Mahadma Bhima Whinata
Tiara Sustriani Putri
KROMATOGRAFI KOLOM
1. Pengertian Kromatograf Kooom
Kromatografi kolom adalah metode yang digunakan untuk
memurnikan bahan kimiatunggal dari campurannya. Metode ini sering digunakan untuk aplikasi preparasi pada skala mikrogram hingga kilogram. Keuntungan utama kromatografi kolom adalah biaya yang rendah dan
kemudahan membuang fasadiamyang telah digunakan. Kemudahan
pembuangan fasa diam ini mencegah kontaminasi silang dan degradasi fasa diam akibat pemakaian ulang atau daur ulang.
Kromatografi kolom preparatif klasik berupa tabung kaca dengan diameter antara 5 mm hingga 50 mm dengan panjang 5 cm hingga 1 m dengan keran dan pengisi (dengan sumbat kaca atau serat kaca – untuk mencegah hilangnya fasa diam) pada bagian bawah. Dua metode yang umum digunakan untuk preparasi kolom adalah metode kering dan metode basah.
Pada metode kering, kolom pertama kali diisi dengan serbuk kering fasa diam, kemudian kolom dialiri fasa gerak hingga seluruh kolom terbasahi. Mulai titik ini, fasa diam tidak diperkenankan mengering.
kemudian dialirkan perlahan melalui kolom sambil membawa sampel bahan organik. Sering kali, wadah eluen
sferisataucorong pisah bersumbat yang sudah diisi eluen diletakkan di bagian atas kolom.
Komponen-komponen tunggal tertahan oleh fasa diam secara berbeda satu sama lain pada saat mereka bergerak bersama eluen dengan laju yang berbeda melalui kolom. Di akhir kolom, mereka terelusi satu per satu. Selama keseluruhan proses kromatografi, eluen dikumpulkan sesuai fraksi-fraksinya. Fraksi-fraksi dapat dikumpulkan secara otomatis oleh pengumpul fraksi. Produktivitas kromatografi dapat ditingkatkan dengan menjalankan beberapa kolom sekaligus. Di sini, diperlukan pengumpul multi aliran. Komposisi aliran eluen dapat dimonitor dan masing-masing fraksi dianalisa senyawa terlarutnya, misalnya dengan kromatografi, absorpsi
sinar UV atau fluoresensi. Senyawa berwarna (atau senyawa berfluoresensi di bawah lampu UV) dapat terlihat di dalam kolom sebagai pita-pita
bergerak.
2. Tujuan kromatograf kooom
Untuk purifikasi dan isolasi komponen dari suatu campurannya. Metode pembuatan kolom terbagi menjadi 2 yaitu untuk metode kering, kolom pertama diisi dengan kering fase diam bubuk, diikuti dengan penambahan fase mobile. Metode basah, sebuah bubur disiapkan dari eluent dengan fase diam bubuk dan kemudian dengan hati-hati dituangkan ke dalam kolom. Lapisan ini biasanya ditutupi dengan lapisan pasir kecil atau dengan kapas atau wol kaca untuk melindungi bentuk lapisan organik dari kecepatan baru ditambahkan eluent. Eluent perlahan-lahan melewati kolom untuk memajukan bahan organik.
3. Prinsip pemisahan kromatograf kooom
Didasarkan pada afinitas kepolarananalite dengan fase diam,
yang bersifat polar dengan fase gerak yang non-polar dengan begitu waktu retensi akan menjadi lebih singkat. Semakin cepat pergerakan fase gerak akan meminimalkan waktu yang diperlukan untuk bergerak di sepanjang kolom. Laju aliran kolom dapat ditingkatkan dengan memperluas aliran eluent di dalam kolom dengan mengisi fase diam pada bagian bawah atau dikurangi dengan mengontrol keran. Laju aliran yang lebih baik dapat dicapai dengan menggunakan pompa atau dengan menggunakan gas dengan kompresi (misalnya udara,nitrogen, argon) untuk mendorong pelarut melalui kolom.
Kolomnya (tabung gelas) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan
kedalam kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sampel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasastationer). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut.
4. Fasa Diam
Fasa diam atau adsorben (penjerap) dalam kromatografi kolom adalah zat padat. Fasa diam yang paling umum untuk kromatografi kolom
adalah silika gel, diikuti dengan alumina. Serbuk selulosa pernah banyak digunakan. Kromatografi kolom memungkinkan melakukan
teknikkromatografi pertukaran ion, kromatografi fasa terbalik, kromatografi afinitas, ataupenjerapanbed ekspansi (bahasa Inggris:expanded bed
adsorption, EBA). Fasa diambiasanya serbuk halus atau gel dan/atau
campuran analit yang dapat diaplikasikan ke dalam kolom. Untuk kolom silika, rasio berada antara 20:1 hingga 100:1, bergantung pada kedekatan jarak elusi antar komponen analit.
