SINTESIS
HUMAN MILK FAT ANALOG
KAYA LAURAT MELALUI INTERESTERIFIKASI
ENZIMATIS DENGAN BAHAN BAKU
VIRGIN COCONUT OIL
DAN STEARIN SAWIT
Disertasi untuk memperoleh derajat Doktor dalam Ilmu Pangan
oleh
Steivie Karouw
08/279719/STP/111
PROGRAM PASCA SARJANA
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2013
SINTESIS
HUMAN MILK FAT ANALOG
KAYA LAURAT MELALUI INTERESTERIFIKASI
ENZIMATIS DENGAN BAHAN BAKU
VIRGIN COCONUT OIL
DAN STEARIN SAWIT
Disertasi untuk memperoleh
derajat Doktor dalam Ilmu Pangan pada
Universitas Gadjah Mada
Dipertahankan di hadapan Dewan Penguji Program Pasca Sarjana Fakultas Teknologi Pertanian
Universitas Gadjah Mada pada tanggal 21 Januari 2013
Oleh Steivie karouw Lahir di Eris - Indonesia
RINGKASAN
Air Susu Ibu (ASI) mengandung asam palmitat pada posisi sn-2 sekitar 44,8%. Susu formula pada umumnya asam lemak palmitat teresterifikasi pada posisi sn-1 dan sn-3. Asam lemak palmitat yang teresterifikasi pada posisi sn-1 dan sn-3 dari triasilgliserol, akan dihidrolisis selama proses pencernaan oleh lipase pankreas. Asam palmitat akan membentuk kompleks asam lemak-kalsium sehingga sangat berpengaruh terhadap proses absorpsi kalsium pada bayi. Kondisi ini akan menyebabkan menurunnya penyerapan kalsium pada bayi. Untuk itu perlu dilakukan penelitian untuk mensintesis lemak yang memiliki profil asam lemak mirip asam lemak ASI atauHuman Milk Fat analog(HMF analog) dengan menggunakan 2-monogliserida kaya palmitat. Stearin sawit mengandung asam palmitat sekitar 49,6-58,8% dan sekitar 41,7% pada posisisn-2 sehingga potensial digunakan sebagai sumber 2-monogliserida kaya palmitat. HMF analog akan lebih baik diinkorporasikan dengan asam lemak rantai medium (ALRM) secara enzimatis menggunakan lipase spesifik sn-1,3. ALRM mudah diserap sehingga lebih cepat menghasilkan energi dan tidak tersimpan dalam sel adiposa. ALRM diperoleh dari Virgin coconut oil (VCO) yang mengandung asam laurat sekitar 46,64 - 48,80%.
Tujuan umum penelitian ini yaitu memperoleh HMF analog kaya laurat pada posisi sn-1 dan sn-3 dan kaya palmitat pada posisisn-2 dengan bahan baku stearin sawit dan VCO. Tujuan khusus adalah 1) memperoleh kondisi sintesis ester metil asam lemak kaya laurat dari VCO untuk bahan baku esterifikasiHMF
kondisi hidrolisis untuk mendapatkan 2-monogliserida kaya palmitat dari stearin sawit, 3) menentukan kondisi esterifikasi untuk mendapatkan HMF analogdan 4) mengetahui stabilitas hidrolisis dan oksidasiHMF analog.
Penelitian ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu pertama sintesis dan fraksinasi ester metil kaya laurat dari VCO; kedua hidrolisis enzimatis stearin sawit untuk menghasilkan 2-monogliserida kaya palmitat; ketiga sintesis HMF analogmelalui esterifikasi 2-monogliserida kaya palmitat dan ester metil kaya laurat oleh lipase dari Rhizomucor miehei dan keempat adalah pengujian stabilitas oksidasi dan hidrolsisHMF analog.
