Aktivitas Bakteriosin Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Air Penggumpal Tahu Alami
(Bacteriocin of Lactic Acid Bacteria that were Isolated from Tofu Coagulant)
Oleh Dona Bella NIM: 412013014
SKRIPSI
Diajukan untuk memenuhi sebagian dari persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Sains (Biologi) dari Program Studi Biologi, Fakultas Biologi
Fakultas Biologi
Universitas Kristen Satya Wacana Salatiga
Pendahuluan
Tahu merupakan salah satu produk olahan kedelai yang sering digunakan masyarakat sebagai lauk sehari-hari. Tahu merupakan makanan yang diolah dari sari kedelai yang digumpalkan. Proses penggumpalan tahu merupakan proses penting dalam pembuatan tahu. Proses diawali dengan pembuatan sari kedelai dan proses penggumpalan sari kedelai. Untuk penggumpalan sari kedelai, biasanya para produsen menggunakan asam asetat, batu tahu dan air penggumpal tahu alami (Bella dkk, 2016).
Cara yang paling alami dan memberikan rasa tahu lebih enak yang dapat digunakan sebagai koagulan tahu yaitu dengan menggunakan bakteri asam laktat (BAL) yang diisolasi dari air penggumpal tahu (Bella dkk., 2016). BAL adalah mikroba yang memproduksi asam laktat sebagai produk akhir. BAL memiliki ciri gram positif, tidak membentuk spora, bersifat anaerob fakultatif dan biasanya berbentuk basil atau batang. BAL memiliki banyak manfaat dan keunggulan bagi kesehatan manusia terutama baik untuk saluran pencernaan. Hal itu dikarenakan BAL dapat merangsang sekresi cairan lambung, serta sebagai sumber energi dalam proses respirasi (Ramadzanti, 2006).
Kelebihan penggunaan bakteri asam laktat dalam industri pangan adalah karena tingkat efisiensinya yang tinggi dalam beradaptasi terhadap lingkungan serta memungkinkan dimanfaatkan oleh masyarakat karena harga yang relatif murah (Misgiyarta, 2003). Salah satu peran bakteri asam laktat dalam proses penggumpalan tahu adalah sebagai pengawet alami. BAL dapat berfungsi sebagai pengawet karena memproduksi asam organik, dapat menurunkan pH lingkungannya dan dapat mengekskresikan beberapa senyawa penghambat mikroorganisme patogen seperti bakteriosin. Bakteriosin merupakan substansi protein yang disintesis oleh ribosom yang memiliki aktivitas antimikrobia. Bakteriosin dari BAL ini dapat memberikan pengawetan sekaligus nutrisi bagi makanan (Kusmarwati dkk, 2014).
hayati dan PGR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria). Bacillus merupakan flora normal yang tidak berbahaya bagi manusia (Kosim & Putra, 2010)
Metode Penelitian Pengambilan Sampel
Sampel berupa air penggumpal tahu,diambil dari produsen tahu di Kalitaman, kota Salatiga, Jawa Tengah. Pengambilan sampel dilakukan pagi hari. Air penggumpal tahu dibawa menggunakan jerigen, dan langsung dibawa ke laboratorium untuk diisolasi bakteri asam laktatnya
Isolasi Bakteri Asam Laktat
Sebanyak 1 ml sampel air penggumpal tahu diencerkan hingga pengenceran 10-4. Dari tiap-tiap pengenceran tersebut diambil 0,2 ml untuk ditabur pada media MRS agar dan diinkubasi selama 3 hari dalam inkubator 37oC.
Pemurnian Isolat Bakteri
Koloni bakteri yang tumbuh terpisah, langsung diuji kemurniannya dengan pengecatan sederhana dan diamati di bawah mikroskop. Isolat yang telah murni, kemudian dipelihara pada medium agar miring MRS. Jika dalam pengamatan masih belum murni, maka perlu dimurnikan lebih lanjut dengan cara menggores pada medium lempeng agar MRS (Nuryadi dkk, 2013).
Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Uji morfologi koloni dan sel
Morfologi koloni dilakukan dengan pengamatan koloni tiap bakteri yang telah tumbuh pada medium MRS agar. Pengamatan dilakukan terhadap bentuk, elevasi, tepian dan warna koloni. Untuk morfologi sel dilakukan pengecatan sel menggunakan cat gram. Sedikit bakteri dari kultur yang telah murni, diletakan pada setetes akuades steril pada object glass, lalu di fiksasi dengan melalukan pada api bunsen hingga kering. Pengecatan diawali dengan meneteskan pewarna kristal violet (gram A) sampai menutupi hasil fiksasi bakteri pada object glass selama 2 menit dan dicuci dengan akuades. Kemudian preparat ditetesi iodine (gram B) selama 1 menit dan dicuci dengan akuades. Selanjutnya preparat dicuci ulang dengan etanol 95% (gram C) dan dibilas dengan akuades. Langkah terakhir dengan memberikan pewarna safranin (gram D) selama 30 detik dan dicuci dengan akuades. Preparat tersebut diamati dibawah mikroskop (Sari dkk., 2012).
