotak kertas kecil sebagai cetakan organ. Sebelum parafin memadat, masukkan organ kedalam kotak dan biarkan hingga parafin mengeras dan memadat. Blok parafin yang telah memadat kemudian ditempelkan dengan holder kayu hingga merekat. Letakkan holder kayu tersebut dimikrotom untuk selanjutnya dipotong dengan ketebalan 5µm. Gelas benda diolesi dengan albumin mayer sebelum pita parafin diletakkan di gelas benda. Pita jaringan dilakukan affixing dengan dimasukkan kedalam waterbath bersuhu 450C agar jaringan tidak berlipat. Jaringan kemudian diangkat dan diletakkan pada object glass untuk selanjutnya diwarnai.
Jarigan ginjal diwarnai dengan pewarna hematoxylin-eosin (HE) dengan cara preparat pada gelas benda dideparafinasi dalam xilol hingga parfin hilang. Jaringan selanjutnya dimasukkan kedalam alkohol bertingkat yaitu alkohol absolut, 96%, dan 70% selama 3 menit setiap konsentrasi. Jaringan dimasukkan ke dalam larutan hematoxylin selama 3 menit, dan gelas benda dibias dengan air mengalir selama 3 menit. Jaringan dimasukkan ke dalam larutan eosin selama 3 menit, dan selanjutnya ke dalam alkohol bertingkat yaitu 70%, 96%, dan absolut selama 3 menit setiap konsentrasi. Setelah alkohol bertingkat, jaringan dimasukkan dalam xilol selama 3 menit. Gelas benda dari xilol dibersihkan dari sisa xilol dengan kertas saring.
Jaringan pada gelas benda ditetesi dengan canada balsem dan ditutup dengan cover glass. Gelas benda kemudian diberi label dan siap untuk diamati di bawah mikroskop (Larasti, 2010).
3.3.9 Parameter Pengamatan A. Morfologi
a). Berat Ginjal
Berat ginjal diamati dengan menimbang ginjal kanan dan kiri pada timbangan digital. Hasil penimbangan kemudian dirata-ratakan dan menjadi rata-rata berat ginjal.
b). Morfometri Ginjal
Morfometri ginjal diamati dengan mengukur panjang, lebar, dan tinggi ginjal kanan dan kiri. Hasil pengukuran kemudian dirata-ratakan dan menjadi rata-rata panjang, lebar, dan tinggi ginjal.
B. Histologi
a). Penebalan Membran Basalis Glomerulus
Preparat histologi sepasang ginjal kanan dan kiri diamati sebanyak dua preparat dari setiap perlakuan dengan perbesaran 1000x. Penebalan Membran Basalis glomerulus diukur dengan pengukuran sebanyak 5 lapang pandang. Hasil kerusakan merupakan rata-rata persentase 5 lapangan pandang yang berbeda dan dicatat hasilnya (Fidianingsih, 2011).
b). Jumlah Sel mesangial
Preparat histologi ginjal kanan diamati dengan perbesaran 1000x. Jumlah sel mesangial dihitung sebanyak 5 lapangan pandang dengan ciri-ciri sel terbenam dalam matrik mesangial, terletak diantara kapiler dan inti hiperkromatik. Jumlah sel mesangial kemudiaan dirata-ratakan dan dicatat hasilnya (Sukmawati, 2013).
3.3.10 Analisis Data
Data yang diperoleh dari setiap parameter pengamatan dicatat dan disusun dalam bentuk tabel. Data kuantitatif yang didapat diuji kemaknaannya dengan pengaruh kelompok perlakuan dengan program software SPSS 22. Pengujian dilakukan dengan uji ANOVA dimana diawali dengan uji normalitas (p>0,05), kemudian uji homogenitas (p>0,05) dan uji ANOVA (p<0,05). Data selanjutnya di uji lanjut menggunakan uji Post Hoc-Bonferroni.
