III. BAHAN D A N
METODE
,
Untuk mencapai sasaran tujuan penelitian,' s e s u a i dengan s p a yang t e l a h dikemukakan p a d a B a b I d i muka, maka p e n e l i t i a n ini disusun d a l a m b e b e r a p a tahap. S e c a r a keseluruhan, p e n e l i t i a n ini meliputi: 1) p e n e l i t i a n laboratorium, b e r u p a p e n e l i t i a n s e r o l o g i k : p a d a t a h a p ini d i m u l a i dengan pengumpulan bahan i s o l a s i b e r u p a b u r s a F a b r i c i u s ayam- ayam y a n g terinfeksi o l e h virus IBD, b e r a s a l d a r i peternakan ayam d i b e b e r a p a tempat d i Pulau-pulau Sumatera, J a w a , B a l i d a n Pulau S u l a w e s i , diikuti dengan tahapan i s o l a s i d a n i d e n t i f i k a s i t i p e v i r u s I B D a s a l lapang; d a n 2) penelitian ekeperimental. P a d a tahapan p e n e l i t i a n e k s p e r i m e n t a l ini t e l a h dikerjakan 2 macam p e r c o b a a n yaitu uji i m u n i s a s i p a s i f s i l a n g dan uji n e t r a l i s a s i s i l a n g a n t a r a i s o l a t v i r u s I B D a s a l l a p a n g dengan a n t i s e r a v i r u s v a k s i n a s a l impor.
Mengenai bahan-bahan s e r t a metode-metode y a n g digunakan p a d a s e t i a p langkah d a r i penelitian ini, d a p a t diikuti p a d a uraian-uraian s e b a g a i berikut:
3.
1.Waktu d a n Tempat Penelitian
P e n e l i t i a n ini dimulai p a d a bulan M e i 1992 hingga S e p t e m b e r 1994 d a n dilakukan di Laboratorium Imunologi, Jurusan Penyakit H e w a n dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, F a k u l t a s K e d o k t e r a n H e w a n , Institut Pertanian Bogor
.
3.
2. Penelltian di Laboratorlum
Penelitian ini meliputi:
1) i s o l a s i virus IBD dari bursa Fabricius pada telur berembrio bebas
.
patogen tertentu(SPF
= specific pathogen f r ~ e ) , umur 9-10 hari dan p a d a biakan jaringan (chicken embryo Jlbroblast = CEF), melakukan uji serologik dengan uji netralisasi serum terhadap isolat virus IBD asal lapang, dilanjutkan identifikasi virus IBD asal lapang2) pembugtan dan pemurnian antigen (cloning)
5) titrasi virus IBD pada biakan re1 fibroblas embrio ayam
4) pembuatan serum kebal kelinci terhadap isolat virus IBD anal lapang 5) uji netralisasi serum untuk menentukan keterkaitan antigen; untuk
memilih inolat virus IBD asal lapang yang dapat mewakili beberapa tempat d i Indonesia.
3.2.1. I s o l a s i dam Identifikasi Tipa I s o l a t Virus IBD A s a l Lapang:
Hswan Percobaan:
T I / K ~ berembrio yang bebas patogen tertentu ( S P F = specific pathogen free) beranal dari P T Vaksindo Satwa Nusantara,
Citeureup.
Kelinci p r t i b (New Zealand white) dengan berat badan kisaran 1 kg yang berasal dari Balai Penelitian Ternak, Ciawi
Ayam p e t e l r r jantan berumur 1 (satu] hari, dari PT Manggis, Cibadak. Sukabumi.
Baban Kimia. Bahan-bahan untuk media biakan jaringan (chicken embryo fibroblast = CEF) adalah L-glutamin, tryptoee phosphat broth, serum an& sapi (calf serum), tripsin 0.25%. photiphat pen-
28 yangga (buffer) atau larutan PBS yang mempunyai pH = 7.4 ini akan digunakan untuk bahan pelarut d m pengencer suspensi dari organ bursa. antibiotika, fungizon, NaH2C0, 7.3%.
