PENGARUH PENAMBAHAN Pseudomonas aeruginosa TERHADAP BIODEGRADASI DDT OLEH Pleurotus ostreatus

(1)

L/O/G/O

PENGARUH PENAMBAHAN

Pseudomonas aeruginosa

TERHADAP BIODEGRADASI DDT

OLEH

Pleurotus ostreatus

Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember

Oleh: Khoirul Ashari (1409100050) Dosen Pembimbing: 1. Adi S. Purnomo, M.Sc., Ph.D. 2. Drs. Refdinal Nawfa, MS. Surabaya, 08 Januari 2014

(2)

Overview

Pendahuluan Metodologi

Hasil & Pembahasan Kesimpulan

4 1 2 3

(3)

• Dikloro Difenil Trikloroetana (DDT) ditemukan pada tahun 1873 oleh Othmar Zeidler

• Digunakan secara luas sebagai

insektisida sejak 1940 hingga 1960-an • DDT bersifat karsinogenik (Smith,

2001; Snedeker, 2001), bioakumulasi, biomagnifikasi, dan merusak

ekosistem alami (Sumardjo, 2008) • Di indonesia telah dilarang

penggunaannya berdasarkan SK Menteri Pertanian RI No.

434.1/Kpts/TP.270/ 7/2001

Pendahuluan

(4)

www.themegallery.com

• Ramadhani (2010) melaporkan bahwa di daerah persawahan SUB DAS

Citarum hulu masih mengandung residu DDT yang cukup tinggi

• Purnomo (2008) melaporkan bahwa P. ostreatus mampu mendegradasi DDT

sekitar 45% dalam media PDB yang diinkubasi selama 14 hari.



Latar Belakang

Biodegradasi oleh jamur

Kurang maksimal

 Mampu menghasilkan biosurfaktan

(Datta, 2011)

 Mampu mendegradasi DDT

(Golovleva dan Skryabin, 1981)

Trichoderma viride _{Pleurotus ostreatus}

Phanerochaete chrysosporium Trametes versocolor

(5)

 Apakah dengan penambahan bakteri P. aeruginosa

memberikan pengaruh terhadap proses degradasi DDT oleh jamur P. ostreatus.



Rumusan Masalah



Batasan Masalah

 Variasi konsentrasi bakteri P. aeruginosa yang

ditambahkan ke dalam kultur P. ostreatus untuk proses degradasi DDT yaitu sebesar 1, 3, 5, dan 10 ml (1 ml ≈ 1,2525 x 109_{sel bakteri}_{P. aeruginosa}_{/ml kultur)}

(6)

• Mengetahui pengaruh penambahan bakteri P. aeruginosa ke dalam kultur P. ostreatus terhadap jumlah

degradasi DDT.

• Mengetahui konsentrasi bakteri P. aeruginosa yang

sesuai untuk optimasi degradasi DDT oleh P. ostreatus.

• Mengetahui metabolit produk yang dihasilkan selama proses degradasi DDT.

(7)

Metodologi

A. Regenerasi Jamur Pleurotus ostreatus

Inokulasi

Diinkubasi suhu 25°C selama 7 hari

B. Persiapan Kultur Cair Jamur

inokulasi

PDA

Jamur hasil regenerasi beserta media

Aqua DM steril

10 ml PDB

pre-inkubasi suhu 25°C selama 7 hari

(8)

C. Regenerasi Bakteri Pseudomonas aeruginosa

Diinkubasi suhu 37°C selama 24 jam

NA

D. Pembuatan Kurva Pertumbuhan P. aeruginosa

Bakteri hasil regenerasi _{NB, diinkubasi} suhu 37°C, 180 rpm OD₆₀₀ tiap jam Kurva pertumbuhan Waktu Abs orbans i 1 koloni 1 koloni (Brodham, 2007)

(9)