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil pengamatan ginjal tikus (Rattus norvegicus) setelah dilakukan pemberian ekstrak etanol daun sikkam (Bischofia javanica) yang diinduksi diabetes dengan aloksan terdiri dari:
4.1 Berat Ginjal
Data dan analisis statistik berat ginjal dapat dilihat pada Lampiran 4.1. Hasil analisis varians (ANOVA) menunjukkan pemberian ekstrak etanol daun sikkam berpengaruh terhadap berat ginjal (p<0,05). Rata-rata berat ginjal tikus pada tiap perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.1
Gambar 4.1 Berat ginjal tikus setelah diberikan perlakuan ekstrak etanol daun sikkam yang diinduksi diabetes dengan aloksan, K(-) = tidak diberi perlakuan, K(+) = aloksan + CMC 1%, P1= aloksan + ekstrak daun sikkam 300 mg/KgBB, P2= aloksan + ekstrak daun pirdot 600 mg/KgBB, P3= aloksan + ekstrak daun pirdot 900 mg/KgBB, P4=
aloksan + glibenklamid 0,45 mg/KgBB.
Berdasarkan Gambar 4.1 pemberian aloksan (K+) tidak memiliki perbedaan rata-rata berat ginjal yang siginifikan dengan kontrol (K-). Hal ini menyatakan bahwa efek aloksan yang diberikan, tidak mempengaruhi berat ginjal. Pemberian ekstrak etanol daun sikkam hanya memberikan pengaruh yang berbeda nyata pada P3, yaitu berat ginjal lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol (K-). Hal ini tidak diharapkan pada penelitian, dimana Pemberian ekstrak etanol daun sikkam seharusnya dapat menurunkan berat ginjal.
ab ab
bc
a
c
bc
0 0.5 1 1.5 2
K(-) K(+) P1 P2 P3 P4
Berat ginjal(gram)
Perlakuan
Kenaikan berat ginjal pada P3 terjadi kemungkinan karena diberikan konsentrasi ekstrak etanol daun sikkam yang terlalu tinggi yaitu 900 mg/KgBB.
Menurut Ihwan (2018), semakin tinggi ekstrak etanol daun sikkam dapat menimbulkan efek toksik. Aktivitas toksik dari metabolit sekunder daun sikkam menyebabkan kematian sel. Metabolit sekunder utama yang menyebabkan ketoksikan yaitu flavonoid, dimana terjadi pembendungan transpor aktif sehingga pemasukkan ion tak terkendali dan menyebabkan kematian sel.
Menurut Tumbol et al., (2018), tumbuhan obat menghasilkan senyawa sekunder yang mempunyai efek farmakologi lebih dari satu. Efek yang dihasilkan dapat mendukung (agonis) ataupun berlawanan (antagonis). Efek berlawanan mengeluarkan senyawa toksik yang dapat mempengaruhi fungsi organ. Senyawa toksik yang masuk pada ginjal dapat menyebabkan perubahan berat ginjal yang terjadi akibat akumulasi cairan dan senyawa toksik dalam sel-sel ginjal yang pada akhirnya meningkatkan berat ginjal.
4.2 Morfometri Ginjal
Data dan analisis statistik morfometri ginjal dapat dilihat pada Lampiran 4.2.
Hasil analisis varians (ANOVA) menunjukkan pemberian ekstrak etanol daun sikkam berpengaruh terhadap morfometri ginjal (p<0,05). Rata-rata morfometri ginjal tikus pada tiap perlakuan dapat dilihat pada Tabel 4.2
No Perlakuan Rata-rata Morfometri Ginjal
Panjang (µm) Lebar (µm) Tinggi (µm)
1 K(-) 12,21a 7,46a 4,63a
2 K(+) 12,81a 8,26abc 5,51bc
3 P1 13,2ab 8,45bc 6,18cd
4 P2 12,08a 7,8ab 5,06ab
5 P3 15,73d 8,83c 6,56d
6 P4 14,15b 7,9ab 5,81bcd
Tabel 4.2 Morfometri ginjal tikus setelah diberikan perlakuan ekstrak etanol daun sikkam yang diinduksi diabetes dengan aloksan, K(-) = tidak diberi perlakuan, K(+) = aloksan + CMC 1%, P1= aloksan + ekstrak daun sikkam 300 mg/KgBB, P2= aloksan + ekstrak daun pirdot 600 mg/KgBB, P3= aloksan + ekstrak daun pirdot 900 mg/KgBB, P4=
aloksan + glibenklamid 0,45 mg/KgBB.