Tahap pertama dilakukan untuk menyiapkan ester metil asam lemak sebagai baku sintesis HMF analog. Tahap pertama diawali dengan preparasi VCO yang digunakan sebagai bahan baku. VCO diekstraksi dari daging buah kelapa varietas Dalam Mapanget umur buah 11-12 bulan. VCO yang diperoleh dianalisis sifat kimianya dan profil asam lemaknya. Kemudian VCO yang dihasilkan digunakan untuk sintesis ester metil asam lemak dengan cara metanolisis kimiawi. Reaksi metanolisis dilakukan secara kimiawi menggunakan katalisator kalium metoksida pada suhu 50, 55 dan 60oC selama 2 jam. Hasil metanolisis diukur yield dan proporsi asam lemaknya. Profil ester metil asam lemak dianalisis menggunakan Gas Chromatography (GC), selanjutnya ester metil yang dihasilkan difraksinasi kering dengan metode beku ke cair.
Tahap kedua dilakukan untuk menentukan enzim yang sesuai untuk menghasilkan 2-monogliserida dengan proporsi tertinggi melalui hidrolisis enzimatis dan pemurnian 2-monogliserida hasil hidrolisis. Tahap ini diawali
dengan pengujian untuk menentukan pH optimal enzim lipase pankreas dan lipase dari R. miehei yang akan digunakan untuk hidrolisis stearin sawit. Kondisi pH terbaik digunakan untuk hidrolisis stearin sawit. Preparasi 2-monogliserida dilakukan dengan melakukan hidrolisis pada rasio substrat:buffer fosfat (10:1, 10:2, 10:3, 10:4, 10:5 dan 10:6) dan waktu hidrolisis (6, 12, 18 dan 24 jam) menggunakan lipase dari R. miehei dan (6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 dan 48 jam) menggunakan lipase pankreas. Reaksi hidrolisis berlangsung dalam shaker waterbath 80 stroke/menit, pada suhu 40oC untuk lipase dari R. miehei dan 37oC untuk lipase pankreas. Hasil hidrolisis dianalisis dengan kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan larutan pengembang petroleum eter : dietil eter : asam asetat = 60 : 40 : 1 pada pelat Silica Gel F254 plat aluminium 20×20 cm, kemudian spot yang dihasilkan dianalisis dengan Camag TLC scanner 3. Hasil 2-monogliserida selanjutnya dimurnikan dengan KLT untuk mendapatkan 2-monogliserida kaya palmitat.
Tahap ketiga dilakukan untuk menentukan kondisi esterifikasi untuk mendapatkanHMF analog.HMF analogdisintesis melalui proses interesterifikasi 2-monogliserida kaya palmitat dan ester metil asam lemak kaya laurat. Reaksi interesterifikasi dilakukan pada variasi suhu reaksi 50, 55 dan 60oC, waktu reaksi selama 6, 12, 18 dan 24 jam dan konsentrasi enzim yaitu 2,5%; 5,0%; 7,5% dan 10,0% (b/b). Reaksi interesterifikasi dilakukan dalam waterbath shaker dengan kecepatan 120 stroke/menit. Kondisi proses yang menghasilkan HMF analog dengan jumlah yang paling banyak selanjutnya digunakan untuk sintesis HMF analog yang akan diuji posisi sn-2nya. Hasil interesterifikasi dianalisis profil
gliserida dan profil asam lemaknya. Profil gliserida dianalisis dengan kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan larutan pengembang petroleum eter : dietil eter : asam asetat = 60 : 40 : 1 pada pelat Silica Gel F254 plat aluminium 20×20 cm, kemudian spot yang dihasilkan dianalisis dengan Camag TLC scanner 3. Profil asam lemak dianalisis menggunakan GC. HMF analog yang diperoleh selanjutnya dianalisis posisi sn-2nya dengan cara hidrolisis menggunakan lipase pankreas, pemisahan sn-2 monogliserida menggunakan KLT dan identifikasi sn-2 monogliserida dengan GC.
Tahap keempat dilakukan untuk mengetahui stabilitas oksidasi dan hidrolisis dari HMF analog yang diperoleh. Pengujian stabilitas oksidasi dilakukan dengan menempatkan HMF analog pada suhu 60oC. Analisis angka peroksida dilakukan untuk penyimpanan 0, 24, 48 dan 72 jam, sedangkan pengujian stabilitas hidrolisis yaitu dengan menempatkan HMF analogpada suhu ruang. Analisis asam lemak bebas dilakukan untuk penyimpanan 0, 2, 4, 6 dan 8 hari.