E. Persiapan Kultur Cair Bakteri

1 koloni

F. Biodegradasi DDT Oleh Jamur P. ostreatus

Bakteri hasil regenerasi 40 ml NB 12 jam, suhu 37°C, 180 rpm

Kultur hasil pre-inkubasi

ox

ygen

Statis, 7 hari, suhu 25°C DDT 5 mM

(10)

www.themegallery.com

G. Biodegradasi DDT Oleh Bakteri P. aeruginosa

H. Pengaruh Penambahan P. aeruginosa Terhadap Biodegradasi DDT Oleh P. ostreatus

DDT 5 mM

Kultur bakteri hasil pre-inkubasi

10 ml PDB ox

ygen

Statis, 7 hari, suhu 25°C

Statis, 7 hari, suhu 25°C DDT 5 mM Kultur bakteri hasil pre-inkubasi P. ostreatus hasil pre-inkubasi ox ygen

(11)

I. Pembuatan Kurva Standar DDT (100 % = 0,25 µmol DDT yang berasal dari 50 µL DDT 5 mM) 25% 50% 100% DDT 5 mM Piren 5 mM Internal standar DDT / p ire n Kons. DDT HPLC

(12)

J. Perolehan Ulang (Recovery) DDT Dan Identifikasi Metabolit Produk metanol Piren 5 mM aseton Suhu 40°C Filtrat Hasil evaporasi aquades n-heksana Fasa aquos n-heksana aquades Filtrasi 10 menit Kultur hasil inkubasi

(13)

Fasa organik total Na₂SO₄· xH₂O Filtrasi Filtrat GC/MS 1 ml metanol HPLC Ultrasonic cleaner Tersisa ± 1 ml

(14)

Hasil & Pembahasan

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 0 5 10 15 20 25 30 Ab sorb an si

Waktu Inkubasi (jam)

Kurva Pertumbuhan P. aeruginosa

(OD₆₀₀)

Fase Stasioner Fase Eksponensial

Fase Lag

Fase Kematian

A. Kurva Pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa

(15)

B. Kurva Standar DDT y = 0,001x R² = 0,911 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0 20 40 60 80 100 120 Perb andi ng an lua s pun ca k D D T/ Pi ren Konsentrasi DDT (%) Kurva Standar DDT

(16)

Tabel 1. Jumlah degradasi DDT hasil biodegradasi oleh P. ostreatus dengan waktu inkubasi selama 7 hari

*Data yang ditampilkan merupakan nilai rata-rata dari tiga sampel (n=3)

C. Biodegradasi DDT Oleh Pleurotus ostreatus

Kontrol (%)* Treatment (%)* Degradasi (%)

98,56 79,22 19,34 6 . 00 8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 00 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 00 2 0 . 0 0 2 2 . 00 2 4 . 00 2 6 . 0 0 2 8 . 0 0 30 . 00 3 2 . 0 0 0 2 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 1 4 0 0 0 0 0 1 6 0 0 0 0 0 1 8 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 2 4 0 0 0 0 0 2 6 0 0 0 0 0 2 8 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 2 0 0 0 0 0 3 4 0 0 0 0 0 3 6 0 0 0 0 0 3 8 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 4 2 0 0 0 0 0 4 4 0 0 0 0 0 4 6 0 0 0 0 0 4 8 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 5 2 0 0 0 0 0 5 4 0 0 0 0 0 5 6 0 0 0 0 0 5 8 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 6 2 0 0 0 0 0 6 4 0 0 0 0 0 6 6 0 0 0 0 0 T i m e - - > A b u n d a n c e T I C : P O P S E 5 T 1 . D

Piren (waktu retensi 16,094 menit) DDE (waktu retensi 17,125 menit)

DDT (waktu retensi 20,668 menit) DDD (waktu retensi 19,262 menit) DDMU (waktu retensi 14,944 menit)

(17)

D. Biodegradasi DDT Oleh Pseudomonas aeruginosa 3,12 25,55 36,07 26,23 0 5 10 15 20 25 30 35 40 1 ML 3 ML 5 ML 10 ML De gr ad asi DDT (% ) Konsentrasi Bakteri

(1 ml ≈ 1,2525 x 109_{sel bakteri/ml kultur)}

Degradasi DDT oleh Pseudomonas aeruginosa dengan waktu inkubasi selama 7 hari

(18)