Berdasarkan Gambar 4.2 pemberian aloksan (K+) tidak memiliki perbedaan yang signifikan dengan kontrol (K-). Hal ini menyatakan efek aloksan yang diberikan tidak menambah ukuran panjang, lebar, dan tinggi pada ginjal. Pemberian ekstrak etanol daun sikkam memberikan pengaruh yang berbeda pada P3, yaitu memiliki panjang, lebar, dan tinggi yang meningkat dibandingkan kontrol (K-). Hal ini tidak diharapkan pada penelitian, dimana seharusnya daun sikkam tidak meningkatkan morfometri dari ginjal. Penambahan ukuran panjang, lebar, dan tinggi pada P3 terjadi dimungkinkan karena berat ginjal yang meningkat sehingga menambah ukuran pada ginjal. Morfometri pada seluruh perlakuan termasuk dalam kisaran normal panjang, lebar, dan tinggi ginjal tikus. Menurut Maurya et al., (2018), ukuran ginjal pada setiap hewan berbeda-beda. Pada tikus ginjal kanan dan ginjal kiri memiliki ukuran panjang, lebar dan tinggi yang berbeda. Ginjal kanan memiliki rata- tata panjang 1,54±0,02 cm, lebar 0,85±0,07 cm, dan tinggi 0,73±0,02. Sementara itu, ginjal kiri memiliki panjang 1,56±0,03, lebar 1,37±0,41, dan tinggi 0,95±0,03.
4.3 Tebal Membran Basalis Glomerulus
Data dan analisis statistik tebal membran basalis glomerulus ginjal dapat dilihat pada Lampiran 4.3. Hasil analisis varians (ANOVA) menunjukkan pemberian ekstrak etanol daun sikkam berpengaruh terhadap tebal membran basalis glomerulus ginjal (p<0,05). Rata-rata tebal membran basalis glomerulus ginjal tikus pada tiap perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.3.
Gambar 4.3 Tebal membran basalis ginjal tikus setelah diberikan perlakuan ekstrak etanol daun sikkam yang diinduksi diabetes dengan aloksan, K(-) = tidak diberi perlakuan, K(+) = aloksan + CMC 1%, P1= aloksan + ekstrak daun sikkam 300 mg/KgBB, P2= aloksan + ekstrak daun pirdot 600 mg/KgBB, P3= aloksan + ekstrak daun pirdot 900 mg/KgBB, P4=
aloksan + glibenklamid 0,45 mg/KgBB.
a d c bc
ab
bc
0 0.5 1 1.5 2
K(-) K(+) P1 P2 P3 P4
Tebal Membran Basalis Glomerulus(µm)
Perlakuan
Berdasarakan Gambar 4.3, pemberian aloksan (K+) memberikan perbedaan yang signifikan terhadap (K-), dimana membran basalis menebal setelah diberikan aloksan dibangdingkan dengan (K-). Penginjeksian aloksan menyebabkan efek diabetes dan menyebabkan perubahan histologi pada ginjal seperti penebalan membran basalis. Yuriska (2009) dan Larasti (2010) menyatakan bahwa, Aloksan mendesak efek diabetogenik dengan meningkatkan permeabiltas dari kerusakan sel beta. Perubahan gambaran histologi ginjal diabetes yang paling awal dapat dilihat adalah perubahan membran basalis glomerulus. Menurut Kumara (2017), penebalan membran basalis glomerulus terjadi karena adanya peningkatan ekspresi gen dan sintesis protein seperti kolagen IV, laminin, dan fibronektin.
Pemberian ekstrak etanol daun sikkam menurunkan ketebalan membran basalis pada perlakuan P1, P2, dan P3 dibandingkan dengan kontrol positif (K+).
Pengurangan ketebalan terbaik terdapat pada P3 yang hampir mendekati dengan kontrol (K-). Penurunan ketebalan membran basalis tersebut kemungkinan terjadi karena kandungan yang terdapat pada daun sikkam seperti flavonoid. Majeed (2019) menyatakan bahwa, daun sikkam dimanfaatkan untuk antidiabetes karena mengandung senyawa flavonoid, glikosida, mineral dan serat makanan. Daun sikkam bersifat hipoglikemik pada pada tikus diabetes dengan mengikat radikal bebas. Sinata dan Arifin (2016) menyatakan bahwa, flavonoid merupakan senyawa antioksidan yang dijadikan sebagai obat antidiabetes. Antioksidan dapat mengurangi stress oksidatif dan resistensi insulin untuk mencegah disfungsi dan kerusakan pada sel beta pankreas.
