1 1 SKRIPSI SKRIPSI Oleh : Oleh :
ARA MIKO JAYA ARA MIKO JAYA
NIM : 04530001 NIM : 04530001
JURUSAN KIMIA JURUSAN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) MAULANA MALIK IBRAHIM UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) MAULANA MALIK IBRAHIM
MALANG MALANG
2010 2010
ISOLASI DAN UJI EFEKTIVITAS ANTIBAKTERI SENYAWA SAPONIN ISOLASI DAN UJI EFEKTIVITAS ANTIBAKTERI SENYAWA SAPONIN
DARI AKAR PUTRI MALU (
DARI AKAR PUTRI MALU ( Mimosa pu Mimosa pudicadica))
SKRIPSI SKRIPSI
Diajukan Kepada: Diajukan Kepada:
Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim Malang Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim Malang
Untuk Memenuhi Salah Satu Persyaratan Dalam Untuk Memenuhi Salah Satu Persyaratan Dalam
Memperoleh Gelar Sarjana Sains (S.Si) Memperoleh Gelar Sarjana Sains (S.Si)
Oleh: Oleh:
ARA MIKO JAYA ARA MIKO JAYA
NIM: 04530001 NIM: 04530001
JURUSAN KIMIA JURUSAN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) MAULANA MALIK IBRAHIM UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) MAULANA MALIK IBRAHIM
MALANG MALANG
2010 2010
ISOLASI DAN UJI EFEKTIVITAS ANTIBAKTERI SENYAWA SAPONIN ISOLASI DAN UJI EFEKTIVITAS ANTIBAKTERI SENYAWA SAPONIN
DARI AKAR PUTRI MALU (
DARI AKAR PUTRI MALU ( Mimosa pu Mimosa pudicadica))
SKRIPSI SKRIPSI
Diajukan Kepada: Diajukan Kepada:
Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim Malang Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim Malang
Untuk Memenuhi Salah Satu Persyaratan Dalam Untuk Memenuhi Salah Satu Persyaratan Dalam
Memperoleh Gelar Sarjana Sains (S.Si) Memperoleh Gelar Sarjana Sains (S.Si)
Oleh: Oleh:
ARA MIKO JAYA ARA MIKO JAYA
NIM: 04530001 NIM: 04530001
JURUSAN KIMIA JURUSAN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) MAULANA MALIK IBRAHIM UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) MAULANA MALIK IBRAHIM
MALANG MALANG
2010 2010
SURAT PERNYATAAN SURAT PERNYATAAN ORISINALITAS PENELITIAN ORISINALITAS PENELITIAN
Saya yang bertanda tangan di bawah ini Saya yang bertanda tangan di bawah ini :: Nama
Nama : : Ara Ara Miko Miko JayaJaya NIM
NIM : : 0453000104530001 Fakultas
Fakultas / / Jurusan Jurusan : : Sains Sains dan dan TeknologiTeknologi Judul
Judul Penelitian Penelitian : : ISOLASI ISOLASI DAN DAN UJI UJI EFEKTIVITAS EFEKTIVITAS ANTIBAKTERIANTIBAKTERI SENYAWA SAPONIN DARI AKAR PUTRI MALU SENYAWA SAPONIN DARI AKAR PUTRI MALU (( Mimosa pudica Mimosa pudica))
Menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa hasil penelitian saya ini Menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa hasil penelitian saya ini tidak terdapat unsur-unsur penjiplakan karya penelitian orang lain atau karya tidak terdapat unsur-unsur penjiplakan karya penelitian orang lain atau karya ilmiah yang pernah dilakukan atau dibuat oleh orang lain, kecuali yang secara ilmiah yang pernah dilakukan atau dibuat oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis dikutip dalam naskah dan disebutkan dalam sumber kutipan dan daftar tertulis dikutip dalam naskah dan disebutkan dalam sumber kutipan dan daftar pustaka.
pustaka.
Apabila ternyata hasil penelitan ini terbukti terdapat unsur-unsur Apabila ternyata hasil penelitan ini terbukti terdapat unsur-unsur jiplakan,
jiplakan, maka maka saya saya bersedia bersedia untuk untuk mempertanggumempertanggung ng jawabkan, jawabkan, serta serta diprosesdiproses sesuai peraturan yang berlaku.
sesuai peraturan yang berlaku.
Malang, 3 Agustus 2010 Malang, 3 Agustus 2010 Yang Membuat Pernyataan, Yang Membuat Pernyataan,
Ara Miko Jaya Ara Miko Jaya NIM. 04530001 NIM. 04530001
Lembar Persetujuan
ISOLASI DAN UJI EFEKTIVITAS ANTIBAKTERI
SENYAWA AMTIBAKTERI DARI AKAR PUTRI MALU ( Mimosa pudica)
SKRIPSI
Oleh :
ARA MIKO JAYA NIM. 04530001
Telah disetujui oleh:
Pembimbing I
Diana Candra Dewi, M. Si NIP. 197707202003122001 Konsultan Dr. Munirul Abidin, M. Ag NIP.197204202002120003 Malang, 19 April 2010 Mengetahui, Ketua Jurusan Kimia
Diana Candra Dewi, M. Si NIP. 197707202003122001
ISOLASI DAN UJI EFEKTIVITAS ANTIBAKTERI
SENYAWA SAPONIN DARI AKAR PUTRI MALU ( Mimosa pudica)
SKRIPSI
Oleh:
ARA MIKO JAYA NIM. 04530001
Telah Dipertahankan di Depan Dewan Penguji Skripsi dan Dinyatakan Diterima Sebagai Salah Satu
Persyaratan untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains (S. Si)
Tanggal, 22 Juli 2010
Susunan Dewan Penguji : Tanda Tangan
1. Penguji Utama : Rini Nafsiati Astuti, M.Pd NIP. 197505312003122003
( ... )
2. Ketua Penguji : Elok Kamilah Hayati, M. Si NIP. 197906202006042002
( ... )
3. Sekr. Penguji : Diana Candra Dewi, M. Si NIP. 197707202003122001
( ... )
4. Anggota Penguji : Dr. Munirul Abidin, M.Ag NIP. 197204202002120003
( ... )
Mengetahui dan Mengesahkan Ketua Jurusan Kimia Fakultas Sains Dan Teknologi
Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim Malang
Diana Candra Dewi, M.Si. NIP. 197707202003122001
Ç
MOTTO
Dialah Allah Yang Menciptakan, Yang Mengadakan, Yang
Membentuk Rupa, Yang Mempunyai Asmaaul Husna. Bertasbih
kepadaNya apa yang di langit dan bumi. Dan Dialah Yang Maha
ABSTRAK
Ara Miko jaya, 2010, Isolasi dan Uji Efektivitas Antibakteri Senyawa Saponin dari Akar Putri Malu (Mimosa pudica), Pembimbing I: Diana Candra Dewi, M.Si, Pembimbing II: Dr. Munirul Abidin, M.Ag., Kata Kunci : Akar putri malu, antibakteri, S. aureus, E. coli, KLT preparatif dan
KLT Analitik .
Akar putri malu mengandung golongan senyawa alkaloid, flavonoid dan terpenoid. Golongan senyawa-senyawa ini sering dipergunakan sebagai bahan dasar obat moderen. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efektivitas ekstrak kasar senyawa saponin dari akar putri malu dalam menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus dan E. coli, mengetahui eluen yang terbaik untuk pemisahan ekstrak kasar saponin dari akar putri malu menggunakan KLT analitik, mengetahui aktivitas isolat saponin hasil KLT preparatif dalam menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus dan E. coli.
Pada penelitian ini ekstraksi senyawa aktif dalam akar putri malu dilakukan dengan metode maserasi dengan pelarut methanol 90 %. Pemisahan senyawa aktif dilakukan dengan metode KLT. Eluen yang digunakan adalah klorofom;metanol;air dengan variasi konsentrasi (13:4:1), (65;50:10), (20:60:4), (20:60:10). Uji antibakteri dilakukan dengan metode difusi cakram terhadap bakteri S. aureus dan E. coli. Identifikasi senyawa saponin triterpenoid menggunakan uji busa dan uji warna Liebermann-Burchard (LB).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak akar putri malu berpotensi sebagai antibakteri karena ekstrak kasar akar putri malu mampu menghambat pertumbuhan bakteri E. coli dan S. aureus. Pada konsentrasi optimum 200 ppm zona hambat yang dihasilkan adalah 24,6 mm untuk S.aureus dan 19,1 mm untuk E. coli. Eluen terbaik untuk memisahkan saponin triterpenoid pada ekstrak akar putri malu adalah klorofom;metanol;air dengan konsentrasi (20:60:4) dengan 3 noda yang terlihat terpisah yaitu pada Rf berturut-turut 0,125; 0,75 ; 0,812.
Mekanisme kerja ekstrak akar putri malu sebagai antibakteri adalah sinergis Hal ini terlihat dari zona hambat, untuk E. coli isoat I = 5,32 mm dan isolat II =2,20 mm, untuk S. aureus isolat I = 1,32 mm dan isolat II = 0,38 mm, sedangkan pada isolat III tidak efektif sebagai anti bakteri.