5. Fasa Gerak (eouen)
Fasa gerak atau eluen dapat berupa pelarutmurni atau campuran pelarut. Pemilihan dilakukan sedemikian rupa sehingga nilaifaktor retensi senyawa yang diinginkan berada pada kisaran 0,2 - 0,3 untuk meminimalkan waktu dan jumlah eluen yang diperlukan selama
kromatografi. Eluen dapat pula dipilih berdasarkan daya pisahnya sehingga senyawa yang berbeda dapat dipisahkan secara efektif. Optimasi eluen dilakukan melalui uji pendahuluan berskala kecil, biasanya
menggunakan kromatografi lapisan tipis (KLT) dengan fasa gerak yang sama.
Ada laju aliran optimum untuk masing-masing pemisahan. Semakin cepat laju aliran eluen akan meminimalkan waktu yang dibutuhkan untuk melalui kolom sehingga meminimalkan difusi, menghasilkan pemisahan yang lebih baik. Namun, laju aliran maksimum perlu dibatasi karena analit memerlukan waktu tertentu untuk berada pada kesetimbangan antara fasa diam-fasa gerak, lihat persamaan Van Deemter. Kolom laboratorium
sederhana bekerja dengan prinsip aliran gravitasi. Laju aliran kolom
semacam ini dapat dinaikkan dengan menambah eluen baru di bagian atas fasa diam, atau diturunkan dengan mengatur keran di bagian bawah. Laju aliran yang lebih cepat dapat diperoleh dengan menggunakan pompa atau gas bertekanan (misalnya: udara,nitrogen, atau argon) untuk menekan pelarut melalui kolom (kromatografi kolom kilat).
6. Manfaat Kromatograf Kooom
Dalam bidang bioteknologi, kromatografi mempunyai peranan yang sangat besar. Misalnya dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif, senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia sering menjadi obyek molekul yang harus di-purified (dimurnikan) terutama untuk
keperluan dalam bio-farmasi. Kromatografi juga bisa diaplikasikan dalam pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan molekul penting lainnya. Dengan data-data yang didapatkan dengan menggunakan kromatografi ini, selanjutnya sebuah produk obat-obatan dapat ditingkatkan mutunya, dapat dipakai sebagai data awal untuk menghasilkan jenis obat baru, atau dapat pula dipakai untuk mengontrol kondisi obat tersebut sehingga bisa bertahan lama.
Dalam bidang clinical (klinik), teknik ini sangat bermanfaat terutama dalam menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien, dokter dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut. Seorang perokok dapat diketahui apakah dia termasuk perokok berat atau ringan hanya dengan mengetahui konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air liurnya. Demikian halnya air kencing, darah dan fluida badan lainnya bisa memberikan data yang akurat dan cepat sehingga keberadaan suatu penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat. Sekarang ini, deteksi senyawa oksalat dalam air kencing menjadi sangat penting terutama bagi pasien kidneystones (batu ginjal). Banyak metode analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau lainnya, akan tetapi semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi.
7. Keuntungan Dan Keoebihan Kromatograf Kooom
Keoebihan kromatograf kooom :
Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative
Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran
Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi Kekurangan kromatograf kooom :
Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual
8. Jenis Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan :
Kromatografi Fase Normal
Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal” bersifat polar, misalnya silica gel, sedangkan fase geraknya bersifat non polar.
Kromatografi Fase Terbalik
Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase geraknya bersifat polar; kebalikan dari fase normal.
9. Cara Kerja Kromatografi Kolom
1. Komponen tunggal ditahan pada fasa diam berupa adorben karena telah terikat.
2. Ketika eluen dialirkan, maka senyawa akan melakukan migrasi, terbawa oleh eluen sesuai dengan kesesuaian kepolaran.
3. Masing-masing senyawa dalam komponen mempunyai kecepatan yang berbeda-beda dalam melewati kolom. Selama proses berlangsung, akan didapatkan beberapa fraksi.
4. Masing-masing fraksi kemungkinan mengandung senyawa yang berbeda. Untuk mengujinya, fraksi hasil kromatografi kolom dapat diamati menggunakan KLT.
5. Fraksi dengan Rf yang mirip, kemungkinan mengandung senyawa yang sama. Fraksi dapat diamati lebih lanjut menggunakan spektroskopi.