KOH string test
kemudian ose diangkat secara cepat. Uji positif ditandai dengan terbentuknya lendir seperti benang jika ose diangkat sedikit dari koloni (Arthi dkk., 2003),
Uji Biokimiawi (uji katalase)
Uji katalase dilakukan dengan menggunakan larutan H2O2 yang diteteskan pada object glass. Koloni BAL yang telah murni diambil sedikit dengan ose kemudian diletakkan pada object glass yang berisi larutan H2O2. Uji positif ditandai dengan terbentuknya gelembung gas (Hadioetomo, 1990).
Uji Pembentukan Dekstran
Uji diilakukan dengan menumbuhkan isolat bakteri pada media SYP (sucrose yeast extract peptone). Bakteri diinokulasikan pada media padat SYP kemudian diinkubasi selama 48 jam. Amati pembentukan dekstran (Nuryadi dkk, 2013).
Tipe Fermentasi
Pengujian dilakukan dengan menginokulasi isolat bakteri dalam MRS cair yang terdapat tabung durham kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 37oC. Amati pembentukan gelembung pada tabung durham (Romadhon & Margino, 2012).
Uji Aktivitas Bakteriosin dari BAL terhadap Bakteri Indikator
Uji aktivitas bakteriosin dilakukan menggunakan metode cakram kertas atau paperdisc dengan dua perlakuan bakteri indikator. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 5 kali dan satu kontrol. Bakteri indikator yang digunakan (Bacillus subtilis dan Pseudomonas aeruginosa) merupakan koleksi Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Biologi, Universitas Kristen Satya Wacana, Salatiga. Sebanyak satu ose biakan bakteri indikator murni disuspensikan dalam 10 ml garam fisiologis, kemudian sebanyak 1 ml suspensi biakan diinokulasikan pada 10 ml media NA yang masih cair pada tabung reaksi. Media tersebut dicampur dengan baik dan dituangke dalam cawan petri steril, kemudian dibiarkan hingga memadat.
diletakkan diatas media NA yang telah mengandung bakteri indikator. Sebagai kontrol digunakan akuades steril sebagai pengganti kultur BAL. Cawan uji tersebut kemudian diinkubasi selama 48 jam. Aktivitas bakteriosin diukur berdasarkan zona hambat yang terbentuk disekitar cakram (Kelana dkk., 2010).
Analisis Data
Hasil dan Pembahasan
Karakterisasi Isolat Bakteri
Dari proses isolasi bakteri asam laktat asal sampel air penggumpal tahu yang diambil dari produsen tahu di daerah Kalitaman, kota Salatiga, didapatkan 4 isolat yang berbeda yang tumbuh pada media MRS agar.Karakter morfologi koloni dan sel ke empat isolat bakteri tersebut dapat dilihat pada tabel 1. Sedangkan untuk hasil karakter fisiologis ke empat isolat yang didapat, dapat dilihat pada tabel 2.
Tabel 1. Karakteristik Morfologi Koloni dan Sel
Bentuk Tepian Elevasi Warna Sel
Koloni C Bundar Cembung Tombol Putih tulang Kokus
Koloni D Berkerut Berombak Cembung Putih susu Batang
Tabel 2. Karakter Fisiologi Isolat Bakteri
A B C D
isolat C dan D yang menunjukan reaksi katalase negatif (Romadhon & Margino, 2012).
Isolat C dapat menghasilkan dekstran, hal ini menunjukkan bahwa isolat C merupakan bakteri asam laktat dari genus Leuconostoc yang dapat memproduksi enzim dekstransukrase sehingga mampu mengubah sukrosa menjadi dekstran (Landon dkk, 1993). Bakteri asam laktat memiliki dua tipe fermentasi yaitu homofermentatif dan heterofermentatif. Isolat A dan C memiliki tipe fermentasi heterofermentatif dimana hasil fermentasi berupa asam laktat serta asam organik lainnya seperti asam asetat dan etanol serta menghasilkan karbondioksida. Isolat B dan D memiliki tipe fermentasi homofermentatif dimana isolat tersebut hanya menghasilkan asam laktat sebagai produk akhir (Rachmawati dkk., 2006).