4.4 Jumlah Sel Mesangial
Data dan analisis statistik jumlah sel mesangial ginjal dapat dilihat pada Lampiran 4.4. Hasil analisis varians (ANOVA) menunjukkan pemberian ekstrak etanol daun sikkam berpengaruh terhadap jumlah sel mesangial ginjal (p<0,05).
Rata-rata jumlah sel mesangial ginjal tikus pada tiap perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.4. :
Gambar 4.4 Rata-rata sel mesangial ginjal tikus setelah diberikan perlakuan ekstrak etanol daun sikkam yang diinduksi diabetes dengan aloksan, K(-) = tidak diberi perlakuan, K(+) = aloksan + CMC 1%, P1= aloksan + ekstrak daun sikkam 300 mg/KgBB, P2= aloksan + ekstrak daun pirdot 600 mg/KgBB, P3= aloksan + ekstrak daun pirdot 900 mg/KgBB, P4=
aloksan + glibenklamid 0,45 mg/KgBB.
Berdasarkan Gambar 4.4, diperoleh data jumlah sel mesangial pada perlakuan K(+) berbeda signifikan dengan K(-), dimana jumlah sel mesangial meningkat secara signifikan dibandingkan kontrol (K-). Pemberian aloksan menyebabkan hiperglikemia pada diabetes dan menyebabkan pertumbuhan sel yang tak terkontrol.
Widowati et al., (2018) menyatakan bahwa, hiperglikemia diyakini berperan dalam penurunan fungsi ginjal. Glukosa yang berlebihan menyebabkan pengambilan glukosa oleh sel mesangial. Penyebab ini kemudian dapat mengarah pada aktivitas sejumlah metabolik yang mengahasilkan peningkatan produksi reaktif spesies oksigen (ROS). Menurut Kamaliani et al., (2019), kondisi hiperglikemia menyebabkan sel mesangial menghasilkanTGF-β1 untuk peningkatan konsumsi dan transport glukosa akibat ekspresi berlebih. Kondisi tersebut menyebabkan abnormalitas metabolisme pada sel mesangial.
Pemberian ekstrak etanol daun sikkam menurunkan jumlah sel mesangial pada P1, P2, dan P3 dibandingkan kontrol positif (K+). Pengurangan jumlah sel mesangial terbaik terdapat pada P2 yang memiliki jumlah sel mesangial hampir mendekati kontrol (K-). Penurunan jumlah sel mesangial kemungkinan terjadi dikarenakan terdapatnya kandungan antioksidan yang ada pada daun sikkam sehingga dapat menurunkan stress oksidatif akibat hiperglikemia. Rajbongshi et al., (2014) menyatakan bahwa, antioksidan pada ektrak etanol daun sikkam telah
a
d
c
ab bc bc
0 5 10 15 20 25 30 35 40
K(-) K(+) P1 P2 P3 P4
Jumlah Sel Mesangial(sel)
Perlakuan
menunjukkan kemampuannya dalam membasmi radikal bebas. Kemampuan ini didapati karena adanya friedelin 3-α-acetate (FA) dan β amyrin. Menurut Handani et al., (2015), antioksidan adalah senyawa yang dapat mematikan zat lain, dan memperbaiki sel yang rusak. Antioksidan merupakan senyawa yang berfungsi sebagai penangkal radikal bebas bagi penderita diabetes mellitus. Antioksidan menurunkan peroksida lipid untuk dapat meminimalkan kerusakan jaringan pada penderita diabetes mellitus.
4.5 Gambaran Histologis Ginjal
Hasil pengamatan histologis ginjal tikus menunjukkan adanya perbedaan bermakna antar perlakuan. Pada kontrol K(-) membran basalis glomerulus tidak terlihat jelas dan sel mesangial pada perlakuan ini dengan jumlah yang sedikit. Pada control positif K(+) membran basalis glomerulus terlihat sangat jelas dengan garis berwarna ungu yang terlihat, dan sel mesangial yang berjumlah sangat banyak hingga memenuhi glomerulus. Pada perlakuan P1, P2, P3, dan P4 membran basalis glomerulus masih terlihat dengan jelas dengan garis berwarna dan sel mesangial yang mengisi ruang glomerulus dengan warna gelap dan inti sel di tengahnya.