ABSTRACK
Ara Miko Jaya, 2010. Isolation and Antibacterial Efectivity of Saponin Compound of Putri Malu ( Mimosa pudica) Root. The first andvisor: Diana Candra Dewi, M.Si, second advisor : Dr. Munirul Abidin, M.Ag.
Key words : Putri malu root, antibactrial, S. aureus, E. coli, TLC.
Putri malu root has apart of alkaloid, flavonoid and terpenoid. This compounds are oftebly used moderen medicine. The aim of this research is know the efectivity of saponin compound from putri malu root to inhibit development bacteria S. aureus and E. Coli, to know the best eluen to separate saponin crude ekstract from putri malu root used analytic TLC, and to know the resih of efectivity preparatife isolate saponin TLC to inhibit bacteria S. aureus and E. coli development.
In this research the active compound ekstract from putri malu root using maserasi methode with metanol 90 %. The methode used in separation of active compoune is TLC methode. The eluen which is used klorofom ; methanol ; water with variation of consentration (13:4:1), (65;50:10), (20:60:4), (20:60:10). The method that used in antibacteria test is disk diffusion to S. aureus and E. coli bacteria. The identify ecation of triterpenoid saponin compound is using foam and liberman-burchard (LB) test.
The result of this research shown that the ekstract of putri malu root are potential as antibacteria. The ekstract of putri malu root can inhibit the growth of S. aureus and E. coli bacteria. In optimum consentration 200 ppm the result of inhibition zone is 24,6 mm for S. aureus and 19,1 mm to E. Coli. The best eluen for triterpenoid saponin from putri malu root is klorofom;methanol;water in (20:60:4) consentration that stain three appear srad with Rf 0,812;0,75;0,125. The
antibacteria inhibition mekanism of putri malu root are synergy. It is appear from inhibition zone, E. Coli isolate I =1,32 mm and isolate II = 0,38 mm, in other hand isolate III is not effective as antibacterial
KATA PENGANTAR
Puji syukur ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat, hidayah, dan kemudahan yang selalu diberikan kepada penulis, sehingga skripsi ini dengan judul “Isolasi dan Uji Efektivitas Antibakteri Senyawa Saponin Dari Akar Putri Malu ( Mimosa Pudica)” dapat diselesaikan sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Sains.
Shalawat dan salam semoga selalau tercurahkan kepada manusia pilihan, dan panutan yang baik dalam segala hal dalam menjalani kehidupan yaitu Nabi kita Muhammad SAW, yang telah membimbing kita menuju sebuah cahaya kebenaran yakni agama Islam serta yang kita harapkan syafa’atnya di hari akhir nanti. Amin.
Penulis mengucapkan terima kasih yang tak terhingga kepada semua pihak yang telah membantu dalam menyelesaikan penulisan skripsi ini, terutama kepada:
1. Prof. Dr. H. Imam Suprayogo selaku Rektor UIN Malang beserta stafnya, terima kasih atas fasilitas yang diberikan selama kuliah di UIN Malang.
2. Prof. Drs. Sutiman Bambang Sumitro, S.U., D.Sc., selaku Dekan Fakultas Sains dan Teknologi UIN Malang.
3. Diana Candra Dewi, M.Si., selaku Ketua Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang dan
dosen pembimbing metpen serta dosen pembimbing utama yang telah banyak memberikan bimbingan dan arahan dalam penyusunan skripsi ini.
4. Dr. Munirul Abidin, M.Ag., selaku pembimbing integrasi sains dan Islam yang telah banyak memberikan bimbingan dan arahan dalam penyusunan skripsi ini.
5. Rini Nafsiati, M.Pd, dan Elok Kamilah Hayati, M.Si., selaku penguji yang banyak memberikan masukan demi sempurnanya isi skripsi ini.
6. Bapak dan Ibu Dosen Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Teknologi yang telah banyak mengamalkan ilmunya.
7. Semua pihak yang telah banyak membantu penulis demi terselesainya skripsi ini.
Akhir kata dengan jujur penulis mengakui bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu saran dan kritik yang bersifat membangun sangat penulis harapkan demi lebih sempurnanya skripsi ini. Penulis berharap semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi penulis pada khususnya dan pembaca pada umumnya dan semoga penulisan skripsi ini mendapatkan ridho dari Allah SWT. Amiin.
Malang, 2 Agustus 2010
DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL HALAMAN PERSETUJUAN HALAMAN PENGESAHAN HALAMAN MOTTO KATA PENGANTAR ... i DAFTAR ISI ... iv DAFTAR TABEL ... vi
DAFTAR GAMBAR ... vii
ABSTRAK ... viii BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ... 1 1.2 Rumusan Masalah ... 4 1.3 Tujuan Penelitan ... 5 1.4 Batasan Masalah ... 5 1.5 Manfaat Penelitian ... 6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Putri Malu ... 7
2.2 Terpenoid... 9
2.3 Saponin ... 11
2.4 Tinjauan Umum Staphylococcus aureus dan Escherichia coli... 14
2.4.1Bakteri Staphylococcus aureus ... 14
2.4.2Bakteri Escherichia coli ... 16
2.5 Ekstraksi Saponin dengan Metode Maserasi ... 17
2.6 Isolasi Saponin dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ... ... 19
2.7 Uji Efektifitas Saponin sebagai Antibakteri ... 22
2.8 Tumbuhan Obat dalam Pandangan Islam ... 24
BAB III METODOLOGI 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ... 30
3.2 Alat dan Bahan Penelitian ... 30
3.2.1 Alat Penelitian ... 30 3.2.2 Bahan Penelitian ... 30 3.3 Rancangan Penelitian ... 31 3.4 Metode Penelitian ... 31 3.4.1 Preparasi Sampel ... 31 3.4.2 Uji Pendahuluan ... 32 3.4.2.1 Uji Busa ... 32
3.4.2.2 Uji Warna Liebermann- burchard (LB) ... 32
3.4.3 Ekstraksi Saponin ... 32
3.4.4 Uji Efektivitas Antibakteri ... 33
3.4.4.2
.
Pembuatan Media ... 333.4.4.3
.
Peremajaan Biakan Murni S. aureus dan E. coli ... 343.4.4.4
.
Pembuatan Larutan Bakteri S. aureus dan E. coli ... 343.4.4.5
.
Uji Aktifitas Antibakteri ... 343.4.5 Pemisahan Senyawa Isolat dengan KLT ... 35
3.4.6.1 KLT Analitik ... 35
3.4.6.2 KLT Preparatif ... 35
3.4.6 Uji Antibakteri Senyawa Saponin Hasil Isolasi KLT ... 36
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Preparasi Sampel... 37
4.2 Uji Prndahuluan ... 38
4.2.1 Uji Busa ... 38
4.2.2 Uji Warna Liebermann-burchard (LB) ... 39
4.3 Ekstraksi Saponin ... 39
4.4 Uji Efektivitas Antimikroba Terhadap Bakteri E. coli dan S. aureus... 41
4.5 KLT (kromatografi Lapis Tipis) ... 45
4.5.1 KLT Analitik ... 45
4.5.2 KLT Preparatif ... 47
4.6 Uji Efektivitas Antimikroba Terhadap Bakteri E. coli dan S. aureus... 49
4.7 Mekanisme Kerja Saponin Terhadap Pertumbuhan Bakteri ... 50
4.8 Perspetif Islam Terhadap Tumbuhan Putri Malu... 51
BAB V PENUTUP 5.1 Kesimpulan ... 54
5.2 Saran... 54
DAFTAR PUSTAKA ... 55
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1 Perbedaan Relatif Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif ... 17
Tabel 2.2 Ukuran Daerah dan Interpretasi untuk Kemoterapeutik ... 25
Tabel 4.1 Zona Hambat Kontrol Positif dan Kontrol Negatif ... 44
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1. Tumbuhan Putri Malu (Mimosa pudica L.) ... 7
Gambar 2.2. Struktur Senyawa Terpenoid ... 10
Gambar 2.3. Struktur Saponin Steroid dan Saponin Triterpenoid ... 11
Gambar 2.4. Bakteri Staphylococcus aureus ... 14
Gambar 2.5. Bakteri Escherichia coli ... 16
Gambar 2.6. Struktur Saponin Triterpenoid Aralia elata ... 19
Gambar 2.7. Menunjukkan Lempengan Setalah Pelarut Bergerak Setengah dari Lempengan. ... 20
Gambar 2.8. Pengukuran pada Lempengan ... 21
Gambar 4.1. Grafik Hasil Uji Antibakteri Ekstrak terhadap S. aureus ... 43
Gambar 4.2. Grafik Hasil Uji Antibakteri Ekstrak terhadap E. coli ... 44
Gambar 4.3. Hasil KLT Analitik a, Tanpa Sinar; b, dengan sinar UV
λ
366 nm ; dengan sinar UVλ
254nm ... 48Gambar 4.4. Hasil KLT Preparatif ; a, Tanpa Sinar; b, dengan sinar UV
λ
366 nm ; dengan sinar UVλ
254nm... 48Gambar 4.5. Mekanisme Perusakan Senyawa Fospolifpi pada Membran Sel Bakteri ... 51
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Sebagai manusia yang dikaruniai akal, manusia diperintahkan untuk selalu berpikir dan mencari sesuatu yang belum kita ketahui manfaat dan bahayanya, baik itu benda mati maupun makhluk hidup seperti hewan dan tumbuhan. Allah SWT menciptakan semuanya supaya kita berpikir kepada-Nya, seperti yang dijelaskan di dalam firmanNya surat ar Rad (13) ayat 4:
’
ûu
Î
ρ
Ú
Ç
‘F
ö
{
$#
Ó
ì s Ü
Ï
%
N
Ô
≡
u ‘
θ≈
È
y f t G
•
Β
M
×
≈
¨
Ζ
_u
y
ρ
ô
Ïi
Β
=
5
≈
u
Ζ
ô
ãr &
×
í
‘y
ö
—u
ρ
×
≅Š
ƒ w
Υ
Ï
ρ
u
×
β
θ
#u
÷
Ζ
Ï
¹
ç
ö
x îu
ρ
5
β
θ
#u
Ζ
÷
Ï
¹ 4
’
+
s
ó
¡
„
ç
&
™
!$ y
ϑ
Î
/
7
‰
n
Ï
ρ
≡
u
ã
≅
Åe
Ò x
ç
ρ
Ρ
u
$ p
Õ
κ
|
÷
è t / 4
†
?
