Bahan dan Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Grup C lsolat asal Babi dan Kera
Ill
BAHAN DAN METODA
3.1 Bahan
3.q. 1 lsolat Bekterb
Penelitian ini menggunaka" 34 isolat lapang streptokokus beta hemolitik yang berasal dari babi (30 isolat) dan kera (empat isolat) penderita streptokokosis. Sebanyak 10 isolat (enam asal babi dan empat asal kera) didapat dari Balai Penyidikan Penyakit Hewan (BPPH) Wilayah VI Denpasar- Bali. Tiga isolat asal babi didapat dari BPPH Wilayah Ill Bandar Lampung- Lampung dan dua isolat asal babi didapat dari BPPH Wilayah VII Maros- Sulawesi Selatan. Empat isolat didapat dari Balai Penelitian Veteriner-Bogor dan lima belas isolat asal babi didapat dari spesimen klinik berupa darah tanpa antikoagulan berasal dari hewan sakit yang belum diobati di daerah Jembrana-Bali
3.1.2 Hewan Percobaan
Sebagai sumber darah untuk media agar darah digunakan 2 ekor domba dan untuk pengujian respon fagositosis
in vivo
digunakan 50 ekor mencit Balb-C jantan yang memi[iki umur dan berat badan seragam.3.1 3 Media Umum
Bakteri ditumbuhkan dan dipelihara pada agar darah (blood agar base, Difco, USA), subkultur dilakukan setiap 3 minggu. Untuk tujuan uji-uji
Balian dan Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biobgi Sfrepfokokus Grup C lsolat 3 8
asal Babi dan Kera
.
tertentu, bakteri ditumbuhkan dalam media cair (Todd Hewitt Broth / THB, Difco, USA) atau brain heart infusion I BHI (Difco, USA).
3.1.4 Media untuk Uji Biokimia
Untuk uji biokimia digunakan media gula-gula berbentuk bubuk yang terdiri dari laktosa, sukrosa, sorbitol, ribosa, mannitol, inulin, arabinosa, raffinosa, trehalosa, rhamnosa, xylosa, hipurat, methyl red-Voges Proskauer (MR-VP) dan melisitose (Difco, USA). Untuk pengujian biokimia semua media di atas dibuat larutan 1% dengan me~arutkann~a dengan akuades kemudian disterilkan menggunakan autoklaf (12I0C, 15 Lbs). Pengujian biokimia juga dilakukan menggunakan
Rapid
-ID 32 Strep-Kit (Biomerieux, France).3.1.5 Bahan Kimia Padat
Bahan kimia padat yang digunakan meliputi amonium sulfat, dinatrium hidrogen fosfat, mononatrium dihidrogen fosfat, kalium klorida, amonium klorida, kalium tiosianat, sodium dodesil sulfat, natrium klorida, dekstrosa, natrium hidroksida, polietilen glikol 6000, tripan biru, dinatrium sitrat, gentiana violet, yodium, safranin, magnesium klorida, glisin, hippurat, merah metil, akriflavin, natrium bikarbonat, natrium-EDTA, akrilamid, merkaptoetanol, TEMED, amonium persulfat, riboflavin, tris-HCI buffer, tris buffer, biru coomassie dan giemsa (Merck, Germany), asam hialuronat, hialuronidase, phosphate buffered saline (PBS), hanks balanced salt solution
Banan dan Metoda : Ekspresi fenofip dan Akfivifas Biologi Streptokokus Grup C Isolat 3 9
asal Babi dan Kera
(HBSS), akridin orange dan MEM (Minimal Essential Medium), fluoresen isotiosianat (FITC) (Sigma, USA), agarose (Serva, Germany) dan glasswool.
3.1.6 Kit untuk Pengujian Serologis Streptokokus
Menggunakan kit Strep-tex untuk pengujian serologis (Oxoid, U.K.), dan beberapa antisera spesifik terhadap antigen R, R R-like, M-6 (dari Streptococcus pyogenes, grup A), W-60 (dari Strepfococcus equi subsp zooepidemicus, grup C) , dan sera normal untuk konfirmasi serologis isolat.
3.1.7 Kertas Cakram Antibiotika
Kertas cakram mengandung : ampisilin (10 wg), basitrasin (10 Unit), kioramfenikol (30 pg), eritrornisin (15 pg), gentamisin (30 pg), minosiklin (10 pg), neomisin (30 pg), penisilin (10 unit), tetrasiklin (30 pg), kanamisin (30 pg), streptomisin (10 pg), ceftriaxone (30 pg) dan danofloxacin (5 gg ).