Hasil penelitian tahap pertama diperoleh total kandungan asam lemak jenuh rantai medium pada VCO yang diproses dari buah kelapa varietas Dalam Mapanget yaitu sebesar 61,93% yang didominasi oleh asam laurat sebesar 48,24%, sehingga sangat sesuai untuk digunakan dalam sintesis ester metil asam lemak kaya laurat. Yieldester metil asam lemak yang dihasilkan pada suhu 50, 55 dan 60oC berturut-turut 85,41; 86,69 dan 85,52%. Suhu metanolisis antara 50-60oC tidak mempengaruhi yield ester metil minyak kelapa. Kemungkinan pada suhu 50 dan 55oC, tingkat kelarutan metanol sudah hampir sama. Total ester metil
rantai medium (ester metil kaprat/C8, ester metil kaprilat/C10 dan ester metil laurat/C12) yang dihasilkan pada suhu 50, 55 dan 60oC berturut-turut 60,81; 61,44 dan 59,85%. Kandungan ester metil laurat yang dihasilkan pada variasi suhu metanolisis menunjukkan nilai yang hampir sama yaitu 48,84; 49,01 dan 49,04% masing-masing pada suhu 50, 55 dan 60oC. Berdasarkan hasil yang diperoleh, suhu terbaik untuk sintesis ester metil kaya laurat melalui proses metanolisis kimiawi yaitu 50oC denganyield sebesar 85,41% dan total kandungan ester metil rantai medium 60,81%. Proses fraksinasi kering dengan metode beku ke cair hanya mampu meningkatkan proporsi ester metil laurat sebesar 6,68%, sehingga preparasi ester metil kaya laurat untuk sintesis HMF analogdigunakan ester metil asam lemak yang dipreparasi pada suhu metanolisis 50oC dan tanpa difraksinasi.
Hasil penelitian tahap kedua menunjukkan bahwa asam palmititat merupakan asam lemak dominan yang terkandung dalam stearin sawit, disusul asam lemak oleat masing-masing sebesar 59,41% dan 29,59%. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa stearin sawit merupakan sumber 2-monopalmitat yang potensial. Rasio substrat:buffer fosfat optimal untuk menghasilkan fraksi monogliserida yang tertinggi terlihat berbeda antara lipase dari R.miehei dan pankreas. Proporsi fraksi monogliserida tertinggi diperoleh pada rasio substrat:buffer fosfat=10:1 sebesar 9,14% dengan lipase dariR. miehei,sedangkan dengan lipase pankreas pada 10:4 sebesar 15,36 %. Hidrolisis menggunakan enzim lipase pankreas pada rasio substrat:buffer fosfat 10:4 dan waktu hidrolisis 42 jam dihasilkan 2-monogliserida tertinggi yaitu 40,45%. Apabila menggunakan lipase dari Rhizomucor miehei, 2-monogliserida tertinggi sebesar 21,59%
dihasilkan pada rasio substrat:buffer fosfat 10:1 dan lama hidrolisis 18 jam. Hasil yang diperoleh menunjukkan enzim lipase pankreas lebih sesuai untuk digunakan pada proses hidrolisis stearin sawit menjadi 2-mongliserida dibanding lipase dari Rhizomucor miehei, karena mampu menghasilkan 2-monogliserida dengan proporsi yang lebih tinggi. Hasil hidrolisis yang dimurnikan dengan KLT diperoleh 2-monogliserida dengan kandungan asam palmitat 55,21% dan asam oleat yaitu 35,26%. Kedua asam lemak tersebut diketahui merupakan asam lemak dominan yang terkandung dalam lemak ASI