n
t ã
<
Ù
÷
è t /
’
û
Î
È
≅
à
2
W
{
$#
4 ¨
β
Î
)
’
û š
Î
Ï
9≡
s Œ
;
M
≈
ƒ
t
U
ψ
Θ
5
θ
ö
s
)
9
Ïj
š
χθ
è
=
É
)
÷
è t
ƒ
Artinya : ”Dan di bumi ini terdapat bagian-bagian yang berdampingan, dan kebun-kebun anggur, tumbuhan-tumbuhan dan pohon korma yang bercabang dan yang tidak bercabang, disirami dengan air yang sama. Kami melebihkan sebahagian tanam-tumbuhan itu atas sebahagian yang lain tentang rasanya. Sesungguhnya pada yang demikian itu terdapat tanda-tanda (kebesaran Allah) bagi kaum yang berfikir” (QS ar Rad (13) : 4)
Ayat di atas menyeru kita untuk berfikir bahwa semua yang ada di bumi diciptakan memiliki maksud dan tujuan. Seperti pada tumbuh-tumbuhan yang memiliki banyak senyawa-senyawa yang dapat dimanfaatkan manusia. Salah satu tumbuhan yang dapat dimanfaatkan oleh manusia adalah tumbuhan putri malu walaupun sebagian besar masyarakat belum tertarik dan mengetahui manfaat dan khasiat dari tumbuhan putri malu, padahal jika diteliti lebih dalam tumbuhan putri
malu dapat dimanfaatkan sebagai tumbuhan herbal yang bermanfaat bagi kesehatan.
Khasiat dari tumbuhan putri malu diantaranya adalah untuk obat antiinfeksi saluran pernapasan, herpes, infeksi kulit, diare, asma, pembengkakan karena luka bahkan insomania. Kurang pedulinya Masyarakat akan putri malu, mungkin disebabkan karena sampai sekarang, tumbuhan ini tumbuh liar dan memang, penggunaannya kurang populer. Padahal, karena tumbuh di berbagai tempat tumbuhan itu berarti memenuhi persyaratan untuk diteliti lebih intensif (Faridah, 2007).
Selama ini, penggunaan putri malu sebagai obat tradisional memang hanya berdasarkan pengalaman yang diwariskan secara turun temurun. Sehingga perlu dilakukan uji khasiat dan uji keamanan, untuk memberikan dukungan ilmiah pada pemakaiannya. Jika memang terbukti berkasiat, maka penemuan ini sangat bermanfaat, mengingat hingga saat ini jumlah Putri Malu di Indonesia relatif tinggi. Seluruh bagian tumbuhan Putri Malu dapat dimanfaatkan sebagai obat, yakni dari akar, batang daun hingga keseluruhan bagian tumbuhan, baik dalam keadaan segar atau kering (Faridah, 2007).
Akar Putri Malu diduga mengandung golongan senyawa alkaloid, flavonoid dan terpenoid. Golongan senyawa-senyawa ini sering dipergunakan sebagai bahan dasar obat-obatan antibakteri moderen. Sebagai contoh, senyawa terpenoid asetoksicavikol asetat, merupakan senyawa yang bersifat antitumor dari tumbuhan lengkuas. Senyawa artemisin bersifat antimalaria dari tumbuhan
Artemisia annua, Senyawa ini merupakan jenis seskuiterpen dari golongan terpenoid (Faridah, 2007).
Saponin adalah glikosida yaitu metabolit sekunder yang banyak t erdapat di alam, terdiri dari gugus gula yang berikatan dengan aglikon atau sapogenin. Larutan saponin yang sangat encer sangat beracun untuk ikan, tumbuhan yang mengandung saponin telah digunakan sebagai racun ikan selama beratus-ratus tahun (Robinson, 1995). Busa yang ditimbulkan saponin karena adanya kombinasi struktur senyawa penyusunnya yaitu rantai sapogenin nonpolar dan rantai samping polar yang larut dalam air. Saponin mempunyai rasa pahit, dapat mengadsorbsi Ca dan Si dan membawanya dalam saluran pencernaan. Sebagian besar berupa glikosida yang dapat mengikat satu (monodesmosida), dua (bidesmosida) atau tiga (tridesmosida) rantai glukosa dan aglikonnya yang mengikat gugus fungsi –OH, –COOH dan –CH.
Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa dari fraksi etil asetat herba Putri Malu ( M. pudica L). Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 70 % dan dilanjutkan fraksinasi menggunakan pelarut n-heksana dan etil asetat. Fraksi etil asetat dikromatografi kolom berulang dan dikromatografi lapis tipis preparatif, dengan fasa gerak n-heksana etil asetat dengan perbandingan yang bervariasi, hasil penapisan fitokimia dari fraksi etil asetat menunjukkan adanya senyawa golongan flavonoid, tanin, polifenol, monoterpenoid, seskuiterpenoid, steroid dan kuinon (Suwariany, 2006). Penelitian ini akan mengkaji tentang tumbuhan putri malu yang berpotensi sebagai tanaman obat melalui pendekatan uji antibakteri.
Salah satu cara untuk melemahkan bakteri adalah dengan pemberian senyawa antibakteri. Antibakteri adalah agen kimia yang mampu menginaktivasi bakteri. Inaktivasi bakteri dapat berupa penghambatan pertumbuhan bakteri (bakteriostatik) atau bahkan bersifat membunuh bakteri (bakterisid) (Brock, dkk., 1994). Uji antibakteri dapat dilakukan untuk mengetahui sejauh mana aktivitas suatu bakteri terhadap antibakteri. Menurut Brock and Madigan (1994) terdapat 3 metode yang umum digunakan dalam uji antibakteri, yaitu metode dilusi kaldu, metode dilusi agar, dan metode difusi cakram.
Bakteri E. coli dan S. aureus memiliki komposisi dinding sel yang berbeda. Dinding sel S. aureus yang merupakan kelompok bakteri gram positif memiliki struktur yang mempunyai banyak peptidoglikan dan relatif sedikit lipid sedangkan E. coli merupakan kelompok bakteri gram negatif yang relatif lebih banyak mengandung lipid (Hugo dan Russell, 1998). Menurut penelitian Faradisa (2008) bahwa ekstrak kasar senyawa saponin dari batang tumbuhan blimbing wuluh ( Aveehoa bilimbi) memiliki aktifitas antibakteri terhadap S. aureus dan bakteri E. coli.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas maka rumusan masalah yang dapat diambil adalah :
1. Bagaimana efektivitas ekstrak kasar senyawa saponin dari akar Putri Malu dalam menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus dan E. coli?
2. Eluen apakah yang terbaik untuk pemisahan ekstrak saponin dari akar putri malu menggunakan KLT analitik?
3. Bagaimana aktivitas isolat saponin hasil KLT preparatif dalam menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus dan E. coli?
1.3 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk :
1. Mengetahui efektivitas ekstrak kasar senyawa saponin dari akar putri malu dalam menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus dan E. coli.
2. Mengetahui eluen yang terbaik untuk pemisahan ekstrak kasar saponin dari akar putri malu menggunakan KLT analitik.
3. Mengetahui aktivitas isolat saponin hasil KLT preparatif dalam menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus dan E. coli.`
1.4 Batasan Masalah
Adapun batasan masalah pada penelitian ini adalah:
1. Tumbuhan yang digunakan adalah tumbuhan putri malu dari daerah sekitar hulu sungai Metro, Joyosuko Lowokwaru Malang.
2. Isolasi senyawa saponin dengan metode maserasi menggunakan pelarut metanol, dilanjutkan ekstrasi dietil eter dan n-Butanol kemudian dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
3. Uji efektivitas antibakteri pada senyawa hasil isolasi saponin menggunakan metode difusi cakram.
4. Eluen yang digunakan adalah klorofom;metanol;air dengan variasi kosentrasi (13:4:1), (65;50:10), (20:60:4), (20:60:10).