Semua cakram buatan Becton-Dickinson, Heidelberg-Germany, kecuali kanamisin dan streptomisin buatan Oxoid (U.K.), sedangkan ceftriaxone dan danofloxacin buatan Difco (USA).
3.1.8 Bahan Kimia Cair
Menggunakan larutan 0,2 N HCI, aseton, alkohol 96 dan 70%,
giiserol 50%, akuades dan akuabides, asetol-alkohol untuk pewarnaan Gram, metanol. ficoll (buatan Pharmacia, Sweden), heksadekan, larutan 0,4% biru
Bahan dan Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Grup C lsolat 10 asal Babi dan Kera
trhpan (Sigma. USA), larutan Turk, asam trikloroasetat, minyak imersi dan xylol, kloroform (Merck, Germany), calf serum (Gibco-BRL, USA) dan ant~koagulan cair sitrat dextrosa (CPD, Terumo-Japan).
3 1 9 Bahan-bahan Lain
Menggunakan kapas, korek api, disinfektan lisol, dan film untuk dokumentas~ (Kodak), darah dan kerokan epitel mukosa buccalis babi funtuk uji biologis), kertas alumunium. Kultur set makrofag mencit (kode J-774) dan sel Hela (Kode 5-3) dari Justus Leibig University, Germany.
3.1.10 Alat-alat
Alat yang digunakan berupa bunsen, ose pfatina, tabung reaksi beserta raknya, petri dish, tabung eppendorf dan raknya, gelas ukur berbagai volume, erlenmeyer berbagai volume. alat suntik disposable tuberkulin volume 1 ml dan volume 2,5 sampai 10 ml (Terumo, Japan), pipet Pasteur, pipet kaca, kaca pengaduk, vortex (Vortex Genie K-550 GE, USA), sentrifus (Sorvall SS-3 Automatic, USA), kulkas dan freezer, inkubator (Memmert, Germany), penangas air, gelas objek dan penutupnya, hemositometer, mikroskop cahaya dan kameranya (Olympus BH-2, Japan), kamera (Pentax, Japan), alat untuk elektroforesjs dari immunoblotting (Sigma, USA), kaki tiga dan kasa untuk memanaskan, autoklaf, kandang hewan percobaan, pipet otomatis (5 - 50 pl dan 200
-
1000 p1) saluran tunggal (Finnpipette,Ballan dan Metoda . Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Grup C lsolat 41
asal Babi dan Kera
Labsystem, Finland) dan pipet otomatis 4 saluran (Titertek, Finland) beserta tipnya dan lain-lain, tabung sentrifus (Corning, USA) dan adaptornya, mikrotiter plate (Nunc, Denmark), cetakan khusus untuk imunodifusi / gel puncher, dan spektrofotometer (Spectronic 20, USA), mikroskop fluoresen (teitz, Germany).
3.2 Metoda Penelitian
3 2.1 Isolasi, Pengamatan Makroskopis dan Mikroskopis Bakteri
Darah tanpa antikoagulan ditumbuhkan dengan cara menggoresnya pada agar darah domba (5%) dalam suasana aerobik selama 18 jam dan suhu 37' C. Bentuk koloni dan pola hemolitik yang dihasilkan diamati secara makroskopis dan diskleksi koloni streptokokus dengan ciri-ciri berbentuk seperti titik-titik embun halus (Hardie, 1986) dan rnenghasilkan hemolisis tipe
p
berdasarkan informasi sebelumnya (Hardie, 1986, Dharma, 1994) dan berdasarkan sifat-sifat isolat streptokokus murni yang didapat dari beberapa BPPH pengirim. Koloni tersangka yang berasal dari spesimen klinik kemudian ditanam kembali pada agar darah untuk memurnikannya kemudian disimpan dalam lemari es pada suhu 4" C. untuk pengujian selanjutnya.Permukaan koloni yang didapat diamati dan digolongkan ke dalam dua jenis yaitu mukoid dan kasar. Koloni mukoid beraspek mengkilap dengan permukaan licin. Koloni kasar beraspek surarn dengan permukaan kasar. Untuk mengamati susunan dan bentuk sel, bakteri ditumbuhkan dalam
Bahan dari Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Grup C lsolat 12
asal Babi dan Kera
medium THB selama 18 jam pada suhu 37O C. Sebanyak satu oese suspensi dibuat sediaan ulas di atas gelas obyek (cukup disentuh di atas gelas obyek dan tidak digesek) serta diwarnai dengan pewarnaan Gram (Cruickshank. Duguid, Marmion dan Swain, 1975). Kemudian sediaan diamati secara mikroskopis dengan obyektif 100 x dan diperhatikan susunan dan bentuk selnya (Carter, 1986).