Hasil penelitian tahap ketiga menunjukkan bahwa peningkatan suhu reaksi dari 50 menjadi 55oC tidak berpengaruh nyata terhadap jumlah trigliserida (HMF analog) yang dihasilkan. Peningkatan suhu reaksi dari 55 menjadi 60oC menurunkan trigliserida yang dihasilkan dari 60,18% menjadi 51,56%. Apabila suhu reaksi lebih tinggi dari suhu optimum enzim, maka akan mengakibatkan penurunan HMF analog yang diperoleh. Variasi lama reaksi esterifikasi menunjukkan bahwaHMF analogyang dihasilkan meningkat secara tajam pada 6 jam pertama mencapai 57,18% dan cenderung terus meningkat menjadi 60,24% sampai 12 jam. HMF analog yang dihasilkan menurun secara tajam menjadi 52,41% pada 24 jam, tetapi monogliserida cenderung sedikit meningkat dari 14,76% pada 12 jam dan menjadi 15,58% pada 24 jam. Berdasarkan hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa reaksi esterifikasi telah berlangsung sejak tahap awal reaksi. HMF analog yang dihasilkan cenderung mengalami peningkatan seiring dengan meningkatnya konsentrasi enzim yaitu berturut-turut 48,21; 53,06; 59,38 dan 62,25% masing-masing pada konsentrasi enzim 2,5; 5,0; 7,5 dan 10,0%
(b/b). HasilHMF analogtertinggi yaitu 62,25% diperoleh pada konsentrasi enzim 10,0% (b/b). Selama reaksi enzimatis, enzim dan substrat akan membentuk kompleks. Pada konsentrasi enzim yang rendah semua enzim berikatan dengan substrat. Jika konsentrasi enzim meningkat maka akan lebih banyak substrat yang berikatan dengan enzim hingga pada konsentrasi enzim tertentu semua substrat sudah berikatan dengan enzim dan selanjutnya peningkatan konsentrasi enzim tidak akan meningkatkan hasil esterifikasi. Berdasarkan hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa kondisi terbaik untuk sintesis HMF analog kaya palmitat pada posisi sn-2 dan kaya laurat pada posisisn-1 dan sn-3 melalui esterifikasi 2-monogliserida kaya palmitat dan ester metil asam lemak kaya laurat menggunakan biokatalis lipase dari R. miehei yaitu pada suhu 50oC selama 12 jam dan konsentrasi enzim 10,0% (b/b).HMF analogyang diperoleh pada kondisi tersebut memiliki profil asam lemak mirip lemak ASI pada trigliseridanya yaitu asam lemak palmitat dan oleat masing-masing 24,33% dan 8,99% serta ALRM sebesar 43,86%. Pada posisi sn-2 ditempati asam palmitat dan asam oleat masing-masing sebesar 39,71% dan 10,49%.
Hasil penelitian tahap keempat menunjukkan bahwa angka peroksidaHMF analog meningkat seiring dengan semakin lamanya penyimpanan. Pada tahap awal (0 jam), angka peroksida HMF analog sebesar 1,73 meq/kg dan cenderung mengalami peningkatan menjadi 1,81; 2,27 dan 2,37 meq/kg masing-masing setelah penyimpanan 24, 36 dan 72 jam. Selama penyimpanan hanya terjadi sedikit peningkatan angka peroksida pada HMF analog. Hal ini disebabkan asam lemak yang ada padaHMF analog sebagian besar adalah asam lemak jenuh yang
terbukti sangat stabil terhadap proses oksidasi. Peroksida yang terbentuk sebagai akibat dari oksidasi yang terjadi pada asam lemak tak jenuh yang ada pada HMF analog yaitu asam oleat (8,98%) dan linoleat (1,4%). Kadar asam lemak bebas HMF analog cenderung meningkat seiring dengan bertambahnya waktu simpan. Pada tahap awal (0 hari), kadar asam lemak bebas HMF analog sebesar 0,43% dan cenderung mengalami peningkatan menjadi 0,62; 0,83; 1,24 dan 1,37% masing-masing setelah penyimpanan 2, 4, 6 dan 8 hari. Hasil ini menunjukkan bahwa selama penyimpanan terjadi proses hidrolisis padaHMF analog. Hidrolisis pada trigliserida terjadi dengan adanya air yang dikatalisis oleh enzim lipase (Rossell, 1989; Gunstone, 1996). Selama penyimpanan pada suhu ruang terjadi absorpsi air dari lingkungan. Kondisi ini memungkinkan terjadinya reaksi hidrolisis pada HMF analog. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa HMF analog yang dihasilkan memiliki kadar asam lemak bebas yang masih berada pada kisaran asam lemak bebas yang hampir sama dengan HMF analogyang lain dan lipida terstruktur hasil interesterifikasi enzimatis.
