Marlia Singgih Wibowo Sekolah Farmasi ITB. 16 Juni 2009

(1)

Marlia Singgih Wibowo Sekolah Farmasi ITB 16 Juni 2009

(2)

PENDAHULUAN

Prinsip Praktek Pengujian yang Baik

(Good Analytical Practices) :

Pengujian dilakukan untuk memenuhi suatu tujuan tertentu atau kebutuhan pengguna

a. Pengujian dilakukan dengan menggunakan metode, prosedur dan peralatan yang telah teruji untuk

menjamin kesesuaian dan tujuan pengujian

b. Pengujian dilakukan oleh personel yang memiliki kualifikasi dan kompeten

(3)

d. Hasil pengujian harus ajeg atau konsisten, tidak

dipengaruhi oleh faktor lokasi, personel dan peralatan e. Laboratorium penguji harus mempunyai prosedur

jaminan dan pengendalian mutu yang memadai

f. Laboratorium penguji harus diuji dan dievaluasi oleh badan yang kompeten dan tidak memihak (akreditasi)

(4)

Validasi Metode Analisis

Definisi :

Validasi Metode Analisis adalah proses pembuktian atau konfirmasi pengujian yang obyektif di

Laboratorium, dan bahwa metode itu memenuhi persyaratan yang telah ditentukan, yang sesuai dengan tujuan penggunaannya.

(5)

Validasi Metode Analisis

(lanjutan)

Tujuan :

y Mengevaluasi kinerja metode : kepekaan, selektivitas, akurasi, presisi, dll., sekaligus menguji kelemahan dan keterbatasan metode

y Menguji faktor‐faktor yang dapat mempengaruhi kinerja metode dan mengetahui besarnya pengaruh itu terhadap hasil analisis

y Melakukan verifikasi atau membuktikan kinerja metode analisis baku yang diadopsi/digunakan laboratorium

(6)

Validasi Metode Analisis

(lanjutan)

Syarat :

y Menggunakan instrumen dan peralatan yang terkalibrasi

(7)

Jenis Validasi Metode

y Validasi primer dilakukan jika laboratorium

menggunakan metode analisis “baru” hasil

pengembangan , atau metode yang di modifikasi terhadap suatu metode standard.

y Validasi sekunder dilakukan untuk verifikasi, jika

laboratorium menggunakan atau mengadopsi metode standard yang telah divalidasi.

(8)

Pedoman Validasi Metode Analisis

Mikrobiologi

y Farmakope Indonesia edisi 4, 1995 y The United States Pharmacopeia (USP) 30, 2008 or new edition y ISO/IEC 17025:2005: General recommendations regarding the proficiency of test and calibration laboratories y International Conference on Harmonization, 1996 y Method Validation of Microbiological Methods, guidance note : C & B and ENV 002, Singapore Accreditation Council, July 2002. y _{Feldsine, et.al., AOAC International method Committee} Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiological Official Method of Analysis, Journal of AOAC International Vol.85, No.5, 2002

(9)

y Thompson, M., Ellison, S.L.R. and Wood, R.: Harmonised Guidelines for Single‐Laboratory Validation of Methods of Analysis, Pure Appl. Chem., 74, 835‐855 (2002). y Kromidas, S.: Handbook of Validation in Analysis, Verlag Wiley‐VCH, Weinheim, ISBN 3‐527‐29811‐8 (2000). y Water quality – Guidance on Validation of Microbiological Methods, Technical Report, ISO/TR 13843 : 2000. y _{Procedure for The Estimation and Expression of} Measurement Uncertainty in Chemical Analysis, Nordic Committee on Food Analysis, NMKL, No.5, 1997. y _{APHA Standard methods for the Examination of Water} and Wastewater, 20th ed., 1998. y Acuan lain yang relevan

(10)

Parameter Validasi metode

analisis mikrobiologi

y Akurasi – Kecermatan y Presisi (repeatability, reproducibility dan intermediate precision) – Keseksamaan y Sensitivitas – (limit deteksi, limit kuantifikasi)‐ Kepekaan

y Selektivitas dan Spesifisitas

y Linearitas

y Rentang Hitung yang diterima (acceptable) (batas atas dan batas bawah dari rentang perhitungan)

y Robustness (Ketegaran) metode

(11)