3.2.2 Penentuan Grup secara Serologis
Untuk penentuan grup dapat digunakan antigen utuh atau antigen yang telah diekstraksi. Beberapa metoda penentuan grup dijelaskan di bawah in1
3.2.2.1 Pembuatan Antigen Utuh untuk Uji Koaglutinasi
Sernua isolat bakteri ditumbuhkan pada 10 ml THE (18 jam, 37OC)
disentrifus (10.000 G, 10 menit) (Wibawan, lnformasi lisan). Setelah supernatan dibuang, pelet yang tersisa dicuci menggunakan 5 ml larutan 0,14 M Phosphate Buffered Saline (PBS) dingin, kemudian dihomogenkan selama 5 menit. Suspensi yang ada kemudian disentrifus lagi seperti di atas. Proses ini diulang hingga 2 sampai 3 kali agar pelet bersih dari kontaminasi supernatannya. Pelet disuspensikan dalam 0,5 ml larutan 0,14 M PBS. kernudian masing-masing sebanyak 0,05 ml suspensi pelet direaksikan dengan 0.05 ml antisera grup A, B, C, D. F, dan G (Oxoid, U.K.). Carnpuran digoyang-goyang dan dibiarkan pada suhu kamar selama 1 menit. Reaksi
Bahan dan Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Grup C lsolat 13
asal Babi dan Kera
p o s ~ t ~ f ditandai dengan terbentuknya gumpalan (aglutinasi) pada campuran antrsera dan antigen yang homolog.
3.2.2.2 Pembuatan Ekstrak Antigen untuk Uji lmunodifusi Ganda
Pengujian serologis juga dilakukan secara imunodifusi ganda menggunakan ekstrak antigen grup bakteri dan antisera standard grup C
yang dihasilkan dari Streptococcus equisimflis 8453 dan S. equi subsp. zooepidemicus W-60 (Justus Leibeig University, Giessen-Germany). Ekstraksi antigen grup dilakukan dengan prosedur menurut Rantz dan Randall (1 950) yang telah dimodifikasi oleh Wibawan dan Laemmler (1 990).
Bakteri ditumbuhkan pada 10 mi medium THB (18 jam, 37%). Medium yang telah mengandung ' biakan disentrifus dan dicuci dengan
prosedur seperti di atas. Pelet disuspensikan dalam 1 ml. larutan 0,14 M PBS dan pHnya dibuat netral-sedikit, alkalis dengan menggunakan larutan 0,1% indikator merah fenol. Suspensi pelet diautoklaf (121' C , 15 Lbs) selama 15 menit. Selesai autoklaf suspensi didinginkan kemudian disentrifus (-lO.O00 'G, 10 menit). Supernatan yang diambit mengandung antigen grup yang terlarut untuk immunodifusi. lmmunodifusi menggunakan medium agar dengan komposisi sebagai berikut :
R / Agarosa 0,4 g Polietilen glikol 6000 1,2 g
Akuades 20 ml
Bahan dan Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Grup C 1.~0lat 11 asal Babi dan Kera
Setelah dicampur, bahan-bahan di atas ditangas dalam air mendidih hingga campuran jernih homogen. Campuran yang telah homogen dituang dalam cetakan khusus untuk immunodifusi dan dibiarkan hingga dingin dan mengeras. Setelah itu, dibuat lubang-lubang menggunakan
Gel
puncherdengan motif 6 lubang mengelilingi satu lubang di tengah. Ke dalam lubang tersebut diisi suspensi ekstrak antigen dari masing-masing isolat (untuk lubang yang di tepi) dan antisera (untuk Lubang di tengah). Biarkan selama semalam pada suhu kamar (ditaruh datam kotak tertutup yang .lembab). Reaksi positif ditandai oleh adanya garis presipitasi antara antisera dan antigen yang homolog. Dilakukan juga pengujian menggunakan antisera anti R "b,, anti R-like, anti M-6, anti R, anti W-60, dan serum-normal untuk konfirmasi hasil yang didapat dan memastikan tidak adanya reaksi silang dengan antisera tersebut.