SUMMARY
Human milk fat contained high percentage of palmitic acid (44.80%), that predominantly located in the sn-2 position of the triglycerides. Meanwhile infant formulas contain palmitic acid predominantly in sn-1,3 positions. The role of palmitic acid in the sn-2 position of the glycerol backbone is to ease the digestion and absorption of the fats in the infant intestine. Long chain saturated fatty acids, like palmitic acid, esterified to sn-1,3 positions during the digestion can form insoluble fatty acid complexes with calcium rendering it unavailable. In recent years, there have been a considerable researchs conducted on stuctured lipids contain fatty acid profile similarly to that of human milk or Human Milk Fat analog (HMF analog). Generally, tripalmitin or lard oil were used as sources of palmitic acid in sn-2 position. Palmitic acid was the major fatty acid in palm stearin (49.6-58.8%), in which 58.3% mainly located in the sn-2 position. Thus,
palm stearin was good source of 2-monopalmitin which could be hydrolyzed enzimatically using specific 1,3 lipase such as pancreatic lipase. HMF analog having high percentage of palmitic acid in the 2 and high lauric acid in the sn-1,3 positions could be synthesized by enzymatic interesterification of 2-monoglyceride and medium chain fatty acid (MCFA). The MCFA, when included in the diet, prevented obesity (St-Onge and jones, 2002) and reduced body weight. MCFA was found to increase body endogenous oxidation by changing the composition of the adipose tissue pool through altered endogenous availability. The capability of Medium Chain Triglyceride (MCT) to increase endogenous fat
increasing adipose tissue mobilization (Binnert et al., 1998; Papamandjaris et al., 2000). Medium chain fatty acids (MCFA), which in the Virgin Coconut Oil (VCO) amounted 46.6-48.0% could be used for interesterification reaction in fatty acid methyl ester form.
The main objective of this study was to synthesize HMF analog having high percentage of palmitic acid in the sn-2 and high lauric acid in the sn-1,3 positions. More special the objectives of this study were 1) to obtain preparation method of high lauric fatty acid methyl ester from coconut oil through chemical methanolysis and dry fractionation, as raw materials for synthesis of HMF analog, 2) to determine the enzyme and the enzymatic hydrolysis condition to obtain high palmitate 2-monoglyceride from palm stearin, 3) to determine enzymatic esterification condition for producing HMF analog, and 4) to determine oxidation and hydrolysis stability of the resulted HMF analog.
This research was conducted in 4 steps as follows: The first step was synthesis and fractionation of high lauric fatty acid methyl ester from VCO; the second step was enzymatic hydrolysis of palm stearin to obtain high palmitic 2-monoglyceride; the third step was synthesis of HMF analog through enzymatic interesterification of high palmitic 2-monoglyceride and high lauric fatty acid methyl ester using lipase from Rhizomucor miehei as biocatalyst and the fourth step was hydrolysis and oxidation stability test of the resulted HMF analog.
The first step was design to prepare fatty acid methyl ester as raw materials for synthesis of HMF analog. Coconut oil was extracted from 11-12 months of Mapanget Tall coconut variety fruit. The oil was then analyzed to
evaluate the physycochemical properties and fatty acids profile. The oil was then utilized to synthesize fatty acid methyl ester through chemical methanolysis. Methanolysis reaction was conducted using potassium metoxide as catalyst at 50, 55 and 60oC for 2 hours. Furthermore, the fatty acid methyl ester was franctionated by freezing at -20oC for 24 hrs and then melting from solid to liquid form at 5oC. The methanolysis products were then measured the yield and determined fatty acids profile using Gas Chromatography (GC).