1.5 Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan :
1. Senyawa antibakteri yang didapat, diharapkan nantinya dikembangkan lebih lanjut sehingga bermanfaat untuk menanggulangi penyakit yang disebabkan oleh E. coli dan S. aureus.
2. Memberikan informasi kepada masyarakat umum tentang manfaat tumbuhan putri malu yang mempunyai potensi sebagai penghasil senyawa saponin, sehingga tumbuhan putri malu tidak dianggap hama bagi masyarakat umum.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Putri Malu
Gambar 2.1. Tumbuhan putri malu ( Mimosa pudica) (Jayani, 2007)
Taksonomi tumbuhan putri malu adalah sebagai berikut (Jayani,2007): Divisio : Spermatophyta Subdivisio : Angiospermae Classis : Dicotyledonae Ordo : Rosales Familia : Mimosaceae Genus : Mimosa Spesies : Mimosa pudica L.
Sifat dan kasiat putri malu yang selama ini telah digunakan adalah: Rasanya manis, agak dingin, astrigen. Herba putri malu berkhasiat sebagai penenang, peluruh dahak (ekspektoran), peluruh kencing (diuretik ), obat batuk (antitusif ), pereda demam (antipiretik ), dan antiradang. Akar dan biji putri malu dapat berkhasiat sebagai perangsang muntah (Jayani, 2007).
Putri malu memiliki nama latin Mimosa pudica, berasal dari benua Amerika yang beriklim tropis pada ketinggian 1-1200 m di atas permukaan laut.
Perkembangbiakannya sangat cepat, biasanya putri malu tumbuh merambat atau kadang berbentuk semak (tegak) atau setengah perdu dengan tinggi antara 0,3-1,5 m, batangnya bulat, berbulu dan berduri, daunnya kecil-kecil, berbentuk lancip, bunganya bertangkai dan berbentuk bulat seperti bola, serta berwarna merah muda. Putri malu tumbuh liar di pinggir jalan, tempat-tempat terbuka yang terkena sinar matahari (Faridah, 2007).
Putri malu berkhasiat untuk mengatasi penyakit malaria. Akar dan bijinya berkasiat untuk merangsang muntah. Para ahli pengobatan Cina dan penelitian AS serta Indonesia mengindikasikan, putri malu bisa dipakai untuk mengobati berbagai penyakit lain, seperti radang mata akut, kencing batu, panas tinggi pada anak-anak, cacingan, insomnia, peradangan saluran napas ( bronchitis), dan herpes (Siswono, 2005).
Englert dkk. dalam Planta Medica menyebutkan, tumbuhan putri malu mengandung senyawa yang sensitif, yakni momosine, sebuah asam amino hasil biosintetik turunan dari lysin. Senyawa itu bersifat racun bagi beberapa binatang seperti babi, kelinci, dan binatang memamah biak (Siswono, 2005).
Hasil eksperimen dengan menyuntikkan 10 % sari daunnya berpengaruh menurunkan tekanan darah pada anjing yang sekaligus sebagai penenang (sedatif), antiradang, tidak melekatnya pembuahan telur pada rahim (antiimplantasi), dan antiradang rematik. Hasil tes pada tikus memperlihatkan bertambahnya waktu tidur. Menurunkan kadar gula tikus-tikus dengan kadar gula tinggi (diabetes) setelah memberikan pakan dua jam dan jangka maksimum setelah enam jam menunjukkan gejala normal (Samiran,2006).
Menurut penelitian Suwariany (2006), untuk mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa dari fraksi etil asetat herba putri malu ( M. pudica L). Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 70 % dan dilanjutkan fraksinasi menggunakan pelarut n-heksana dan etil asetat. Fraksi etil asetat dikromatografi kolom berulang dan dikromatografi lapis tipis preparatif, dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat dengan perbandingan yang bervariasi, dilanjutkan dengan identifikasi spekrofotometer UV dan spektrofotometer IR. Hasil penapisan fitokimia dari fraksi etil asetat menunjukkan adanya senyawa golongan flavonoid, tanin, polifenol, monoterpenoid, seskuiterpenoid, steroid dan kuinon.
2.2. Terpenoid
Terpenoid atau isoprenoid merupakan salah satu senyawa organik yang banyak tersebar di alam, yang terbentuk dari satuan isoprene (CH3=C(CH3
)-CH=CH2). Senyawa terpenoid merupakan senyawa hidrokarbon yang dibedakan
berdasarkan jumlah satuan isoprena penyusunnya, kelompok metil dan atom oksigen yang diikatnya (Robinson, 1995). Berdasarkan jumlah satuan isoprena penyusunnya terpenoid dibagi menjadi beberapa golongan yaitu monoterpena (C10) dan seskuiterpena (C15) yang mudah menguap, diterpena (C20) sukar
menguap, triterpenoid dan sterol (C30) tidak menguap serta pigmen karotenoid
OH OH OH CH3 Glc-Glc-O CH2OGlc HO
Protoaeigenin (Triterpenoid) Seskuiterpenoid Gambar 2.2. Struktur senyawa terpenoid (Harbourne, 2002 )
Terpenoid banyak ditemukan dalam tumbuhan tingkat tinggi sebagai minyak atsiri yang memberi bau harum dan bau khas pada tumbuhan dan bunga. Selain itu terpenoid juga terdapat dalam jamur, invertebrata laut dan feromon serangga. Sebagian besar terpenoid ditemukan dalam bentuk glikosida atau glikosil ester (Thomson, 2004).
Terpenoid dari tumbuhan biasanya digunakan sebagai senyawa aromatik yang menyebabkan bau pada eucalyptus, pemberi rasa pada kayu manis, cengkeh, jahe dan pemberi warna kuning pada bunga. Terpenoid tumbuhan mempunyai manfaat penting sebagai obat tradisional, antibakteri, antijamur dan gangguan kesehatan (Thomson, 2004).
Untuk mengidentifikasi triterpen yaitu dengan cara: sampel dilarutkan dalam 0,5 ml Klorofom, lalu ditambah dengan 0,5 ml asam asetat anhidrat. Selanjutnya campuran ini ditetesi dengan 1-2 ml H2SO4 pekat melalui dinding
tabung tersebut. Jika hasil yang diperoleh berupa kecoklatan atau violet pada perbatasan dua pelarut menunjukkan adanya triterpen, sedangkan munculnya warna hijau kebiruan menunjukkan adanya sterol (Indrayani, 2006).
2.3. Saponin
Saponin adalah suatu glikosida yang mungkin ada pada banyak macam tumbuhan. Saponin ada pada seluruh tumbuhan dengan konsentrasi tinggi pada bagian-bagian tertentu, dan dipengaruhi oleh varietas tumbuhan dan tahap pertumbuhan. Fungsi dalam tumbuh-tumbuhan tidak diketahui, mungkin sebagai bentuk penyimpanan karbohidrat, atau merupakan waste product dari metabolisme tumbuh-tumbuhan. Kemungkinan lain adalah sebagai pelindung terhadap serangan serangga.
Saponin Steroid Saponin Triterpenoid
Gambar 2.3. Struktur Saponin Steroid dan Saponin Triterpenoid (Gunawan, 2004)
Glikosida saponin adalah glikosida yang aglikonnya berupa sapogenin. Glikosida saponin bisa berupa saponin steroid atau saponin triterpenoid. Saponin tersebar luas antara tumbuhan tingkat tinggi. Keberadaan saponin sangat mudah ditandai dengan pembentukan larutan koloidal dengan air yang apabila digojog menimbulkan buih yang stabil (Gunawan, 2004).
Larutan saponin yang sangat encer sangat beracun untuk ikan, dan tumbuhan yang mengandung saponin telah digunakan sebagai racun ikan selama beratus-ratus tahun. Busa yang ditimbulkan saponin karena adanya kombinasi struktur senyawa penyusunnya yaitu rantai sapogenin nonpolar dan rantai samping polar yang larut dalam air. Saponin mempunyai rasa pahit, dapat mengadsorbsi Ca
dan Si dan membawanya dalam saluran pencernaan. Sebagian besar berupa glikosida yang dapat mengikat satu (monodesmosida), dua (bidesmosida) atau tiga (tridesmosida) rantai glukosa dan aglikonnya yang mengikat gugus fungsi –OH, –COOH dan –CH (Robinson, 1995). Saponin juga bersifat bisa menghancurkan butir darah merah lewat hemolisis, bersifat racun bagi hewan berdarah dingin, sehingga banyak di antaranya digunakan sebagai racun ikan (Gunawan, 2004).
Saponin bila terhidrolisis akan menghasilkan aglikon yang disebut sapogenin. Ini merupakan suatu senyawa yang mudah dikristalkan lewat asetilasi sehingga dapat dimurnikan dan dipelajari lebih lanjut. Saponin yang berpotensi keras atau beracun seringkali disebut sapotoksin (Gunawan, 2004).