6 . 0 0 8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0 2 6 . 0 0 2 8 . 0 0 3 0 . 0 0 3 2 . 0 0 0 2 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 1 4 0 0 0 0 0 1 6 0 0 0 0 0 1 8 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 2 4 0 0 0 0 0 2 6 0 0 0 0 0 2 8 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 2 0 0 0 0 0 3 4 0 0 0 0 0 3 6 0 0 0 0 0 3 8 0 0 0 0 0 T i m e - - > A b u n d a n c e T I C : P S E 1 0 T 1 . D

Piren (waktu retensi 16,094 menit)

DDE (waktu retensi 17,125 menit)

DDT (waktu retensi 20,668 menit)

(19)

E. Biodegradasi DDT Oleh Pleurotus ostreatus dengan penambahan Pseudomonas aeruginosa

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Kontrol 1 ml 3 ml 5 ml 10 ml D egr adasi DD T (% ) Konsentrasi bakteri (1 ml ≈ 1,2525 x 109_{sel/ml kultur)} Degradasi oleh jamur + bakteri Degradasi oleh bakteri Degradasi oleh jamur

Grafik jumlah DDT terdegradasi oleh P. ostreatus dengan

(20)

6 . 0 0 8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0 2 6 . 0 0 2 8 . 0 0 3 0 . 0 0 3 2 . 0 0 0 2 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 1 4 0 0 0 0 0 1 6 0 0 0 0 0 1 8 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 2 4 0 0 0 0 0 2 6 0 0 0 0 0 2 8 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 2 0 0 0 0 0 3 4 0 0 0 0 0 3 6 0 0 0 0 0 3 8 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 4 2 0 0 0 0 0 4 4 0 0 0 0 0 4 6 0 0 0 0 0 4 8 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 5 2 0 0 0 0 0 5 4 0 0 0 0 0 5 6 0 0 0 0 0 T i m e - - > A b u n d a n c e T I C : P O P S E 1 0 T 1 . D

Piren (waktu retensi 16,094 menit) DDMU (waktu retensi 14,944 menit)

DDE (waktu retensi 17,125 menit) DDD (waktu retensi 19,262 menit)

DDT (waktu retensi 20,668 menit)

(21)

Jalur degradasi DDT oleh P. ostreatus dengan

penambahan P. aeruginosa yang diusulkan

F. Jalur Degradasi DDT Oleh P. ostreatus Dengan Penambahan P. aeruginosa

(22)

Kesimpulan

 Penambahan bakteri P. aeruginosa ke dalam kultur P. ostreatus

dapat meningkatkan jumlah degradasi DDT.

 Kultur dengan penambahan bakteri konsentrasi 3 ml memiliki

jumlah degradasi DDT yang tertinggi yakni sekitar 85,74 %, sedangkan pada penambahan bakteri konsentrasi 1 ml memiliki jumlah degradasi terendah yakni sekitar 23,14 %.

 Produk yang dihasilkan selama proses degradasi DDT oleh P. ostreatus dan P. aeruginosa antara lain DDE, DDD, dan DDMU.

(23)

L/O/G/O

(24)

(25)

• Standar OD₆₀₀Escherichia coli dimana :

Absorbansi 1 ≈ 1 x 109_{sel/ml kultur}

≈ 1 mg/ml or 1 g/liter berat basah sel ≈ 0.25 g/liter berat kering sel

• (http://www.exptec.com/Expression%20Technologies/Ba

(26)

(Zhao, 2010)

(27)

(Purnomo, 2010)

Biodegradasi DDT menggunakan

(28)

(29)

• White-rot fungi produce four major groups of enzymes for the degradation of lignin: lignin peroxidase (known as ligninase in early publications; LiP; EC 1.11.1.14),

manganese dependent peroxidase (manganese

peroxidase, MnP; EC 1.11.1.13), versatile peroxidase (VP; EC 1.11.1.16), and laccase (EC 1.10.3.2).

• Lakase: oksigen oksidoreduktase

• Laccases are known to catalyze the oxidation of a large range of phenolic compounds and aromatic amines (Call and Mucke, 1997).

(30)

(31)

reduksi oksidasi oksidasi

(32)

(33)

(34)

Dehydrochlorination involves the simultaneous removal of hydrogen

and chlorine from organochlorine insecticides. Typically, the reaction takes place between the saturated chlorinated carbon and the adjacent

hydrogen on the neighboring carbon (Lal dan Saxena, 1982).