P l r a l a i a n .Peralatan yang digunakan dalam penelitian a d a l d high speed c e n t r i f u g e , l a m i n a r flow dan C 0 2 incubator.'
Metadc:
Biakan r e / . Biakan s e l fibroblas (chicken embryo fibroblast =
CEF)
dibuat d a r i telur berembrioSPF
berumur 9-10 hari. Tatacara pembiakan CEF sama seperti dilaporkan oleh Lukert (1986). Biakan sel diinkubasikan dalam inkubator suhu 37OC dengan kadar 5% COz. M e d i a yang digunakan mengikuti Jackwood e t a l . (1982b) dengan j e n i s MEM (minimal essential medium) dari Dulbecco ( D M E M ) .T r l u r berembrio. Telah lama diketahui bahwa virus tidak dapat berkembang biak dalam media sintetik yang terdiri dari bahan kimia. Virus hanya dapat berkembang biak dalam sistem sel hidup, yakni hewan percobaan (ayam, marmot dan kelinci) telur berembrio dan biakan sel atau biakan jaringan. Telur berembrio digunakan
Pembnatan biakan set.
T u j r a n : untuk m e n g i s o l a s i , mengidentifikasi, memperbanyak virus, t i t r a s i v i r u s inolat l a p a n g dan untuk uji n e t r a l i s a s i s e r u m .
C a r a k e r j a : e m b r i o ayam diambil dengan pineet s t e r i l d a n dimasukkan d a l a m c a w a n p e t r i nteril. K e p a l a , kaki, e a y a p d a n i s i perut dibuang s e l e b i h n y a dimasukkan k e d a l a m l a b u erlenmeyer, kemudian d i p o t o n g - p o t o n g dengan gunting s a m p a i hhlus d a n d i c u c i dengan l a r u t a n P B S s t e r i l , untuk menghilangkan d a r a h . S e t e l a h itu dituangkan l a r u t a n t r i p s i n 0,25% yang telah dihangatkan p a d a suhu 37°C dalam p e n a n g a s a i r ( w a t e r b a t h ) .
Untuk m e l e p a s k a n s e l - s e l d a r i potongan jaringan, m a k a larutan t e r s e b u t d i k o c o k dengan a l a t pengocok magnet (magnetic s t i r r e r ) s e l a m a 10 menit. Kemudian larutan yang mengandung t r i p s i n d i d i a m k a n b e b e r a p a menit, a g a r potongan j a r i n g a n yang m a s i h b e s a r mengendap. S u p e r n a t a n yang mengandung t r i p s i n d a n butir d a r a h m e r a h dibuang d a n k e p a d a e n d a p a n n y a k e m b a l i ditambahkan larutan t r i p e i n , p r o s e s t r i p s i n a s i d i u l a n g 3 k a l i namun s u p e r n a t a n yang terbentuk dituangkan ke dalam tabung sentrifus. Untuk memisahkan s e l d a r i larutan t r i p s i n , maka s e l disentrifue p a d a k e c e p a t a n 1.500 r p m s e l a m a 10 menit. S e l a n j u t n y a s e l t e r s e b u t d i c u c i dengan l a r u t a n PBS s t e r i l untuk menghilangkan kandungan tripsinnya, guna memisahkan s e l h a l u s d a r i e e l potongan b e s a r m a k a larutan s e l t e r s e b u t d i s a r i n g dengan saringan k a s a ( s t e r i l ) , kemudian d i s e n t r i f u s k e m b a l i . E n d a p a n s e l tersebut dilarutkan dalam m e d i a penumbuh, s e l a n j u t n y a dihitung jumlahnya. S e l yang d i d a p a t 2 x
lo5
s e l p e r ml m e d i a penumbub(DMEM,
NaH2C03 7,3%, tryptoee phosphatb r o t h , 5% CS, p e n i s i l i n 10.000 pl/ml, streptomisin 10.000 pg/ml d a n fungizon 100 pglml). Kemudian s e l t e r s e b u t d i b i a k k a n dalam microplate 96 sumur (lubang) d a n inkubaeikan d a l a m inkubator
p a d a suhu 37°C dengan C 0 2 5% selama 24 jam. Sel siap dipakai
24-48 jam atau setelah membentuk sel selapis penuh, dan sel langsung digunakan untuk uji netralisasi serum atau titrasi virus.