The second step of this study was designed to determine the enzyme and hydrolysis condition to obtain the highest 2-monoglyceride from palm stearin. The effect of the pH on the enzymatic hydrolysis of palm stearin to obtain monoglyceride byR. mieheiand pancreatic lipases was evaluated. Enzymatic hydrolysis reactions were held at various ratio of substrate:phospate buffer (10:1, 10:2, 10:3, 10:4, 10:5, 10:6) and duration time of 6, 12, 18, 24 hours byR. mieheilipase and 24, 30, 36, 42, 48 hours by pancreatic lipase. Enzymatic hydrolysis reaction was carried out in waterbath shaker 80 stroke/minute, at 40oC with R.miehei lipase and 37oC with pancreatic lipase. The hydrolysis products were monitored using TLC with petroleum ether : diethyl ether : acetic acid = 60:40:1 as developing solvent on Silica Gel F254 20×20 cm plate. The spots were then analyzed using Camag TLC-scanner. Then, the resulted 2-monoglycerides were purified using TLC.
The third step of the study was designed to obtain the condition to synthesize HMF analog having high percentage of palmitic acid in the sn-2 and high lauric acid in the sn-1,3 positions by using lipase from R. miehei as biocatalyst. The interesterification reactions were held at various temperature
(50oC, 55oC and 60oC), time (6, 12, 18, 24 hours) and enzyme concentration (2.5, 5.0, 7.5, and 10.0 wt% of total substrate). All of the enzymatic esterification reactions were carried out in a waterbath shaker operating at 120 stroke/minute. These three experiments resulted the highest HMF analog, which then to be used to determine the sn-2 position of HMF analog. The resulted HMF analog were then measured the glycerides composition and fatty acid profile. The glycerides composition were monitored using TLC with petroleum ether : diethyl ether : acetic acid = 60:40:1 as developing solvent on Silica Gel F254 20×20 cm plate and fatty acid profile by GC. The sn-2 position of HMF analog was analyzed using pancreatic lipase.
The fourth step of this study was designed to determine the oxidative and hydrolysis stability of resulted HMF analog. Oxidative stability test was carried out for up to 72 hours at 60oC. The peroxide value was measured during 0, 24, 48 and 72 hours of storage duration. Hydrolysis stability test was held for up to 8 days at room temperature. The free fatty acid content was monitored during 0, 2, 4, 6 and 8 days of storage.
The results of first step showed that, the VCO has a good quality and medium chain fatty acid content is 61.93%, whereas lauric acid is the major component about 48.24%. Thus, the VCO was source for synthesis of high lauric fatty acid methyl ester. The yield of fatty acid methyl ester were 85.41, 86.69 and 85.52% at reaction temperature of 50, 55 and 60oC, respectively. These results indicated that the yield of fatty acid methyl ester was not affected by the temperature of methanolysis reaction. Presumably, methanol having the similary
solubility at temperature of 50-55oC. The medium chain fatty acids methyl ester content, such as methyl caprate (C8), methyl caprilate (C10) and methyl laurate (C12), were 60.81, 61.44 and 59.85% at reaction temperature of 50, 55 and 60oC, respectively. Methyl laurate content were 48.84, 49.01 and 49.04% at reaction temperature of 50, 55 and 60oC, respectively. Therefore, the condition to synthesize high lauric fatty acid methyl ester by chemical methanolysis using potassium hydroxide as a catalyst was at 50 oC. The yield of fatty acid methyl ester produced under this condition was 85.41% and medium chain methyl ester content was 60.81%. Dry fractionation process only increased 6.68% of fatty acids methyl laurate content. Therefore, the fatty acid methyl ester for synthesis of HMF analog was prepared at methanolysis temperature of 50oC.