Saponion memiliki berat molekul tinggi sehingga menjadikan upaya isolasi untuk mendapatkan saponin yang murni menemui banyak kesulitan. Berdasarkan aglikonnya (sapogeninnya), saponin dapat dibagi dua macam, yaitu tipe steroid dan tipe tritepenoid. Kedua senyawa ini memiliki hubungan glikosidik pada atom C-3 dan memiliki asal usul biogenetika yang sama lewat asam mevalonat dan satuan-satuan isoprenoid (Gunawan, 2004).
Jasmansyah (2002) dalam penelitiannya menjelaskan bahwa isolasi saponin dan triterpenoid sapogenin dari tumbuhan dilakukan dengan sokhlet dan ekstraksi menggunakan pelarut etanol yang dilanjutkan dengan pemisahan dan pemurnian dengan ekstraksi pelarut dan rekristalisasi. Kemudian saponin dihidrolisis dengan HCl 2 N. Berdasarkan identifikasi dengan spektrum UV-Visibel dan FTIR menunjukkan bahwa senyawa saponin mengandung gugus
hidroksil, ester, eter, karboksil dan ikatan rangkap tak berkonjugasi (Robinson, 1995).
Menurut penelitian Moelyono, M, dkk (2007) Pemeriksaan saponin dengan uji pembentukan busa. Adanya saponin ditunjukkan dengan pembentukan busa mantap selama proses pendiaman dengan ketinggian busa tidak kurang dari 1 cm setelah penambahan HCl. Pemeriksaan ulang dengan reaksi warna dengan pereaksi Liebermann Birchard (LB), dengan terbentuknya warna biru-hijau.
Menurut penelitian Kristianingsih (2005), isolasi saponin dilakukan dengan ekstraksi bertahap menggunakan metanol, dietil eter dan n-Butanol, pemisahan senyawa hasil isolasi dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Pada plat silica gel F254 dengan eluen campuran klorofom-metanol-air (20:60:20)
menghasilkan 3 noda. Setiap isolat hasil KLT dianalisis H-NMR.
Semua saponin mengakibatkan hemolisis. Oleh karena itu, relatif berbahaya bagi semua organisme binatang bila saponin diberikan secara parental. Setengah sampai beberapa mg/kg BB saponin dapat berakibat fatal dan mematikan. Begitu pula pemakaian sterol saponin kompleks dalam jangka panjang akan mematikan bila diberikan secara parental. Pengaruh terhadap alat pernafasan dapat dibuktikan dengan kenyataan digunakannya obat yang mengandung saponin untuk mencari ikan oleh rakyat yang primitif. Kadar saponin yang sangat kecil pun mampu melumpuhkan fungsi pernafasan dari insang (Gunawan, 2004).
Menurut Robinson (1995), saponin memiliki kegunaan dalam pengobatan, terutama karena sifatnya yang mempengaruhi absorpsi zat aktif secara
farmakologi. Beberapa jenis saponin bekerja sebagai antibakteri. Sifat-sifat saponin adalah sebagai berikut :
1) Berasa pahit. 2) Berbusa dalam air.
3) Mempunyai sifat detergen yang baik.
4) Larut dalam air dan alkohol dan tidak larut dalam eter. 5) Mempunyai aktivitas hemolisis, merusak sel darah merah. 6) Tidak beracun bagi binatang berdarah panas.
7) Mempunyai sifat antieksudatif. 8) Mempunyai sifat antiinflamatori
2.4. Tinjauan Umum Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli 2.4.1. Bakteri Staphylococcus aureus
Gambar 2.4. Bakteri Staphylococcus aureus (David, 2006)
Menurut bergey dalam Irianto (2006), Staphylococcus aureus dapat diklasifikasikan sebagai berikut:
Kingdom : Monera Divisio : Firmicutes Class : Bacilli Ordo : Bacillales Family : Staphylococcaceae Genus : Staphylococcus
Spesies : Staphylococcus aureus
Beberapa jenis Staphylococcus tumbuh dengan baik dalam kaldu pada suhu 37 0C. Pertumbuhan terbaik dan khas ialah pada suasana aerob, bakteri ini juga bersifat anaerob fakultatif dan dapat tumbuh dalam udara yang hanya mengandung hidrogen, pH optimum untuk pertumbuhannya adalah 7,4. Pada lempeng agar, koloni yang dihasilkan berbentuk bulat, cembung, buram, mengkilat, dan konsistensinya lunak. Koloni dari S. aureus berwarna kuning keemasan (Syahrurachman dkk, 1993).
S. aureus merupakan bakteri gram positif berbentuk kokus dengan diameter 0,7-0,9 µm, membutuhkan nitrogen organik (asam amino) untuk tumbuh serta bersifat anaerobik fakultatif. S. aureus bersifat termodurik, dengan kisaran suhu pertumbuhan antara 5-50 0C. Bakteri ini dapat ditemukan pada kulit, kelenjar kulit dan selaput lendir (Fardiaz, 1993).
2.4.2. Bakteri Escherichia coli
Gambar 2.5. Bakteri Escherichia coli (David, 2006)
Menurut Bergey dalam Irianto (2006), Escherichia coli dapat diklasifikasikan sebagai berikut:
Kingdom : Bakteria Filum : Proteobacteria Kelas : Gammaproteobacteria Ordo : Enterobacteriales Sub-ordo : Eubacteriales Family : Enterobacteriacerae Genus : Escherichia
Spesies : Escherichia coli
E. coli merupakan bakteri gram negatif yang berbentuk batang lurus dengan ukuran 1,1-1,5 µm, kisaran pertumbuhan (suhu 8 0C sampai lebih dari 40
0
C), suhu pertumbuhan optimum pada 37 0C, dan dapat melakukan fermentasi laktosa dan fermentasi glukosa, serta menghasilkan gas. Dapat melakukan fermentasi laktosa dan fermetasi glukosa, serta menghasilkan gas. E. coli merupakan flora normal dan hidup komensal didalam colon manusia. Indikator yang paling baik untuk menunjukkan bahwa air rumah tangga sudah dikotori faces adalah dengan adanya E. coli dalam air tersebut, karena dalam faces ma nusia, baik sakit maupun sehat terdapat bakteri ini. Dalam satu gram faces terdapat sekitar seratus juta E. coli (Entjang, 2003).
E. coli tumbuh baik pada hampir semua media yang biasa digunakan pada isolasi kuman enterik dalam keadaan mikroaerofilik. Beberapa strain bila ditanam pada agar darah menunjukkan hemolisis tipe beta (Syahrurachman dkk, 2003). Koloni yang tumbuh berbentuk bundar, cembung, halus dengan tepi yang nyata (Jawet et.al, 1996). Koloni bakteri pada media diferensial agar Eosin Methylen Blue (EMB) membentuk morfologi koloni seperti kilatan logam (metallic sheen)
(Dzen, dkk, 2003).
Tabel 2.1. Perbedaan relatif bakteri gram positif dan gram negatif
Sifat Perbedaan Relatif
Bakteri Gram Positif Bakteri Gram Negatif Komposisi dinding sel Kandungan lipid
rendah (1-4%)
Kandungan lipid tinggi (11-22%)
Ketahanan terhadap
penisilin Lebih sensitif Lebih tahan
Penghambatan oleh pewarna basa. Contoh
violet, kristal
Lebih dihambat Kurang dihambat
Kebutuhan nutrien Kebanyakan spesies relatif kompleks
Kebanyakan spesies relatif sederhana Ketahanan terhadap
perlakuan fisik Lebih tahan Kurang tahan
Sumber : Pelczar dan Chan, 1986
2.5. Ekstraksi Saponin dengan Metode Maserasi
Esktraksi merupakan peristiwa pemindahan massa zat aktif yang semula berada dalam sel ditarik oleh pelarut sehingga terjadi larutan zat aktif dalam pelarut tersebut. Pada umumnya eksratraksi akan bertambah baik bila permukaan serbuk simplisia yang bersentuhan dengan pelarut dengan pelarut makin luas. Dengan demikian, makin halus serbuk simplisia, seharusnya makin baik ekstraksinya. Tetapi pada pelaksanaannya tidak selalu demikian karena ekstraksi
masih bergantung pada sifat fisik dan sifat kimia simplisia yang bersangkutan (Ahmad, 2006)
Metode ekstraksi yang digunakan untuk bahan alam, dikenal suatu metode yaitu maserasi. Maserasi merupakan suatu metode ekstraksi menggunakan lemak panas. Akan tetapi penggunaan lemak panas ini telah digantikan dengan pelarut-pelarut volatil. Penekanan utama pada maserasi adalah tersedianya waktu kontak yang cukup antara pelarut dan jaringan yang diekstraksi (Guether, 1987).
Maserasi merupakan cara yang sederhana, maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam pelarut. Pelarut akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat-zat aktif sehingga zat aktif akan larut. Karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel, maka larutan yang pekat di desak keluar. Pelarut yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol atau pelarut lain. Keuntungan cara ekstraksi ini, adalah cara pengerjaan atau peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Sedangkan kerugiannya adalah waktu pengerjaannya lama dan ekstraksi kurang sempurna (Ahmad, 2006).