Metode Analisis Mikrobiologi

y

Kualitatif :

9 Uji langsung terhadap mikroba indikator 9 Metode kultur untuk identifikasi makroskopik dan mikroskopik 9 Metode alternatif (Dye‐reduction Test, Electrical Methods, ATP Determination) 9 Metode Cepat deteksi mikroba spesifik dan toksinnya (metode imunokimia, metode biologi molekuler)

y

Kuantitatif :

9 Angka Lempeng Total (Total Plate Count) 9 MPN (Most Probable Number) 9 Uji potensi antibiotik 9 Uji sterilitas 9 Uji koefisien fenol (uji desinfektan dan antiseptik) 9 Uji efektivitas pengawet

(12)

Metode kuantitatif

y Metode analisis yang responsnya berupa jumlah dari analit , baik yang diukur secara langsung (misalnya : enumerasi mikroba) maupun secara tidak langsung (misalnya : Nilai Absorbans, intensitas warna,

(13)

(14)

Tahap Persiapan Validasi

Sebelum validasi dilakukan, hendaknya laboratorium menyediakan atau menyiapkan beberapa hal :

1. Mikroorganisme target atau acuan (lihat SR‐02 : persyaratan tambahan untuk akreditasi

laboratorium, Pengujian Kimia dan Biologi SNI 17025, DP.01.16, Januari 2004)

2. Peralatan dan Instrumen ukur yang telah dikalibrasi 3. Personel yang kompeten

4. Program Statistika untuk menghitung,

mengevaluasi dan menginterpretasikan hasil pengujian

(15)

Akurasi (Kecermatan)

Definisi :

y Akurasi adalah kemampuan metode untuk mengukur

dan mendeteksi nilai aktual atau nilai sebenarnya dari mikroorganisme target dalam sampel

y Akurasi merupakan ukuran ketepatan atau kedekatan hasil pengujian dengan hasil yang sebenarnya

(16)

Akurasi (Kecermatan)

(lanjutan)

y

Rekoveri (Recovery) = Persen perolehan kembali

% Rek = H/A x 100

y

Galat Relatif : (H – A)/A x 100

H = hasil pengujian dengan metode

A = hasil sebenarnya dari mikroorganisme target

y

Rekoveri Relatif : H/B x 100

H = hasil pengujian metode

(17)

Akurasi (Kecermatan)

(lanjutan)

Cara pengujian :

y Spiked‐placebo Recovery Method

y Standard Addition Method

Menggunakan 9 kali pengukuran ( 3 level konsentrasi dengan 3 replikasi)

(18)

Perhitungan

% Rekoveri

= Hsl.metode uji x 100% Hsl teoritis

= 125/125 x 100% = 100%

% Rekoveri relatif =

Metode uji x 100% Metode baku

(19)

Presisi (Keseksamaan)

Definisi

y Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil

pengujian individual dengan hasil rata‐rata pengujian berulang pada sampel yang homogen dengan kondisi pengujian yang sama

y Presisi : keterulangan (repeatability), ketertiruan

(reproducibility), keseksamaan antara (intermediate

(20)

Presisi (Keseksamaan)

(lanjutan)

Cara Perhitungan

y Simpangan baku relatif (SBR = Relative Standard Deviation=RSD) untuk intermediate precision

(21)

Sensitifitas dan Spesifisitas

y Sensitifitas (Kepekaan) : Kemampuan metode untuk mendeteksi/mengukur mikroorganisme target dalam jumlah sekecil mungkin

y Spesifisitas (Kemenjenisan): Kemampuan metode untuk mendeteksi/mengukur mikroorganisme

tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya mikroorganisme asing atau bahan/matriks lain

(22)

Rentang Hasil Pengujian

y Rentang menunjukkan nilai terendah dan tertinggi hasil pengujian yang dapat ditentukan dengan cermat dan seksama

y Batas terendah (Lower limit)

Hasil analisis / pengujian terendah yang ditandai dengan galat analisis 20,0% dari rata‐rata

(23)

y

Batas tertinggi (Upper limit)

Hasil analisis /pengujian koloni tertinggi yang

masih dapat dihitung dengan cermat dan seksama

ditandai dengan galat analisis 15,0% dari rata‐rata

(pengukuran minimal 3 kali)

(24)