The results of second step showed that, palmitic acid was the major fatty acid in palm stearin, followed by oleic acid of 59.41 and 29.59%, respectively. Thus, palm stearin was good source of 2-monopalmitin. Lipase from R. miehei
and pancreatic having different capability to hydrolize palm stearin to obtain 2-monoglyceride at various ratio substrate:phospate buffer during the same of hydrolysis reaction time. The highest monoglyceride fraction was obtained from ratio substrate:phospate buffer 10:1 by Rhizomucor miehei lipase (9.14%) and ratio substrate:phospate buffer 10:4 by pancreatic lipase (15.36%). At similar ratio substrate:phosphate buffer, the monoglyceride fraction obtained by pancreatic lipase was higher than by lipase from R. miehei of 13.12% and 9.14%, respectively. Enzymes having specific activity to catalyze the reaction, therefore the amount of water was required by enzymes to maintain their catalytic ability
depended on the type of substrate and enzyme (Formuso and Akoh, 1998). The highest monoglyceride fraction was obtained from ratio substrate:phospate buffer 10:4 at 42 hours of incubation by pancreatic lipase (40,45%) and ratio substrate:phospate buffer 10:1 at 18 hours of incubation by Rhizomucor miehei lipase (21,59%). The results showed that, pancreatic lipase having more capability to hydrolize palm stearin to produce 2-monoglyceride compare to lipase from R. miehei. The hydrolysis product of palm stearin which was purified by TLC contained palmitic and oleic acids of 55.21% and 35.26%, respectively. These two fatty acids were the major fatty acid consist in HMF.
The results of third step shown that, an increase of esterification reaction temperature from 55 to 55oC significantly not influenced the triglycerides (HMF analog). An elevation of reaction temperature increased enzyme activity which lead to raise the triglyceride (the HMF analog) result. In contrast, if the reaction temperature was higher than the optimum enzyme temperature (50oC) it would markedly reduced the amount of HMF analog result. The HMF analog markedly increased during the first 6 hours of reaction and continuously increased up 60.24% at 12 hours. This results indicate that the esterification reaction started at the early stage of reaction (6 hours), however, after 12 hours, the reaction was dominated by hydrolysis reaction of HMF analog to diglyceride and hydrolysis of diglyceride to monoglyceride. The diglyceride decreased until 18 hours and then increased slightly to reach approximately 7.57% at 24 hours. The diglyceride may be formed through hydrolysis of triglyceride or esterification of monoglyceride. The HMF analog content increased with the raise of enzyme concentration. The
HMF analog content were 48.21, 53.06, 59.38 and 62.25% at enzyme concentration of 2.5, 5.0, 7.5, and 10.0% by weight of total substrate, respectively. At the same length of reaction time, rising of enzyme concentration resulted in increasing product concentration. Therefore, we concluded that, the condition for esterification of high palmitic and high lauric fatty acid methyl ester to produce high palmitic at sn-2 position and high lauric at sn-1 and sn-3 positions of HMF analog by using lipozyme lipase from R. mieheias biocatalyst was at 50oC for 12 hours of reaction time and 10.0% (w/w) of enzyme concentration. The fatty acid profile of resulted HMF analog was similarly to which in human milk fat. The palmitic and oleic acids content of HMF analog were 24.33 and 8.99%, respectively and MCFA of 43.86%. The palmitic and oleic content in the sn-2 position were around 39.71% and 24.18%, respectively.
The results of the fourth step showed that, the peroxide value of resulted HMF analog the peroxide value (PV) slightly increased during storage. The PV of HMF analog were 1,73; 1,81; 2,27 dan 2,37 meq/kg at storage duration of 0, 24, 48 and 72 hours, respectively. The peroxide value was affected by the composition of fatty acid of HMF analog. Saturated fatty acids, having superior oxidative stability compared to unsaturated fatty acids, were the major fatty acid contained in the resulted HMF analog. Presumably, the peroxide was formed by oxidation of unsaturated fatty acids such as oleic and linolenic contained in HMF analog of 8.98 and 1.40%, respectively. An elevation of storage duration increased the free fatty acids content of HMF analog. Before storage (0 day), the free fatty acid content of HMF analog was 0.43% and raised to 0.62, 0.83, 1.24
and 1.37% during 2, 4, 6 and 8 days of storage duration, respectively. The results indicated the hydrolysis deterioration occured during storage of HMF analog. Hydrolysis deterioration of triglyceride was catalyzed by enzyme in the suitable water condition (Rossell. 1989; Gunstone, 1996). Therefore, we concluded that the free fatty acid and peroxide value of resulted HMF analog were in line with the stuctured lipids reported by previous studies.