Pemilihan pelarut untuk ekstraksi harus mempertimbangkan banyak faktor. Pelarut harus memenuhi syarat-syarat, murah dan mudah diperoleh, stabil fisika dan kimia, bereaksi netral, tidak mudah menguap dan tidak mudah terbakar, selektif dan tidak mempengaruhi zat berkhasiat (Ahmad, 2006).
Senyawa glikosida seperti saponin dan glikosida jantung tidak larut dalam pelarut nonpolar. Senyawa ini paling cocok diekstraksi dari tumbuhan memakai etanol atau methanol 70-95 % (Robinson, 1995). Pada penelitian Song et al (2001
dalam Kristianingsih, 2005) menggunakan metanol untuk ekstraksi Aralia elata karena saponin bersifat polar sehingga lebih mudah larut dan akan diperoleh lebih banyak ekstrak daripada pelarut lain. Penelitian ini telah memperoleh identitas senyawa saponin berdasarkan karakter spektra IR, H-NMR dan 13C-NMR, sedangkan karakter dengan KLT memberikan 6 noda ungu gelap pada Rf
0,40-0,68 dengan eluen campuran kloroform-metanol-air.
H H3C CH3 COOGlc Glukosa2-O H3C
3-O-[-D-glukopiranosil (1-2)-oleanolic acid]/28-O-D-glukopiranosil ester Gambar 2.6. Struktur saponin triterpenoid Aralia Elata (Song, et.al., 2001 dalam
Kristianingsih, 2005 )
Menurut Faradisa (2008), ekstrak kasar senyawa saponin dari batang tumbuhan blimbing wuluh ( Aveehoa bilimbi linn) memiliki aktifitas antibakteri terhadap S. aureus dan E. coli.
2.6. Isolasi Saponin dengan KLT (Kromatografi Lapis Tipis)
Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponennya. Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi
yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada. Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut. Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna (Sudarmaji, 2007).
Gambar 2.7. Menunjukkan lempengan setalah pelarut bergerak setengah dari lempengan.
Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.
Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan.
Pengukuran berlangsung sebagai berikut:
Gambar 2.8. Pengukuran pada lempengan
Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Mengacu pada penelitian Kristianingsih (2005), isolasi saponin dilakukan dengan ekstraksi bertahap menggunakan metanol, dietil eter dan n-Butanol, pemisahan senyawa hasil isolasi dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Pada plat silica gel F254 dengan eluen campuran klorofom-metanol-air (20:60:20) menghasilkan 3 noda. Setiap isolat hasil KLT dianalisis H-NMR. Menurut penelitian Wagner (1984), menganalisa saponin triterpenoid pada akar gingseng dihasilkan 10 noda dengan Rf antar 0,35-0,75.
Jarak yang ditempuh oleh komponen Jarak yang ditempuh oleh pelarut Rf=
jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut
2.7. Uji Efektifitas Saponin sebagai Antibakteri
Antibakteri adalah agent kimia yang mampu menginaktivasi bakteri. inaktivasi bakteri dapat berupa penghambatan pertumbuhan bakteri (bakteriostatik) atau bahkan bersifat membunuh bakteri (bakterisid) (Brock, dkk., 1994).
Kadar minimal yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan mikroba atau membunuhnya, masing-masing dikenal sebagai Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh Minimum (KBM). Antibakteri tertentu aktivitasnya dapat meningkat dari bakteriostatik menjadi bakterisid bila kadar antibakterinya ditingkatkan melebihi KHM (Ganiswarna, S.G, 1995).
Mekanisme kerja antibakteri ada lima diantaranya, menghambat metabolisme sel mikroba, menghambat sintesis dinding sel mikroba, mengganggu permeabilitas membran sel mikroba, menghambat sintesis protein sel mikroba dan menghambat sintesis atau merusak asam nukleat sel mikroba (Ganiswarna, S.G, 1995).
Pada perusakan membran sel, ion H+ dari senyawa fenol dan turunannya akan menyerang gugus polar (gugus fosfat) sehingga molekul fosfilipid akan terurai menjadi gliserol, asam karboksilat, dan asam fosfat. Hal ini mengakibatkan fosfolipid tidak mampu mempertahankan bentuk membran sel, akibatnya membran sel akan bocor dan bakteri akan mengalami hambatan pertumbuhan bahkan kematian (Noviana, 2004).
Saponin adalah senyawa penurun tegangan permukaan yang kuat yang menimbulkan busa bila dikocok dalam air, sifatnya menyerupai sabun. Saponin
bekerja sebagai antibakteri dengan mengganggu stabilitas membran sel bakteri sehingga menyebabkan sel bakterilisis (Cheeke, P.R, 2003), jadi mekanisme kerja saponin termasuk dalam kelompok antibakteri yang mengganggu permeabilitas membran sel mikroba, yang mengakibatkan kerusakan membran sel dan menyebabkan keluarnya berbagai komponen penting dari dalam sel mikroba yaitu protein, asam nukleat, nukleotida dan lain-lain (Ganiswarna, S.G, 1995).
Ekstrak saponin dari gandum (Sorghum Bicolor L.) bersifat menghambat pertumbuhan bakteri gram positif yaitu S. aureus pada kadar hambat minimum (KHM) 25 mg/mL. Sedangkan pada bakteri gram negatif dan jamur pada escherichia coli dan candida albican bersifat tidak menghambat. Kontrol positif untuk bakteri S. aureus menggunakan pinisilin 25 mg/mL dengan volume 0,4 µL, sedangkan Kontrol positif untuk bakteri E. coli menggunakan streptomicyn 6,25 mg/mL dengan volume 1,6 µL (Soetan, et.al, 2006) dan pelarutnya n-butanol (sebagai kontrol negatif).
Untuk mengetahui aktivitas suatu bakteri terhadap antimikroba dapat dilakukan dengan uji antibakteri. Menurut Brock and Madigan (1994) terdapat 3 metode yang umum digunakan dalam uji antibakteri, yaitu metode dilusi kaldu, metode dilusi agar, dan metode difusi cakram. Metode difusi cakram merupakan metode yang paling sering digunakan untuk uji kerentanan antibakteri dan metode ini dirancang untuk organisme yang tumbuh cepat seperti Staphylococcus. Dalam metode ini sampel yang diuji diserapkan pada kertas saring yang berbentuk cakram dan ditempelkan pada media agar yang telah dihomogenkan dengan
bakteri, kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C sampai terlihat zona hambatan disekitar cakram.
2.8 Tumbuhan Obat dalam Pandangan Islam
Allah SWT sebagai Tuhan mempunyai tanda-tanda ketuhananNya berupa hasil-hasil ciptaanNya, berupa langit dan bumi, apa yang ada di antara keduanya. Termasuk juga kejadian-kejadian yang berlangsung dalam makhlukNya tersebut seperti Allah SWT menciptakan penyakit dan juga menciptakan obat, sebagaimana sabda Rasulullah SAW tentang hal tersebut :
,
)Artinya : Diriwayatkan dari Jabir r.a, dari Rasulullah Saw., Beliau bersabda : setiap penyakit ada obatnya. Apabila ditemukan obat suatu penyakit, maka sembuhlah sipenderita dengan seizin Allah Azza wa Jalla.(H.R. Muslim)
Allah SWT menunjukkan tanda-tanda kekuasaanNya tersebut agar manusia bersyukur dan berfikir, sebagaimana firman Allah SWT dalam Q.S. al Jaatsiyah (45) : 13 :
Artinya: Dan Dia telah menundukkan untukmu apa yang di langit dan apa yang di bumi semuanya , (sebagai rahmat) dari pada-Nya. Sesungguhnya pada yang demikian itu benar-benar terdapat tanda-tanda (kekuasaan Allah) bagi kaum yang berfikir.(Q.S. Al Jaatsiyah (45): 13)
:,
Pengobatan dari Nabi SAW memang berbeda dengan ilmu medis para dokter pada umumnya. Pengobatan Nabi bersifat pasti dan absolut serta bernilai kedokteran Ilahi, berasal dari wahyu dari lentera kenabian serta kesempurnaan intelegensi. Rasulullah SAW pernah menyebutkan bahwa tumbuhan herbal sebagai obat yang baik untuk digunakan. Tumbuhan herbal merupakan tumbuhan herbal yang memang sangat berguna untuk membuang lemak dan racun-racun dalam tubuh manusia. Produk tumbuhan herbal banyak digunakan oleh kedokteran untuk mengurangi lemak berlebih penyebab obesitas dan menyembuhkan berbagai penyakit (Barazing, 2007).