Linearity (Kelinieran)

y Keliniearan adalah kemampuan metode analisis yang menunjukkan bahwa larutan sampel yang berada dalam

rentang konsentrasi memiliki respon analit yang proporsional dengan konsentrasi, secara langsung ataupun melalui

transformasi matematika

y Kurva baku disiapkan dan dianalisis 3 kali dengan konsentrasi antara 50 – 150% kadar aktual (FDA), untuk penentuan kadar dalam sampel, tiga larutan baku digunakan : 80, 100 dan 120% konsentrasi target

(25)

Linearity (Kelinieran)

(lanjutan)

Parameter

y Kurva baku, dengan persamaan garis (regresi linear, logaritma atau polinomial)

y Kepekaan analisis , F = ∆ y/ ∆ x untuk setiap konsentrasi pada kurva baku

y Simpangan baku residual garis regresi Sy/x = [∑(y‐ŷ)2_/n‐2]1/2

y = respon analit

(26)

Linearity (Kelinieran)

(lanjutan)

y Koefisien variasi fungsi regresi

V_x0 = S _y/x . 100% , (V_x0 ≤ 2%) b.x

(27)

Linearity (Kelinieran)

(lanjutan) Perhitungan Kadar Diameter Hambat Log Ci x x x x x

a. Menggunakan persamaan garis D = b log C + a

log Cs = (Ds – a)/ b dimana :

Cs = kons. analit dlm sampel Ds = Diameter hambat

b. Menggunakan satu larutan baku dan larutan blangko

log Cs = (Ds – a)/(Db – a) . log Cb dimana :

(28)

Robustness (Ketegaran) metode

y Pengujian Ketangguhan sebenarnya harus dilakukan pada saat fase pengembangan metode dan tergantung pada faktor‐faktor yang berpengaruh pada pengujian

y Jika pengujian sangat peka terhadap perubahan dalam kondisi analisis,maka kondisi pengujian hendaknya dikendalikan atau dilakukan dengan penuh kehati‐ hatian

y Hasil pengujian dievaluasi secara Statistika

(29)

Robustness (Ketegaran) metode

(lanjutan)n y Jenis keragaman kondisi pengujian yang harus

diperhatikan :

y Stabilitas sampel

y Pengaruh suhu inkubasi

y Pengaruh waktu inkubasi

y _{Kondisi aerobik atau anaerobik (untuk pengujian}

mikroba tertentu)

(30)

Ruggedness (ketangguhan)

y Terminologi lama

y = Intermediate precision

y Bila suatu metode analisis telah diuji reproducibility nya melalui uji antar Lab/uji kolaborasi, maka

(31)

Faktor yang mempengaruhi hasil uji

potensi dengan metode lempeng agar

y Penyiapan larutan baku

y Ketebalan agar

y Konsentrasi inokulum

y Temperatur‐waktu

y Komposisi media

(32)

Questions regarding antibiotic

potency assay

y

_{What different antibiotic potency assay}

methods are read and calculated?

USP (United States Pharmacopoeia), EP (European Pharmacopoeia), BP (British Pharmacopoeia), JP (Japanese Pharmacopoeia), AOAC (American Association of Analytical Chemists), US‐CFR (Code of Federal Registry) and a custom single plate method.

(33)

•Is plate to plate variation accounted and

corrected for in USP method calculations?

Yes. Sometimes the depth of agar, temperature differences in an incubator, or other factors may result in conditions that should be corrected in the calculations of sample concentrations. This is automatically performed by the standard sample layout and calculations in the USP/CFR/AOAC methods.

(34)

What purpose does the standard curve

graph serve? (USP/CFR/AOAC only)

y The standard curve graph is performed to help the user where the standard and unknown samples are plotted relative to the curve. The graph is not used for calculations; the calculations are performed by mathematical formulas

(35)

Can samples be put onto paper disks, into wells

cut in the agar, and into metal cylinders?

y Yes, liquid samples may be placed in any of these. Some method guidelines specify which of these may be used

(36)

Contoh

BMC Clin Pharmacol. 2009; 9: 1.