Virus ( I B D ) . Virus IBD d i i s o l a s i d a r i beberapa tempat di p u l a u Jawa. Medan, Lampung
.
Bali dan Maros. V i r w diisolasi dari bursa Fabricius ayam penderita IBD. Dan bursa yang terinfekoi tersebut dibuat suspenei 20% dengan larutan PBS steril yang mengandung antibiotik (penisilin 200 IU, streptomisin 200 pg, kanamisin 200 p g dan fungizon 100 pg masing-masing per ml), kemudian disentrifus 1.500-2.000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh ditambah dengan serum ayam terhadap ND (serum kebal) yang mengandung titer HI 2'' per rnl sebanyak 20% (vlv), dibiarkan p a d asuhu kamar atau di dalam penangas a i r p a d a suhu 37OC selama 10-15 menit untuk mengadakan proses netralisasi antara virus N.D. dan serum kebalnya, b i l a dalam supernatan bursa diduga terdapat virus ND. Selanjutnya suspensi tersebut disaring dengan f i l t e r ukuran 0.22 pm ( M i l l i p o r e ) disuntikkan ke dalam kantung kuning telur embrio
ayam S P F umur 5-6 hari. ke dalam ruang alantoik embrio ayam SPF' yang berumur 9 hari, membran khorio-alantoik ayam S P F umur 1 1 hari dan diinkubasikan dalam inkubator p a d a suhu 37OC selama 5 hari. Virus dipanen dengan mengumpulkan selaput kantung kuning telur, cairan alantoik dan membran khorio-alantoik. Selaput kantung kuning telur dan membran khorio-alantoik digerus dan dibuat suspensi 20% dalam larutan Hanks steril atau PBS steril. Kemudian disentrifus 1.500 rpm selama 10-15 menit, supernatannya merupakan suspensi yang mengandung virus IBD. Suspensi tersebut kemudian digunakan untuk mengidentifikaai virus dengan uji presipitasi agar gel. Di samping itu suepensi yang berasal dari bursa juga
diinfeksikan kepada ayam SPF umur 3 minggu melalui tetes mata d m per o r a l dengan doria f 1 ml. Ayam itu eetiap hari diamati untuk melihat tanda klinik terutama 2-6 hari setelah infeksi. Selanjutnya prosedur diatas diikuti identifikasi virus dengan c a r a pemeriksaan patologianatomik, pemeriksaan hietopatologik serta uji nrtralisasi.
Sebagian suspensi bursa juga dinokufasikan pada lapisan biakan s e l fibroblas embrio ayam (CEP). Biakan tersebut diinkubaeikan dalam inkubator yang mempunyai suhu 37°C dengan
5% C 0 2 . Pengamatan dilakukan setiap hari dengan harapan akan
timbul perubahan sel berupa degenerasi dari sel akibat perusakan sel oleh virus. Kelainan sel tersebut dinamakan efek sitopatik
(cytopathic effect), sedang virus yang menimbulkannya dieebut v i r u s yang sitopatogenik. Efek sitopatik dapat dilihat di bawah
inverted microscope. Dalam usaha untuk mengisolasi virus efek sitopatik terdapat indikasi bahwa bahan tersebut mengandung virus. Akan tetapi lintasan atau pasasi pertama pada biakan s e l fibroblas belum terbentuk efek sitopatik yang diharapkan maka lintasan pada biakan CEF dilakukan berulang-ulang berkisar 1-5 kali sampai terlihat efek sitopatiknya.