Menurut Al-Jauziyah, I.Q. (2007), beberapa obat yang digunakan Rasulullah SAW untuk menyembuhkan penyakit-penyakit tertentu antara lain buah kurma, jinten hitam, delima, anggur dan berbagai jenis makanan lainnya.
a. ‘Ajwa (kurma Ajwa)
Dalam Shahih al Bukhari dan Muslim diriwayatkan hadist Saad bin Abi Waqqash, dari Nabi SAW bersabda :
Artinya : “diriwayatkan dari Sa’id bin Abu Waqqash r.a., dia berkata : aku pernah mendengar Rasullullah SAW bersabda, barang siapa pagi- pagi makan tujuh buah kurma ’ajwa, maka hari itu dia tidak mudah keracunan dan terserang penyakit (H.R Bukhori dan Musim)”
Hadist di atas menjelaskan bahwa kurma ajwa al Madinah dikenal sebagai kurma hijaz terbaik secara mutlak. Bentuknya amat baik, padat, agak keras dan
:
)
(kuat, namun termasuk kurma yang paling lezat, paling harum dan paling empuk. Kurma ajwa berkasiat untuk menolak racun dan sihir (Al-Jauziyah, I.Q., 2007).
b. Habbatus Sauda’ (Jinten Hitam)
Diriwayatkan dalam Shahih al Bukhari dan Muslim dari hadist Abu Salamah, dari Abu Hurairah, bahwa Rasullulah SAW bersabda :
)
(Artinya: diriwayatkan dari Abu Hurairah r.a bahwa dia pernah mendengar Rasulullah SAW bersabda : sesungguhnya Jinten Hitam itu mengandung obat untuk segala penyakit (H.R. Bukhari dan Muslim) .
Jinten hitam memang berkasiat mengobati segala penyakit panas. Syuwainiz berkasiat menghilangkan gas, mengatasi kebotakan, mengobati kusta, demam yang disertai batuk berdahak, mengeringkan lambung yang basah dan lembab, menghancurkan batu ginjal, memperlancar air seni, haid dan ASI bila diminum tiap hari, mengeluarkan cacing, dan membunuh bakteri dan lain-lain (Al-Jauziyah, I.Q., 2007).
c. Rumman (Delima)
Allah SWT berfirman dalam surat ar Rahman (55) ayat 68:
$ u
Κ
Í
κ
Ï
ù
×
π
y
γ
3≈
Å
s ù
×
≅
ƒ w
Υ
ø
ρ
u
×
β
$
¨
Β
‘u
â
ρ ∩∉∇∪
Artinya : “Di dalam keduanya ada (macam-macam) buah-buahan dan kurma serta delima.” (Q.S. ar Rahman (55) : 68)
:
Ayat di atas menyiratkan bahwa ada faktor keunggulan dan keutamaan kedua buah tersebut. Allah SWT telah menanamkan sejumlah kelebihan didalamnya sebagaimana diketahui ilmu pengetahuan modern. Delima yang ma nis amat baik untuk lambung, mengobati sakit tenggorokan, batuk, dada dan paru-paru. Biji delima yang dicampur madu, amat berguna mengobati penyakit agnail dan koreng atau eksim basah, bahkan bisa menyembuhkan luka yang berdarah. Sebagian kalangan medis menyatakan, “barang siapa mengkonsumsi tiga putik delima setiap tahun, ia akan selamat dari penyakit mata dalam satu tahun penuh.” (al Jauziyah, 2007).
d. Anggur
Banyak dari contoh-contoh tumbuhan yang sejak zaman nabi sudah dipakai untuk mengobati beberapa penyakit. Surat ar Rad (13) ayat 4, yang berbunyi:
’
ûu
Î
ρ
Ú
Ç
‘F
ö
{
$#
Ó
ì s Ü
Ï
%
N
Ô
≡
u ‘
θ≈
È
y f t G
•
Β
M
×
≈
¨
Ζ
_u
y
ρ
ô
Ïi
Β
=
5
≈
u
Ζ
ô
ãr &
×
í
‘y
ö
—u
ρ
×
≅Š
ƒ w
Υ
Ï
ρ
u
×
β
θ
#u
÷
Ζ
Ï
¹
ç
ö
x îu
ρ
5
β
θ
#u
Ζ
÷
Ï
¹ 4
’
+
s
ó
¡
„
ç
&
™
!$ y
ϑ
Î
/
7
‰
n
Ï
ρ
≡
u
ã
≅
Åe
Ò x
ç
ρ
Ρ
u
$ p
Õ
κ
|
÷
è t / 4
†
?
n
t ã
<
Ù
÷
è t /
’
û
Î
È
≅
à
2
W
{
$#
4 ¨
β
Î
)
’
û š
Î
Ï
9≡
s Œ
;
M
≈
ƒ
t
U
ψ
Θ
5
θ
ö
s
)
9
Ïj
š
χθ
è
=
É
)
÷
è t
ƒ
Artinya : “Dan di bumi Ini terdapat bagian-bagian yang berdampingan, dan kebun-kebun anggur, tumbuhan-tumbuhan dan pohon korma yang bercabang dan yang tidak bercabang, disirami dengan air yang sama. kami melebihkan sebahagian tanam-tumbuhan itu atas sebahagian yang lain tentang rasanya. Sesungguhnya pada yang demikian itu terdapat tanda-tanda (kebesaran Allah) bagi kaum yang berfikir” (QS. ar Rad (14) :4)
Berdasarkan ayat di atas Allah SWT mencontohkan tumbuhan anggur dan kurma meskipun berada di tempat dan diberi air yang sama, Allah SWT
melebihkan dengan rasanya. Kedua tumbuhan tersebut dilebihkan rasanya dan sekaligus kandungan senyawa aktifnya, misalnya pohon kurma mengandung senyawa aktif 60% pengganti gula, protein, pektin, tanin, tajin dan lemak. Manfaat kurma sebagai penawar racun, menyuburkan kandungan dan lain-lain, sedangkan anggur manfaatnya adalah memudahkan buang air besar, menggemukkan badan dan bergizi (Farooqi, 2005).
e. Putri Malu
Allah SWT Maha Kuasa dengan segala ciptaanNya, hal ini terbukti dengan diciptakanNya segala macam tumbuhan yang baik, baik yang telah diketahui manfaatnya ataupun yang belum diketahu manfaatnya. Hal tersebut telah tercantum dalam firman Allah QS Lukman (31) ayat 10 :
t t
,
n
z
=
y
N
Ï
θ≈
≡
u
y
ϑ
¡
¡
9
$#
Î
ö
t ó
Î
/
7
‰ u
Η
x å $ p
Ξ
κ
ρ
t
÷
t s ?
(
4
’
+
s
ø
9
ρ ’
r &u
û
Î
Ú
Ç
‘F
ö
{
$# z
©
›
Å
ρ
≡
u
u ‘
β
r & y ‰
‹
Ï
ϑ
s ?
ö
Ν
3
ä
Î
/
] t /u
£
ρ
$ p
κ
Ï
ù
Ï
Β
Èe
≅
.
ä
7
π
−
/ !#y Š
4
$ u
Ζ
ø
9
t “
Ρ
ρ
r &u
z
Ï
Β
Ï
™
!$ y
ϑ
¡
¡
9
$#
[
™
!$ t
Β
$ o
Ψ
÷
G u ; /
Ρ
r ' s ù $ p
κ
Ï
ù
Ï
Β
≅
Èe
à
2
8
l
ρ
÷
—
y
Οƒ
A
x
Í
.
Artinya: Dia menciptakan langit tanpa tiang yang kamu melihatnya dan Dia meletakkan gunung-gunung (di permukaan) bumi supaya bumi itu tidak menggoyangkan kamu; dan memperkembang biakkan padanya segala macam jenis binatang. Dan Kami turunkan air hujan dari langit, lalu Kami tumbuhkan padanya segala macam tumbuh-tumbuhan yang baik (QS Lukman (31) : 10)
Ayat tersebut menjelaskan bahwa Allah dengan kuasaNya menciptakan tumbuhan di atas bumi ini dengan bermacam-macam tumbuhan-tumbuhan yang baik. Dalam surat lain disebutkan juga :
t
%
Ï
!
©
$# t
βρ
.
ã
ä
õ
‹ t
ƒ
©! $# $
V
ϑ≈
u
Š
%
Ï
#
Y
Š
θ
ã
è
è
%
ρ
u
4
’
n
?
t ãu
ρ
ö
Ν
Î
γ
Î
/
θ
ã
Ζ
_ t
ã
βρ
ã
6
¤
x t G t
ƒ
ρ ’
u
û
Î
,
È
z
=
ù
y
N
Ï
θ≈
≡
u
u
Κ
¡
¡
9
$#
Ú
Ç
‘F
ö
{
$#u
ρ
$ u
Ζ
−
/u ‘ $ t
Β
M
|
ø
)
n
z #x ‹
=
y
≈
y
δ
W
ξ
Ü
Ï
≈
t / y
7
o
Ψ≈
y s
ö
6
™ $ o
ß
Ψ
É
)
s ù z >#x ‹ t ã
‘$
Í
¨
Ζ9
$#
Artinya: orang-orang yang mengingat Allah sambil berdiri atau duduk atau dalam keadan berbaring dan mereka memikirkan tentang penciptaan langit dan bumi (seraya berkata): "Ya Tuhan kami, tiadalah Engkau menciptakan ini dengan sia-sia, Maha Suci Engkau, maka peliharalah kami dari siksa neraka (QS al Imran (3): 191)
Ayat di atas menjelaskan agar kita selalu bersyukur dan mengingat Allah SWT karena Allah menciptakan segala sesuatu tidak sia-sia. Seperti halnya tumbuhan putri malu yang diangap hama bagi para petani tanpa mengetahui manfaat dan kasiatnya.