Gambar 4.5 Gambaran histologi ginjal tikus diabetes menggunakan Pewarnaan HE dengan perbesaran 100 X 10. (a) membran Basalis glomerulus (b) sel mesangial.
K(-) K(+) P1
P2 P3 P4
b a
a
b
a b
a
a b b
a
b
Menurut Miner (2012), membran basalis glomerulus (GBM) adalah komponen matriks ekstraseluler dari filtrasi glomerulus permeabel selektif (GFB).
GBM terletak diantara sel endotel yang melapisi kapiler glomerulus dan podosit.
GBM adalah matriks ekstraseluer seperti lembaran yang terdiri dari empat makromolekul utama yaitu laminin, kolagen tipe IV, nidogen, dan proteoglikan sulfat heparan. GBM mengandung protein membran dasar tertentu yang penting untuk perkembangan glomerulus baik morfologi ataupun fungsi.
Menurut Scindia et al., (2010), sel mesangial tertanam pada ekstraseluler matriks dan mengandung kolagen, laminin, fibronektin dan proteoglikan. Sel mesangial merupakan 30-40% dari total populasi glomerulus. Sel mesangial dapat menyempitkan lumen kapiler yang menyebabkan perubahan aliran darah ke berkas glomerulus dan mempengaruhi filtrasi glomerulus. Fungsi besar yang dilakukan sel mesangial adalah membersihkan komplek imun yang bersirkulasi, untuk mengatur menghasilkan mediator pro-inflamasi, dan untuk mengatur pembentukan dan pemecahan matriks mesangial pada penyakit glomerulus.
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Kesimpulan dari penelitian ini adalah
a. Pada ginjal tikus model diabetes tidak terjadi peningkatan berat ginjal. Berat ginjal tidak meningkatkan setelah pemberian ektrak etanol daun sikkam.
b. Pada ginjal tikus model diabetes terjadi penebalan membran basalis glomerulus. Penebalan membran tersebut berkurang setelah pemberian ektrak etanol daun sikkam.
c. Pada ginjal tikus model diabetes terjadi peningkatan jumlah sel mesangial.
Jumlah sel tersebut berkurang setelah pemberian ekstrak etanol daun sikkam.
5.2 Saran
Saran dari penelitian ini adalah
a. Sebaiknya dilakukan pewarnaan khusus untuk dapat melihat membran basalis glomerulus dan sel mesangial lebih jelas
b. Sebaiknya waktu yang digunakan pada masa perlakuan dilakukan lebih lama untuk melihat rentang dosis yang paling berpengaruh terhadap pemulihan ginjal diabetes.
DAFTAR PUSTAKA
Akrom, Harjanti PD, Armansyah T, 2014. Efek Hipoglikemik Ekstrak Etanol Umbi Ketela Rambat (Ipomea batatas P) (EEUKR) Pada Mencit Swiss Yang Diinduksi Aloksan. Jurnal Pharmaciana. 4(1): 65-76.
Apriandi A, Tarman K, Sugita P, 2016. Toksisitas Subkronis Ekstrak Air Kerang Lamis Secara In Vivo Pada Tikus Sprague dawley Rats. Jurnal JPHPI. 19(2):
177-183.
Arias NMT, Macarulla L, Aguirre MG, Marti nez MP, Portillo, 2014. Quercetin Can Reduce Insulin Resistance Without Decreasing Adipose Tissue and Sketal Muscle Fat Accumulation. Journal Genes Nutr. 9(1): 361.
Bachheti RK, Indra R, Archana J, 2013. Chemical Composition, Mineral and Nutritional Value of Wild Bischofia javanica Seed. Journal International Food Research. 20(4): 1747-1751.
Fahrianti N, Lyrawati D, Sarwono I, 2015. Efek Asam Alfa Lipoat pada Kadar MDA dan Histologi Ginjal Tikus Wistar Dibetes Melitus Tipe 1. Jurnal Kedokteran Brawijaya. 2(3): 177-181.
Fatimah RN, 2015. Diabetes Melitus Tipe 2. Jurnal Majority. 4(5): 93-101.
Fidianingsih I, 2011. Pengaruh Suspensi Bubuk Kedelai Kuning Terhadap Struktur Histologik Ginjal Tikus Diabetik Diinduksi Streptozotocin. Jurnal Mutiara Medika. 11(2): 79-87.