Published online 2009 January 16. doi: 10.1186/1472‐6904‐9‐1. PMCID: PMC2640365

Application of microbiological assay to

determine pharmaceutical equivalence of

generic intravenous antibiotics

Andres F Zuluaga,1,2 _{Maria Agudelo,}1 _{Carlos A Rodriguez,}1,2 _{and Omar Vesga}1,3

1_{GRIPE: Grupo Investigador de Problemas en Enfermedades Infecciosas, University of Antioquia, Medellín,}

Colombia

2_{Department of Pharmacology and Toxicology, University of Antioquia, Medellin, Colombia}

3_{Section of Infectious Diseases, Department of Internal Medicine, University of Antioquia, Medellin, Colombia}

Corresponding author.

Andres F Zuluaga: [email protected]; Maria Agudelo: [email protected]; Carlos A Rodriguez:

[email protected]; Omar Vesga: [email protected]

(37)

Metode

y Pengujian dilakukan berdasarkan variasi konsentrasi terhadap efek inhibisi pada bakteri uji : Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538p dan

Staphylococcs epidermidis ATCC 12228, yang

ditumbuhkan pada media agar (Difco™ Antibiotic Media), menghasilkan hubungan linear antara konsentrasi zat ‐

respons e linear dengan dua parameter : y‐intercept (concentration) and slope (potency).

y Dibandingkan dua parameter tersebut dari 22 product generik (amikacin 4, gentamicin 15, and vancomycin 3 produk) dengan sediaan pembanding by Overall Test for Coincidence of the Regression Lines (Graphpad Prism 5.0).

(38)

Pengolahan data dalam proses validasi

y Ditentukan linearity, limit of quantification,

precision, accuracy, dan specificity utk menvalidasi method for testing pharmaceutical equivalence.

y Untuk tujuan tersebut, log‐transformed

concentrations (x‐axis, log₁₀mg/L) dari setiap produk diplot terhadap masing‐masing diameter hambat nya (y‐axis, rata‐rata diameter dalam mm); intercept

(perpotongan dan kemiringan/slope garis regresi

linear yang diekspresikan dengan persamaan y = b + mx, dengan b sebagai nilai y‐intercept dan m sebagai nilai kemiringan nya

(39)

y 5 Konsentrasi yang digunakan untuk masing‐masing antibiotik : 0.5 – 256 mg/L (amikacin), 0.125 – 64

mg/L (gentamicin), dan 0.25 – 128 mg/L (vancomycin)

y The goodness of fit to the model (linearity) :

dinyatakan dalam coefficient of determination (r2₎

dan standard error of estimate (S_yx).

y Dihitung pula x‐intercept (log₁₀mg/L) dan

kemiringan garis regresi dengan kepercayaan 95% Î confidence intervals (95% CI)

(40)

Results

y Validasi metode menghasilkan linearitas (r2 _{≥ 0.98),}

precision (intra‐assay variation ≤ 11%; inter‐assay variation ≤ 10%), accuracy, and specificity tests ,

sesuai dengan syarat international pharmacopoeial .

y Kecuali pada vancomycin yang ditambahkan 25%

API (P_{y‐intercept}= 0.001), penentuan potensi antibiotik menunjukkan hasil yang ekuivalen. 21 sediaan generik memberikan undistinguishable slopes dan

intercepts (P > 0.66).

y Estimasi potensi antibiotik: amikacin 99.8 ‐ 100.5 , gentamisin 99.7 ‐ 100.2, dan vancomycin 98.5 ‐ 99.9%

(41)

Vancomycin concentration (mg/L) Inhibition zone diameters (mean in mm ± SD) Coefficient of variation (%) Intra-day Coefficient of variation (%) Inter-day 128 18.00 ± 0.04 8.3 10.3 64 16.33 ± 0.02 5.6 10.5 32 14.16 ± 0.11 11.0 1.0 16 11.62 ± 0.37 7.4* 2.3 8 9.59 ± 0.00 4.6 6.5

Precision of the vancomycin bioassay

*An outlier value was excluded from the calculations (we only used five data to compute the CV) BMC Clin Pharmacol. 2009; 9: 1.

Published online 2009 January 16. doi: 10.1186/1472-6904-9-1.

(42)

(43)

(44)

Terima kasih

Sekolah Farmasi ITB Gedung Yusuf Panigoro

Lab.Tek VII Jalan Ganesa 10 Bandung Telp./Fax. +62‐22‐2504852

[email protected]