Aktivitas Bakteriosin Bakteri Asam Laktat pada Bakteri Indikator
Uji aktivitas bakteriosin oleh bakteri asam laktat dilakukan hanya dengan isolat C dan D. Isolat A dan B tidak digunakan dalam uji aktivitas bakteriosin karena memiliki sifat katalase positif sehingga tidak memenuhi kriteria bakteri asam laktat. Adanya aktivitas bakteriosin (terbentuknya zona bening disekitar paperdisc) pada isolat C dan D dapat dilihat pada gambar 1 dan 2.
Gambar 1. Zona Hambat BAL dengan Bakteri Indikator P. aeruginosa
Gambar 2. Zona Hambat BAL dengan Bakteri Indikator B.subtilis C
C D
D
CD Kontrol
Semua isolat menunjukkan adanya zona hambat di sekitar paperdisc. Dengan begitu isolat C dan D mampu menghambat pertumbuhan bakteri
indikator sehingga dapat dijadikan pengawet alami makanan. Diameter zona
hambat yang dihasilkan oleh tiap isolat dapat dilihat pada grafik 1. Hasil tersebut
sudah termasuk diameter dari paperdisc sebesar 6 mm. Menurut Rai (2009), aktivitas bakteriosin ditandai dengan adanya zona hambat yang jernih, luas dan
bulat. Jika tidak maka aktivitas tersebut diperkirakan merupakan aktivitas dari
asam, hidrogen peroksida atau diasetil. Beberapa penelitian mengenai aktivitas
bakteriosin dari bakteri asam laktat telah dilaporkan. Isolat BAL genus
Leuconostoc yang diisolasi dari asinan sawi mampu menghambat pertumbuhan bakteri gram negatif E.coli dengan diameter zona hambat sebesar 4,67 mm (Rachmawati dkk, 2006). Sedangkan isolat bakteri asam laktat genus Leuconostoc
yang diisolasi dari pekasam ale-ale mampu menghambat pertumbuhan
Pseudomonas aeruginosa dengan zona hambat sebesar 5,82 mm (Sari dkk, 2012). Aktivitas penghambat oleh isolat C yang tergolong sangat kecil diperkirakan
merupakan aktivitas dari diasetil. Diasetil merupakan hasil produksi metabolisme
sitrat oleh beberapa genus BAL. Diasetil bereaksi dengan arginine-binding protein pada bakteri gram negatif dan mempengaruhi penggunaan arginin (Rachmawati
dkk, 2006).
. Aktivitas bakteriosin isolat C, D dan gabungan isolat C dan D tidak
memiliki perbedaan yang signifikan dalam menghambat pertumbuhan Bacillus subtilis. Semua isolat memiliki aktivitas bakteriosin yang sama, terlihat pada kemampuan menghambat bakteri gram positif Bacillus subtilis. Menurut Daeschel
(1993), bakteri asam laktat memproduksi bakteriosin hanya sedikit dibanding
asam organik. Meskipun begitu, adanya aktivitas bakteriosin yang dihasilkan
semua isolat pada bakteri indikator Bacillus subtilis sesuai dengan penelitian Ogunbanwo dkk (2003) yang menyatakan bahwa bakteriosin yang dihasilkan BAL
E. coli dan V.cholera. Bakteriosin yang dihasilkan oleh BAL dapat membentuk lubang pada membran sel bakteri sehingga rusak dan mengalami kebocoran.
Dengan begitu, akan terjadi ketidakstabilan membran sel sehingga pertumbuhan
terhambat dan mati (Rachmawati dkk, 2006).
Grafik 1. Diameter Zona Hambat Isolat terhadap Bakteri Indikator
Bakteriosin yang dihasilkan oleh isolat mampu menghambat pertumbuhan paling baik terdapat pada penghambatan bakteri gram negatif Pseudomonas aeruginosa dibanding bakteri gram positif Bacillus subtilis. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang lebih tebal berkisar 15-23 nm dibandingkan dengan bakteri gram positif yang hanya 10-15 nm. Oleh sebab itu bakteri gram positif lebih resisten terhadap lisis. Selain itu, bakteri gram negatif juga tidak tahan asam sedangkan bakteri gram positif ada yang tahan asam. Bakteri gram negative juga tidak mengandung asam teikoik namun mengandung polisakarida yang lebih rentan terhadap kerusakan kimia dan mekanik. Hal ini dapat menjadi penyebab penghambatan yang lebih bagus terhadap bakteri gram positif (Jawetz dkk, 2001).
Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa adanya aktivitas bakteriosin dari isolat C dan D yang dapat digunakan sebagai pengawet alami pangan. Isolat C memiliki aktivitas bakteriosin yang rendah dalam menghambat bakteri indikator gram negatif Pseudomonas aeruginosa dibanding dengan isolat D memiliki aktivitas bakteriosin yang lebih besar. Sedangkan dalam
menghambat bakteri indikator gram positif Bacillus subtilis, tiap isolat memiliki kemampuan yang sama.
Saran
Terlihat adanya aktivitas bakteriosin atau penghambat oleh bakteri asam laktat terhadap bakteri lain. Oleh karena itu diperlukan penelitian lebih lanjut untuk menentukan kadar bakteri asam laktat yang tepat agar dapat digunakan sebagai pengawet alami dalam waktu tertentu.
Ucapan terima kasih
Daftar Pustaka
A thi, K., Appala aju, B., Pa athi, “. . Va o i “e siti it a d KOH “t i g
Test as an Alte ati e of g a stai i g of Ba te ia I dia Jou al of Medical Microbiology. Vol. 21 (2): 121-123.
Bella, D., Kha , KN., Meiti ia ti, VI. . Isolasi Bakte i Asa Laktat Pe ghasil Asa Te aik pada ke uta se agai Pe ggu pal P otei Tahu Ala i.
Prosiding Seminar Nasional Mikrobiologi II. Kerjasama Fakuktas Biologi, UKSW dengan PERMI cabang Solo.Salatiga.
Daes hel, MA. . Appli atio a d i te a tio s of a te io i s f o la ti a id a te ia i foods a d e e ages . I Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria. Academic Press Inc. New York 63-91.
Hadioetomo, RS. 1990. Mikrobiologi dasar dalampraktek teknik dan prosedur Dasar laboratorium. Jakarta: PT Gramedia.
Jawetz, Melnick, and Adelberg,s. 2001 ; Mikrobiologi Kedokteran ; Edisi I ; Salemba Medika, Jakarta ; 196 -198.
Kela a, TB., “u a to, D., Wah u i, “. . Uji A ti ik o a F aksi Ekst ak
Meta ol, Etil Asetat da α-Heksana Daun Tabar-Tabar (Costus speciosus)
da Toksisitas a te hadap La a Uda g Jurnal Biota Vol 15. No. 1:
118-Porphyridium cruentum Jurnal Biodiversitas Vol. 8 No. 1: 48-53.
Kosi , M & Put a, “. ‘. . Pe ga uh “uhu pada P otease da i Ba illus su tilis.
Skripsi. Jurusan Kimia FMIPA ITS Surabaya.
La do , ‘“., Hudso , FW., K a e a d, C. . A Model De t a sucrase
synthesis by Leuconostoc mesenteroides T a s I he E Pa t C. -215.
Mayasari, Evita. 2005. Pseudomonas aeruginosa; Karakteristik, Infeksi dan Penanganannya. USU repository 2006.
Misgitarta & Widowati, S. . Efektifitas Bakte i Asa Laktat BAL dala
Pe uata P oduk Fe e tasi Be asis P otei /“usu Na ati. P osidi g
Seminar Hasil Penelitian Rintisan dan Bioteknologi Tanaman.
Ogu a o, “.T., “a i, A.L., a d O ilude, A.A. . Cha a te izatio of
Bacteriocin Produced by Lactobacillus plantarum F1 and Lactobacillus
e is OGI Depa t e t of Bota a d i o iolog U i e sit of I ada ,
Nigeria African Journal of Available online at http:// www.academicjournals. org/AJBnI, Academic Journals, ISSN 1684-5315
Laktat asal Asi a “a i te hadap Bakte i Patoge Ju al Biotek ologi
Vol. 2 (2):43-48.
Rai, A K., Bhaskar, N., Amami, P M., Indirani, K., Suresh, P V., Mahendrakar, M S.
. Cha a te izatio a d appli atio of ati e la tid a id a te iu
isolated from tannery fleshing for fermentative bioconversion of tannery
fleshi g Apli atio Mi o iolog Biote h olog Vol. . -766.
‘a adza ti, A. . Akti itas P otease dan Kandungan Asam Laktat pada Yoghurt yang dimodifikasi Bifidobacterium bifidum Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor.
‘o adho , “., Ma gi o, “. . Isolasi da Ka akte istik Bakte i Asa Laktat
dari Usus Udang Penghasil Bakteriosin sebagai Agen Antibakteria pada Produk-p oduk Hasil Pe ika a Ju al “ai tek Pe ika a Vol. No. .
“a i, ‘A., Nofia i, ‘., A di i gsih, P. . Ka akte isasi Bakte i Asa Laktat
Genus Leuconostoc dari Pekasam Ale-ale Hasil Formulasi Skala