C a r s membuat lintasan biakan virus adalah sebagai berikut: cairan dan sel biakan virus tersebut dipanen dan disentrifus p a d s 1.500-2.000 rpm selama 15 menit. Endapan yang terbentuk dilarutkan ke dalam larutan media penumbuh dan diinfeksikan kembali pada biakan jaringan
CEF,
diulangi perlakuan tersebut sampai mendapatkan bentuk CPE. Mulai p a d a lintasan ketiga j e l a s terlihat s e l yang rusak akibat infeksi virus dengan membentuk bercak (plaque), eebagian sel yang rusak terlepas dan meninggalkan suatu bercak yang makin lama makin meluas karena makin banyak sel yang dirusak. Biasanya pada hari ke 5 sampai hari ke 7 eel-re1 seluruhnya telah rusak.Dengan cara tersebut telah berhasil dikumpulkan lebih dari 30
isolat virus IBD dan yang akao digunakan seterusnya pada penelitian adalah 24 isolat virus IBD, di samping itu juga galur Lukert yang telah dibakukan diikut sertakao dalam penelitian sebagai standar.
,
3.2.2. Pembnatan d a n pemnrnlan antlgen. Pembuatan dan pemurnian antigen mengikuti metode yang dilaporkan oleh Jackwood e t a l .
(1987). Secara singkat dapat dijelaskan bahwa isolat virus yang akan dimurnikan ditumbuhkan dalam biakan CEF. Dengan metode plaque puriflcatfon virus diisotasi dari bentuk plaque yang sama ukurannya
sehingga dapat dibatasi kontaminannya.
Cara kloning: surpensi yang ternyata sudah positif mengandung virus Ciumboro (pada lintasan keempat atau kelima) dibuat pengenceran 10-I sampai lo-*, diinfeksikan 25 p l p e r sumur (yang menggunakan mikroplat 96 sumur) pada biakan s e l selapis fibroblas embrio ayam dan diinkubasikan dalam inkubator 37OC dengan C 0 2
5% selama 3-5 hari. Pada biakan tersebut apabila terlihat efek sitopatiknya, maka 0,l ml cairan dan sel yang mengandung CPE
.
dikumpulkan dan dilarutkan dalam 1 ml larutan PBS steril, setelah itu disentrifus pada 2.000 rpm selama 20 menit. Kemudian endapan yang terbentuk dilarutkan dalam PBS steril dan diinfeksikan p a d a mikroplat 6 sumur (Nunc Ltd) yang berisi lapisan biakan sel fibroblas embrio ayam (CEF) yang telah sempurna. Biakan CEFtersebut diinkubasikan dalam inkubator bersuhu 37OC selama 30-60
menit untuk memberi kenempatan penyerapan virus ke dalam sel, setelah itu diberi media agar 1% (agar Nobel 296, media penumbuh DMEM 2x dan calf serum (CS) 5%) rebagai pelapis penutup. Sel tersebut diinkubasikan dalam inkubator 37OC dengan 5% C 0 2 , dan
diamati tiap hari. Dua hari kemudian ditambah dengan agar 1% yang mengandung indikator 0.02% neutral red.
S e l tersebut diinkubasikan p a d a inkubator ruhu 37OC dengan 5% C 0 2 , dan diamati setiap hari sampai terbentuk CPE yang sama ukurannya. CPE yang terbentuk dipanen satu p e r satu dap dilarutkan dalam 1 ml media penumbuh s t e r i l
(DMEM
+
5% calf serum = CS), dan proses kloning tersebut d i atae diulang untuk mendapatkan klon yang sama ukurannya (murni). Klon yang dihasilkan tersebut diperbanyak dengan c a r a ditumbuhkan pada biakan s e l CEF. Virus yang dihasilkan disimpan dalam suhu -20°C sebagai stok virus.3.2.3. T i t r a s i v i r u s p a d a b i a k a n s e l fibroblas embrio a y a m
.