Gerhastuti BC, 2009. Pengaruh Pemberian Kopi Dosis Bertingkat Per Oral Selama 30 Hari Terhadap Gambaran Histologi Ginjal Tikus wistar.[Skripsi].
Universitas Diponogoro.
Handani AR, Salim MN, Harris A, Budiman H, Zainuddin, Sugito, 2015. Pengaruh Pemberian Kacang Panjang (Vigna unguiculata) Terhadap Struktur Mikroskopis Ginjal Mencit (Mus musculus) yang Diinduksi Aloksan. Jurnal Medika Veteriner. 9(1): 18-22.
Hasnisa, Juswono Up, Wardoyo AY, 2014. Pengaruh Paparan Asap Kendaraan Bermotor Terhafap Gambaran Histologi Organ Ginjal Mencit (Mus musculus L.) Diabetes Melitus Model Mice. Jurnal Medika Planta. 1(4): 18-60.
Ihwan, Asabri MY, Khumadi A, 2018. Uji Toksisitas Akut Dan Letal Dosis (LD50) Ekstrak Etanol Daun Pepelo (Bischofia javanica) Pada Mencit Putih (Mus musculus). Journal of Science and Technology. 7(1): 110-116.
Internasional Diabetes Federation, 2019. IDF Diabetes Atlas Nine Edition 2019.
Irdalisa, Safrida, Khairil, Abdullah, Sabri M, 2015. Profil Kadar Gula Darah Pada Tikus Setelah Penyuntikan Aloksan Sebagai Hewan Model Hipergilemik.
Jurnal EduBio Tropika. 3(1): 25-28.
Juryah S, 2008. Gambaran Histologi Organ Hati dan Ginjal Tikus Pada Inotoksikasi Akut Insektisida (Metofluthrin, D-phenothrin, D-Alletrin) dengan Dosis Bertingkat.[Skripsi].Institut Teknologi Bandung.
Jones TC, Mohr U, Hunt RD, 1986. Urinary System. USA: Springer-Verlag Berlin Heidelberg.
Kamaliani BR, Setiasih NLE, Winaya IBO, 2019. Gambaran Histopatologi Ginjal Tikus Wistar Diabetes Melitus Eksperimental yang Diberikan Ekstrak Etanol Daun Kelor. Jurnal Buletin Veteriner.11(1): 71-77.
Larasti CY, 2010. Pengaruh Pemberian Ekstrak Anting-Anting (Acalypha indica L.) Terhadap Gambaran Histologis Glomerulus Ginjal Mencit Induksi Streptozotocin. [Skripsi].
Lemmens MJRH, and Soetjipto W, 1992. Prosea;Plant Resources of South East Asia 3. Bogor: Dye and Tanin Production Plants.
Mai TN, 2017. An Initial Study On Chemical Constituents Of Bischofia javanica.
Journal of Science and Technology. 55(2): 188-194.
Maisaroh S, Handayani N, Gofur A, 2017. Pengaruh Rebusan Simplisia Daun Pelutan (Urena Lobata L.) Terhadap Nekrosis Sel Tubulus Kontortus Proksimal Ginjal Mencit (Mus musculus L.) Galur Balb C. Jurnal Sains dan Farmasi. 4(2): 23-29.
Majeed S, 2019. Evaluation OF Antidiabetic Activity Of Ethanolic Extract Of Bischofia Javanica Blume Bark By Alloxan Induced Diabetic Model. Journal Of Current Research. 11(2): 993-999.
Maurya H, Kumar T, Kumar S, 2018. Anatomical and Physiological Similarities Of Kidney In Different Experimental Animal Used For Basic Studies. Journal of Clinical & Experimental Nephrology. 3(9): 15-24.
Miner JH, 2012. The Glomerular Basement Membrane. Journal Elesevier. 18(9):
973-978.
Mukti L, Betty, Bangun D, 2012. Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) Terhadap Perubahan Makroskopis, Mikroskopis Pada Ginjal Mencit Jantan (Mus musculus L.) Strain DDW yan Dipapari Monosodium Glutamate (MSG) Dibandingkan Dengan Vitamin E.
[Skripsi]. Universitas Sumatera Utara.