BAB III METODOLOGI
3.1. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan mulai bulan Agustus sampai dengan bulan Desember 2009 di laboratorium Organik dan laboratorium Biotek Jurusan Kimia Universitas Islam Negeri Malang.
3.2. Alat dan Bahan Penelitian 3.2.1. Alat penelitian
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah pisau, blender, neraca analitik, pipet tetes, pipet ukur, botol plastik, beaker glas, bola hisap, erlenmeyer, corong gelas, spatula, Rotary Evaporator Vaccum, seperangkat alat KLT, desikator, Laminar air flow, autoklaf , cawan petri, jarum ose, kapas, kain kasa, bunsen, pinset, kertas saring, inkubator, aluminium foil, gelas ukur, tabung reaksi, botol media, erlenmeyer, jangka sorong, shaker incubator , sentrifugasi, timbangan analitik dan silet.
3.2.1. Bahan penelitian
Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini methanol (CH3OH)
80 %, n-butanol, dietil eter, aquades, HCl, plat KLT silika gel, klorofom, reagen LB ( Liebermann-burchad ), media NA ( Nutrien agar ), aquades, spirtus, kapas, biakan bakteri E. coli dan S. aureus, alkohol 70 %, kertas cakram dan tisu.
3.3. Rancangan Penelitian
Penelitian ini dilakukan dengan beberapa tahap yang meliputi : 1. Preparasi sampel
2. Uji pendahuluan 2.1. Uji busa
2.2. Uji warna Liebermann- Burchard (LB) 3. Ekstraksi sampel
4. Uji Efektivitas antibakteri ekstrak kasar 5. Pemisahan senyawa hasil isolasi
5.1 KLT kualitatif 5.2 KLT preparatif
6. Uji Antibakteri senyawa saponin hasil isolasi KLT 7. Analisis data
3.4. Metode Penelitian 3.4.1. Preparasi Sampel
Sebanyak 0,5 kg akar Putri Malu dibersihkan, dikeringkan menggunakan oven pada suhu 60 °C sampai diperoleh berat konstan kemudian digiling sampai berupa bubuk halus. Selanjutnya serbuk akar kering disebut sampel (Kristianingsih, 2005).
3.4.2. Uji Pendahuluan 3.4.2.1. Uji Busa
Sebanyak 0,5 mg sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi akuades secukupnya kemudian dikocok kuat-kuat selama 5 menit dan diamati busa yang timbul sampai stabil dan diukur tinggi busanya (ketinggian busa 1-3 cm). Sebelum busa hilang ditetesi HCl 1 N bila busa stabil menunjukkan reaksi positif (Faradisa, 2008).
3.4.2.2. Uji warna Liebermann- Burchard (LB)
Ditimbang 0,5 mg sampel dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi I, ditambah 5 ml CHCl3 kemudian dipanaskan 5 menit di atas pemangas air sambil
dikocok-kocok lalu didinginkan. Diambil 1 ml campuran dari tabung reaksi I dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi II. Ke dalam tabung reaksi II diteteskan peraksi (LB) (1 ml Asam Asetat anhidrat dan 1 tetes Asam Sulfat Pekat). Kemudian diamati perubahan yang timbul sampai kira-kira 30 menit (Indriani 2006).
3.4.3. Ekstraksi saponin
Ekstraksi saponin dilakukan menggunakan metode maserasi dengan pelarut metanol 90 % sebanyak 300 mL, ke dalam erlenmeyer dimasukkan 25 gram sampel dan dikocok tiap 2 jam sekali selama 24 jam, kemudian disaring sehingga menghasilkan filtrat dan residu. Residu dimaserasi lagi dengan pelarut metanol sebanyak 300 mL dan perlakuan perendaman i ni diulang sebanyak 3 kali.
Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan rotary evaporator vacuum. Ekstrak pekat dimasukkan dalam corong pisah 250 mL dan disuspensi dengan aquades 35 mL, dicuci dengan dietil eter 1:1, dikocok dan dibiarkan sampai terbentuk dua lapisan. Lapisan air diambil dan diekstraksi dengan n-butanol 1:1. Lapisan n-butanol diambil dan dipekatkan dengan rotary evaporator vacuum. Selanjutnya ekstrak dilakukan uji efektivitas antibakteri serta diisolasi dengan KLT (Kristianingsih, 2005).
3.4.4. Uji Efektifitas Antibakteri 3.4.4.1. Sterilisasi Alat dan Bahan
Sterilisasi alat dan bahan dengan cara menutup alat-alat yang akan disterilkan dengan alumunium foil dan kapas, kemudian memasukkannya ke dalam autoklaf. Autoklaf diset pada suhu 121 0C dengan tekanan 15 psi (per square inchi) selama 15 menit (Faradisa, 2008).
3.4.4.2. Pembuatan Media
Pembuatan media dilakukan dengan cara sebanyak 2 gram nutrien agar dilarutkan dalam 100 mL akuades dalam beaker glass, kemudian dipanaskan hingga mendidih dan dimasukkan ke dalam 10 tabung reaksi (masing-masing 10 mL untuk 8 tabung reaksi dan 5 mL untuk 2 tabung reaksi) dan ditutup dengan kapas. Kemudian disterilkan dalam autoklaf suhu 121 0C selama 15 menit. Kemudian tabung yang berisi 5 mL larutan nutrien agar diletakkan dalam posisi miring dan didiamkan selama 24 jam pada suhu ruang (Faradisa, 2008).
3.4.4.3. Peremajaan Biakan Murni S. aureus dan E. coli
Biakan murni S. aureus dan E. coli digoreskan secara aseptis dengan jarum ose pada media padat agar miring dan tabung media ditutup dengan kapas. Selanjutnya biakan S. aureus dan E. coli diinkubasi selama 48 jam pada suhu 370C (Faradisa, 2008).
3.4.4.4. Pembuatan Larutan Bakteri S. aureus dan E. coli
Diambil 1 ose dari hasil peremajaan biakan murni S. aureus dan E. coli untuk dilarutkan dalam 10 mL akuades steril (Faradisa, 2008).
3.4.4.5. Uji Aktifitas Antibakteri
Larutan nutrien agar dimasukkan dalam cawan petri dan masing-masing dicampur dengan 0,1 mL larutan bakteri S. aureus dan E. coli, kemudian dihomogenkan. Kertas cakram direndam dalam ekstrak selama 15 menit dengan variasi konsentrasi 100, 200, 300, 400 500, 600, 700 dan 800 (mg/L). Kontrol positif untuk bakteri S. aureus menggunakan pinisilin 25 mg/mL, sedangkan kontrol positif untuk bakteri E. coli menggunakan streptomicyn 6,25 mg/mL dan pelarutnya akuades (sebagai kontrol negatif). Setelah itu kertas cakram yang sudah direndam dalam ekstrak selama 15 menit diletakkan di atas permukaan media menggunakan pinset steril dan ditekan sedikit. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 0C sampai muncul daerah hambatan selama 24 jam. Pengukuran zona
hambatan dilakukan dengan mengukur diameter daerah jernih menggunakan jangka sorong.
Hasil zona hambat yang didapat kemudian disesuaikan dengan tabel berikut yang menjelaskan daftar ukuran daerah hambatan pelbagai antibiotika dan khemoterapetika (Faradisa, 2008).
3.4.5. Pemisahan Senyawa Isolat dengan KLT 3.4.6.1. KLT Analitik
Pada KLT analitik digunakan pelat silika gel F254 dengan ukuran
2 x 10 cm. Ekstrak pekat ditotolkan pada jarak 1 cm dari tepi bawah pelat KLT mengunakan pipa kapiler. Kemudian dikeringkan di udara dan dielusi sampai jarak 8 cm dalam bejana kaca dengan diameter 6 cm. Eluen yang digunakan adalah campuran larutan klorofom:metanol:akuades dengan variasi kosentrasi (13:4:1), (65;50:10), (20:60:4), (20:60:10). Kromatogram diamati dengan lampu UV pada
λ
256 nm danλ
366 nm. Warnanya diamati dan dihitung Rf -nya. Eluen yangmemberikan hasil yang terbaik digunakan untuk pemisahan KLT seca ra preparatif (kristianingsih, 2005).
3.4.6.2. KLT Preparatif
Pemisahan dengan KLT preparatif dilakukan dengan silika gel F254 dengan
ukuran 10 x 20 cm. 30 mg ektrak pekat dilarutkan dalam metanol kemudian ditotol pada jarak 1 cm dari tepi bawah plat KLT mengunakan pipa kapiler. Kemudian dikeringkan diudara dan dielusi sampai jarak 8 cm dalam bejana kaca