Titrasi v i r u ~ bertujuan untuk mengetahui konsentrasi virus yang ada dalam suspensi guna menetapkan d o s i s virus yang dapat menginfeksi sebanyak 50% media percobaan (dalam ha1 ini digunakan biakan sel fibroblas embrio ayam.
Cara krrja:: mula-mula dibuat pengenceran desimal dari setiap isolat virus lapang yang telah murni dan masing-masing pengenceran v i r u s tersebut (10" sampai 1 0 ~ ' ~ ) diinfeksikan pada biakan sel s e l a p i s fibroblas embrio ayam yang sudah ditanam pada microplate (96 sumur). Untuk setiap pengenceran isolat virus aoal lapang murni diinfeksikan masing-masing 25 pl pada 5 sumur dalam microplate. Kemudian biakan tersebut diinkubasikan pada inkubatar suhu 37"C, 5% COz.
Diamati selama 3-5 hari eampai terbentuknya efek sitopatik. Hasil titraai virus atau titer dosis infektif 5 0 (IDso) juga diperhitungkan
p e r ml dan dihitung dengan metode Reed dan Muench (Cessi dan Nardelli, 1976; Bayyari et al., 1991).
3.2.4. P e m b n a t a n a n t l s e r n m t e r h a d a p v l r u s IBD ( s e r a hlpcrlmnn). Tufuan: untuk mendapatkan serum yang mengandung antibodi terhadap virus IBD lapang yang telah murni.
Vlrns IBD yang dlgunakan: a d a l a h virus lapang yang telab dimurnikan dan eebagai virus kontrol (standar) adalah virus Lukert. Virus diinokulasikan kepada kelinci putih (New ~ e ; l a n d white) dengan berat badan f 1 kg. C a r a pembuatannya mengikuti c a r a yang digunakan Jackwood e l al. (1982b).
Setiap isolat virus titernya ditetapkan sehingga t i a p ml mengandung l o 4 sampai l o 6 TCIDso. Suspenei virus tereebut
dicampur dengan larutan Freund's a d j u v a n t komplit dengan volume sama banyak.
Kelinci yang telah dipersiapkan, diinfeksi e e c a r a intramuskuler dengan suspensi virus di atas p a d a otot p a h a dan diikuti dengan penyuntikan di bawah kulit atau subkutan masing-masing menggunakan d o s i s lo4 sampai l o 6 TCIDSO. Selanjutnya, kelinci disuntik ulang 2x ( b o o s t e r ) dengan suspensi virus d i a t a s selang 2 minggu. S e r a dipanen 4 minggu setelah penyuntikan terakhir dan s e r a d a r i kelinci d i u j i terhadap galur Lukert, yang merupakan virus standar.
3.2.5. U j l n e t r a l l s a s l s e r a m (N.S.) sllang. Uji ini dilakukan berdasarkan metode
fl
dengan menggunakan m i c r o p l a t e (96 sumur) yaitu dengan menggunakan pengenceran serum dengan konsentrasi virus konstan. Pengenceran serum dilakukan d u a ( 2 ) kali sedangkan konsentrasi virus konstan atau tetap yaitu 100 TCIDSo per 25 ~ 1 .r u j u a n u j i nrtrallsasi sllang: untuk menentukan titer antibodi terhadap virus IBD homolog maupun heterolog. Dan dalam
percobaan ini digunakan virus IBD Lukert sebagai standar (standar).
Titer serum dihitung berdasarkan pengenceran terakhir serum yang masih dapat menetralkan 100 TCID5,, virus IBD.