Ningrum LP, Salim N, Balqis U, 2017. Pengaruh Ektrak Daun Jamblang (Syzigium cumini L) Terhadap Histopatologi Hepar Tikus Putih (Rattus novergicus) Diabetes Melitus. Jurnal Jimvet.1(4): 695-701.
Nurdinayah, Nazaruddin, Sugito, Salim MN, Fahrimal Y, Aisyah S, 2015. Pengaruh Pemberian Ektrak Kulit Batang Jaloh Terhadap Gambaran Mikroskopis Ginjal Tikus Putih (Rattus novergicus) yang Diinfeksi Trypanosoma evansi.
Jurnal Medika Veteriner. 9(2): 88-92.
Prabowo P, 2019. Pembangunan Perangkat Pembelajaran Berbasis Data Euphorbiaceae Hutan Taman Eden 100. Jurnal Ilmu Pendidikan. 2 (2): 24- 31.
Pearce EC, 2009. Anatomi dan Fisiologi Untuk Paramedis. Jakarta: Pt Gramedia Pustaka Utama.
Price, Sylvia A, Lorraine, Willson M, 1995. Buku I Patofisiologi “Konsep Klinis Proses-Proses Penyakit” edisi 4. Jakarta: Penerbit EGC.
Putri RI, 2015. Faktor Determinan Nefropati Diabetik Pada Penderita Diabetes Melitus Di RSUD Dr. M. Soewandhe Surabaya. Jurnal Berkala Epidemiologi. 3 (1): 109-121.
Putri DAR, 2018.Pengaruh Serbuk Cacing Tanah (Phertima javanica K.) Terhadap Protein Urn, Morfologi Ginjal, dan Gambaran Histopatologi ginjal Tikus Putih (Rattus novergics B.)[Skripsi].
Radia Z, Alicic, Rooney MT,Tuttle KR, 2017. Diabetic Kidney Disease “Challenges, Progress, and Possibilities”. Journal of the American Society of Nephrology.
12(1): 2032-2045.
Rajbongshi PP, Zaman MK, Boruah S, Das S, 2014. A Riview on Traditional Use and Phytopharmacological Potensial of Bischofia javanica Blume. Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 24(2): 24-29.
Rivandi J dan Yonata A, 2015. Hubungan Diabetes Melitus Dengan Kejadian Gagal Ginjal Kronik. Jurnal Majority. 4 (9): 27-34.
Roslizawaty, Budiman H, Lila H, Herrialfian, 2013. Pengaruh Ekstrak Etanol Sarang Semut (Myrmecodia sp.) Terhadap Gambaran Hsitopatologi Ginjal Mencit Jantan (Mus musculus L.) Yang Hiperurisemia. Jurnal Medika Veterinaria. 7(2): 23-67.
Scindia YM, Deshmukh US, Bagavant H, 2010. Mesangial pathology In Glomerular Disease: Target For Therapeutic Intervention. Journal Elesevier. 62(14):
1337-1343.
Sloane E, 2004. Anatomi dn Fisiologi untuk Pemula. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Suhita NLPR, Sudir IW, Winaya IBO, 2013. Histologi Ginjal Tikus Putih Akibat Pemberian Ekstrak Pegagan (Centella asiatica) Peroral. Jurnal Buletin Veteriner Udayana. 5(1): 63-69.
Sukmawati D, 2013. Proteksi Kombinasi Minyak Wijen dan α-tocopherol Terhadap Glomerular Injury Melalui Penghambatan Stres Oksidatif Tikus Hiperkolesterolemia. Jurnal Exp Life. 3(2): 76-88.
Soeksmanto A, 2003. Pengaruh Fraksi Aktif Tumbuhan Aglaia Angustifolia Terhadap Ginjal Mencit (Mus musculus L.). Jurnal Nature Indonesia. 6(1):
49-52.
Szkudelski T, 2001. The Mechanism of alloxan and streptozotocin action in cells of the rat pancreas. Physiol. Res. 50(1): 568-575.
Toharin SNR, Cahtyati WH, Zainafree I, 2015. Hubungan Modifikasi Gaya Hidup Dan Kepathan Konsumsi Obat Antidiabetik Dengan Kadar Gula Darah Pada Penderita Diabetes Melitus Tipe 2 Di RS Qim Batang Tahun. Unnes Journal of Public health. 4(2): 153-160.