(35)

(36)

(37)

(38)

(39)

(40)

(41)

(42)

(43)

(44)

Resonansi terjadi karena adanya delokalisasi elektron dari ikatan rangkap ke ikatan tunggal.

(45)

1. Pepton-gliserol 2. Aerasi (shaker)

3. Metodenya (pre-expose DDT)

(46)

(47)

Waktu retensi (menit): 1. Piren (10.02)

2. DDT (14.89)

Waktu retensi (menit)

Kromatogram HPLC sampel kontrol

A bso rbansi (m A U )

(48)

(49)

(50)

Spektra MS DDT hasil analisis sampel jamur

(51)

(52)

(53)

(54)

Spektra MS DDD dalam database Spektra MS DDD hasil analisis sampel jamur

(55)

(56)

Spektra MS DDMU dalam database Spektra MS DDMU hasil analisis sampel jamur

(57)

(58)

Syarat internal standar

• Harus mempunyai sifat fisik dan kimia yang

mirip dengan senyawa yang akan dianalisis

• Harus stabil

• Tidak terdapat dalam kandungan senyawa yang

akan dianalisis

(59)

Ekstraksi cair-cair

• Ekstraksi cair-cair merupakan proses pemisahan satu atau lebih komponen terlarut (solute) dari cairan

pembawa (diluen) menggunakan pelarut cair (solven) sebagai separating agent.

• Prinsip dari metode ini adalah perbedaan kelarutan solute (komponen terlarut) dalam solven dan diluen (cairan pembawa).

• Dalam ekstraksi cair-cair diperoleh 2 fase cairan,

pertama adalah fase rafinat/fase residu berisi diluen dan sisa solut, kedua adalah fase ekstrak yang berisi solut dan solven.

(60)

Untuk mencapai proses ekstraksi cair-cair yang baik, pelarut yang digunakan harus memenuhi kriteria sebagai berikut:

1. Kemampuan tinggi melarutkan komponen zat terlarut di dalam campuran. 2. Kemampuan tinggi untuk dapat diambil (recovery) kembali.

3. Perbedaan massa jenis antara ekstrak dan rafinat lebih besar.

4. Pelarut dan larutan yang akan diekstraksi harus tidak mudah campur. 5. Tidak mudah bereaksi dengan zat yang akan diekstraksi.

6. Tidak merusak alat secara korosi.

7. Perbedaan densitas solven dan diluen harus cukup besar. 8. Memiliki tegangan antar muka yang tinggi.

9. Memiliki koefisien distribusi (K_D) yang tinggi.

(61)

(62)

(63)

HPLC

• Prinsip dasar pemisahan HPLC adalah perbedaan kecepatan

migrasi dari komponen-komponen dalam sampel yang terjadi

karena adanya perbedaan keseimbangan distribusi dalam fasa diam dan fasa gerak. Di dalam HPLC, fasa diam dan fasa gerak dapat

berinteraksi secara selektif dengan sampel. Interaksi seperti

pembentukan kompleks atau ikatan hidrogen dapat terjadi dalam fasa gerak HPLC (Lindsay, 1992).

• Fase gerak dapat dipompakan ke dalam kolom dengan tiga cara : 1. Isokratik: aliran tetap (konstan) dan ketetapan komposisi dari fase

gerak tetap berlaku.

2. Gradient Elution: aliran konstan dan perubahan komposisi dari fase gerak terjadi.

3. Flow Program: aliran bervariasi dan ketetapan komposisi dari fase gerak terjadi.

(64)

GC-MS

• Prinsip kerja GC-MS didasarkan pada perbedaan kepolaran dan massa molekul sampel yang dapat diuapkan.

• Komponen-komponen yang ada pada sampel akan

dipisahkan berdasarkann partisi diantara fase gerak (gas pembawa) dan fase diam (kolom). Hasilnya adalah

berupa molekul gas yang kemudian akan diionisasikan pada spektrofotometer massa sehingga molekul gas itu akan mengalami fragmentasi yang berupa ion-ion positif. Ion akan memiliki rasio yang spesifik antara massa dan muatannya (Karliawan 2009).