Cora: seluruh sumur pada mlcroplate (96 sumur) diisi dengan
,
25 p l larutan
DMEM
steril. Pada sumur pertama diberikan 25 p l serum dan dikocok sehingga homogen kemudian pindahkan 2 5 p1p a d a sumur kedua yang artinya larutan serum tersebut diencerkan s e c a r a kelipatan 2x sampai sumur ke 10. Setelah itu sumur pertama sampai kesepuluh diisi dengan 25 p l virus (100 TCIDSo), sedangkan
sumur ke 1 1 d i i s i dengan 25 p1 virus IBD Lukert (100 TCIDSO)
aebagai kontrol positif, dan sumur keduabelas hanya berisi larutan serum sebagai kontrol negatif. Kemudian diinkubasikan ke dalam inkubator pada suhu 37OC, 5% C 0 2 selama 30 menit. Selanjutnya
seluruh sumur diberi 100 p1 suspensi biakan CEF yang mengandung 2 x 10' sel p e r ml. Diinkubasikan kembali dalam inkubator dan diamati setiap hari sampai terjadi perubahan dengan terbentuknya CPE, dibandingkan dengan kontrol p o s i t i f yang terdiri dari biakan sel dan virus Lukert eedang dan kontrol negatif terdiri dari serum normal dan biakan sel (Jackwood et a l . , 1982a).
Pengerjaan ini dilakukm hanya terhadap 24 isolat virus pilihan yang dinetralisasi silang dengan masing-masing serum kebal kelinci yang mengandung antibodi terhadap 24 isolat virus. Setiap uji diulang sebanyak 4 kali. Perhitungan indeks netralisasi serum berdasarkan metode Reed and Muench (1950) (Cessi dan Nardelli, 1976; Bayyari et al.. 1991).
3.3. Penelitian Eksperimental
3.3.1. Pcrcobasn 1: Pcncntman kctcrkaltan sntlgen. Antiserum yang mengandung 2 0 unit antibodi terhadap eatu serotipe IBD tidak mampu menetralkan 100 TCIDSo dari serotipe lain (KBpikian e t ol.,
1967), sedangkan apabila virus tereebut homolog dengan antibodinya rnaka satu unit antibodi adalah titer antiserum terendah yang mampu menetralkan 100 TCIDSo virus.
C a r a yang dilakukan pada percobaan ini adalah uji netralisasi antara ieolat setiap virus IBD anal lapang yang telah dipilih sebanyak 24 dan 1 isolat virue galur Lukert sebagai standar, terhadap masing-masiog antiseranya akan didapatkan nilai indeks netralisasi dari masing-masing uji pada biakan jaringan (CEF). Kemudian berdasarkan rumus Archetti dan Horefall didapatkan nilai
R
yang akan digunakan dalam analieis penentuan keterkaitaa antigen.Rnmns Arch e t t i dun Horsfall:
r, adalah haeil bagi titer heterolog dengan virus 2, oleh titer homolog yang diperoleh dengan v i n e 1, eedangkan rz merupakan
hauil bagi titer heterolog dengan virus 1, oleh titer homolog yang diperoleh dengan virus 2.
R mencerminkan antigenic relatedness di antara kedua virus
baik virus maupun antibodinya digunakan pada uji netralisasi silang. N i l a i R ditetapkan dengan menghitung titer rataan s e c a r a geometri dari minimal 4 kali pengujian NS.
3.3.2. P e r c o b a a n 2. Ujl imnnfsasI paslf sllang.
Uji ini dimaksud untuk mengetahui reaksi silang antibodi yang dihasilkan oleh uatu virus terhadap virus lain.
Melalui penelitian mengenai keterkaitan antigen antar virus dapat diindentifikasi varian atau subtipe yang didapat d a r i ,ke 24 isolat virus itu
.
Dari ke 24 isolat virus IBD a s a l .lapang dapat ditetapken virus terpilih p a d a percobaan 1. Selanjutnya antiserum yang mengandung antibodi terhadap virus varian dari percobaan 1digunakan p a d a percobaan pengebalan ayam petelur jantan melalui suatu c a r a imunisasi p a s i f yaitu dengan pemberian serum kebal.
Untuk pengujian ini diperlukan jumlah masing-masing antiserum. yang cukup banyak oleh karena itu dilakukan pembuatan antiserum tersebut pada kelinci melalui penyuntikan dengan masing-masing isolat virus IBD asal lapang terpilih (dari percobaan 1). Serum kelinci yang mengandung antibodi isolat virus IBD a s a l lapang (percobaan
I),
kemudian ditetapkan titer antibodinya p a d a biakanCEF. T i t e r Ab yang didapat adalah >5.120 (Jackwood e t al., 1982b).
Pelaksanaan imunisari pasif silang. Sebelum melaksanakan, imunisasi silang perlu diketahui tertebih dahulu titer antibodi asal induk (AAI) p a d a ayam yang digunakan untuk percobaan ini. Oleh karena itu dilakukan pengambilan serum pada 10 ekor ayam percobaan umur 1 hari (DOC), ternyata dari haeil uji uetralisasi serum p a d a biakan jaringan cukup tinggi yaitu > 512 maka pengambilan serum diulang saat ayam berumur 14 dan 21 hari untuk mengetahui titer antibodi a s a l induk terhadap Gumboro seperti yang diinginkan yaitu < 500
.
Ayam percobaan yang digunakan 100 ekor, dibagi menjadi 5 kelompok. Empat kelompok A, B, C, D dan kelompok E untuk
kontrol tidak mendapat perlakuan, yang masing-masing terdiri dari 20 e k o r ayam percobaan. Kemudian setiap kelompok dibagi menjadi 4 subkelompok (A. B, C dan D) yang terdiri dari 5 ekor ayam. Masing-masing antiserum disuntikkan kepada 4 subkelompok ayam umur 3 minggu masing-masing 5 ekor ayam setiap subkelompok dengan demikian a d a 4 x 4 = 16 subkelompok ayam pbrcobaan. Di
samping 4 subkelompok ayam yang tidak dikebalkan, diperlakukan aebagai kontrol.
Pemberian serum kebal tersebut dilakukan p a d a saat diketahui titer antibodi asal induk < 500. Serum kebal tersebut mengandung titer antibodi terhadap virus yang homolog minimal 5.120 per ml dan diaplikasikan s e c a r a intraperitoneal (Wood et al., 1988 dan Fahey e t a l . . 1991a).
P a d a hari ke 5 setelah imunisasi, setiap kelompok (A. B. C, dan D ) ditantang dengan masing-masing isolat virus IBD asal lapang terpilih (percobaan 1) termasuk kelompok E (kontrol). Dosis virus tantang pdalah 0,s ml yang mengandung 1 0 ~ ' ~ TCIDSO setiap ekor, diberikan melalui mulut. Ayam percobaan diamati mulai hari ke 2-5 p a s c a inokulasi terhadap gejala klinik, kesakitan/kematian dan perubahan pasca mati yang terbentuk p a d a otot dada, otot paha bagian dalam dan pada organ bursa Fabricius. Lima hari pascainfeksi, darah ayam diambil dari ayam yang masih hidup baik ayam aehat maupun sakit. Penghitungan titer serum dilakukan menurut Reed and Muench. Sebagai kontrol digunakan virus Lukert. Seluruh kelompok ayam mendapat vaksinasi terhadap ND sesuai dengan program baku.
3.3.3. P e r c o b a a n 3. Uj1 netrallsasf sllang l s o l a t Iapang terplllh t e r h a d a p a n t i s e r a vaksin a k t i f Gumboro a s a l impor y a n g dlgmnnkan d l p e t e r n a k a n d l Indonssla.
Dalam periode tahun 1990-1991 penyakit Gumboro mewabah hampir di seluruh dunia, termasuk di Indonesia. Masalah yang dihadapi d i Indonesia adalah bahwa vaksin terhadap Pumboro ini sudah diimpor baik dari Eropa maupun A m e ~ i k a . Akan tetapi semua vaksin yang a d a ternyata belum mampu secara tuntas mencegah timbulnya penyakit Gumboro. Dengan demikian masih banyak yang harus diperhatikan berkaitan dengan c a r a pengendalian penyakit Gumboro, antara lain diduga adanya perbedaan virus vaksin dengan virus asal lapang.
P a d a uji coba ini dilakukan uji netralisasi serum silang antara serum kebal dari keempat virus vaksin komersial terhadap isolat virus IBD asal lapang k-5. 11.13 dan 19. Serum kebal tersebut dihasilkan dari kelinci yang disuntik dengan keempat virus vaksin asal impor (komersial). Uji ini dilakukan dalam s k a l a laboratorium p a d a biakan CEF yang menggunakan microplate.
Tujuan : untuk mengetahui apakah a d a kesamaan sifat serologik antara galur virus vaksin asal impor dan galur virus isolat IBD asal lapang. Atan dapat dikatakan untuk mengetahui kemampuan vaksin impor dalam mencegah infeksi virus IBD asal lapang.
P a d a percobaan ini digunakan 4 jenis vaksin asal impor yang digunakan pada peternakan ayam baik peternakan ayam skala besar maupun kecil di Indonesia.
Tltrasi virus vaksln. Keempat jenis vaksin aktif yang digunakan pada percobaan dengan kode A, B, C dan Lukert (D) yang sebelumnya telah diadaptasikan pada biakan CEF serta ditetapkan titer virusnya.
Pembuatan serum t c b a l . P a d a pembuatan serum kebal telah digunakan 4 ekor kelinci dan 1 ekor kelinci untuk eerum normal. Kemudian 1 dosis vaksin masing-masing disuntikkan p a d a kelinci d e w a s a s e c a r a intramustuler dan 2 minggu kemudian diruntikkan s e c a r a intraperitoneal setelah terlebih dahulu dicampur dengan larutan Freund's adjuvant komplit. Pengulangan v a k s i n a ~ i (booster) dilakukan lx dengan selang waktu 2 minsgu. P a d a hari ke 15 setelah penyuntikan terakhir kelinci diambil darahnya. Untuk mengetahui titer antibodi yang didapat dilakukan uji netralisasi serum pada biakan jaringan fibroblas embrio ayam SPF. Kelinci diambil serumnya sebanyak mungkin, disentrifus 1.500 rpm selama 10 menit dan supernatannya yang mengandung serum kebal diinaktivasikan dalam penangas a i r (waterbath) p a d a suhu 5b°C selama 30 menit (Jackwood e t al., 1982b).
U j f netraltsasi serum. Selanjutnya dilakukan uji netralisasi serum silang p a d a biakan sel fibroblas embrio ayam SPF terhadap isolat virus lapang yang terpilih (percobaan 1 ) . Uji netralisasi dilaksanakan p a d a biakan CEF (microplate). Keempat serum kebal yang dihasilkan hewan percobaan kelinci putih masing-masing direaksikan secara silang dengan isolat virus IBD asal lapang terpilih (isolat virus varian).
Uji netralisasi serum silang ini dilakukan berdasarkan metode
3
yaitu serum diencerkan dengan kelipatan 2x dan dinetralkan dengan100 TCID50 masing-masing isolat virus varian, dengan ulangan 4x.
Cora: serum diencerkan dengan larutan DMEM s e c a r a seri, kemudian ditambahkan 100 TCIDSO isolat virus varian sama
volumenya dan diinkubasikan dalam inkubator suhu 37°C. 5Yo C 0 2
selama 30 menit, kemudian ditambahkan 100 p1 suspenai biakan sel fibroblas embrio ayam yang mengandung 2 x
lo5
eel per ml.Selanjutnya diinkubasikan kembali dalam inkubator lagi dan diamati retiap hari untuk melihat terbentuknya CPE pada b i a k m tersebut. Biasanya pada hari ke 2, titer serum sudah dapat dilihat yaitu nilai k e b a l i k m dari pengenceran tertinggi y m g secara sempurna menghambat terjadinya CPE (Jackwood e t