3.2.3
Pengujian BiokimiaUntuk identifikasi dan penentuan spesies bakteri dilakukan uji biokimiawi menggunakan media gula-gula (1%) yaitu laktosa, sukrosa, sorbitol, eskulin, ribosa, mannitol, inulin, arabinosa, raffinosa, trehalosa, rhamnosa, xylosa dan melisitose. Juga diamati kemampuan menghidrolisis hippurat serta uji MR (methyl
red)
dan VP (Voges Proskauer), ke tiga media terakhir juga dibuat berupa suspensi 1 %. Semua bakteri ditumbuhkan pada media gula-gula tersebut dan diinkubasikan pada suhu 37OC selama 18 jam, dan hasil pengujian diamati selama 24 sampai 48 jam pasca inkubasi. UntukBahan dati Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Grup C lsolat 45
asal Babi dan Kera
uji fermentasi gula-gula hasilnya dinyatakan dengan perubahan warna indikator merah fen01 dari merah menjadi kuning (+), nienjadi oranye (k) atau tidak berubah (-). Uji hidrolisis eskulin ditandai dengan perubahan warna media menjadi gelap (+) setelah penambahan larutan 0,05% feri sitrat dalam larutan 33% HCI. Uji hippurat ditandai dengan warna gelap setelah penambahan larutan 12% FeC13 . Uji MR ditandai dengan adanya warna merah (+) setelah penambahan larutan 0.3% indikator merah metil, uji VP
ditandai dengan warna merah jambu sampai merah setelah penambahan- reagens VP berupa larutan a-naftol dalarn etanol dan 40% KOH
(Mac
Faddin, 1980; Carter, 1986). Pengujian dikonfirmasi juga dengan menggunakanRapid ID 32 Sfrep-Kit (Biomerieux, France).
3.2.4 Uji Kepekaan terhadap Antibiotika In vitro
Dilakukan menggunakan kertas cakram yang mengandung ampisilin (10 pg), basitrasjn (?O Unit), kloramfenikol (30 pg), kanamisin (30 pg), eritromisin ( 7 5 pg), gentamisin (30 pg), streptomisin (10 pg), minosiklin (1 0 1-19), neomisin (30 C L ~ ) , ceftriaxone (30 pg), danofloxacin (5 pg ), penisilin (10 unit) dan tetrasiklin (30 p g ) Sebanyak 200 pI suspensi biakan diulas di perniukaan agar darah domba 5%. Cakram yang masing-masing mengandung berbagai jenis antibiotika diletakkan di atas ulasan bakteri. Media diinkubasi pada suhu 37OC selama 18 jam. Kepekaan bakteri terhadap antibiotika tertentu dievaluasi dengan mengukur diameter zona
Bahan dat? Meloda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Grup C /Solat 46 asal Babi dan Kera
hambatan pertumbuhan (satuan mrn) sesuai prosedur menurut Kirby Bauer (Anon. 1984). Besarnya diamater zona hambatan menunjukkan sifat isolat terhadap antibiotika uji, dan dinyatakan sebagai peka, intermedier dan resisten. Nilai acuan mengenai peka, intermedier dan resisten terhadap antibiotika tertentu tertera pada Tabel Lampiran 1 .
3.2.5 Karakterisasi lanjut : Pengamatan Ekspresi Fenotip lsolat
Pengamatan ekspresi fenotip dilakukan pada media cair THB dan BHI semisolid yang mengandung 0,15% agar (soft agar). Variasi bentuk koloni dapat ditampilkan dengan menggunakan metoda soft agar (Kane et a/.,
1975; Wibawan dan Laemmler, 1990). Untuk melihat pola pertumbuhan pada media cair, satu koloni bakteri diambil dari medium agar darah, kemudian ditanam di media cair selama 18 jam pada suhu 37OC. Keesokan harinya, diarnati supernatan medium (medium harus sesedikit mungkin terguncang). Pertumbuhan bakteri pada medium cair dinyatakan sebagai keruh (media cair menjadi keruh homogen) atau jernih (media cair jernih tapi ada endapan pertumbuhan bakteri di dasarnya).
Penumbuhan bakteri pada soft agar dilakukan dengan cara menginkubasi bakteri ke dalam media tersebut. Dengan menggunakan oese jarum bakteri pada media cair, disuspensikan pada larutan PBS kemudian divortex selama 2 menit. Setelah itu diambil suspensi datam larutan PBS tadi menggunakan oese jarum lalu ditusukan ke dalam media soff agar dan setelah ~ t u divortex selama 2 rnenit. Kernudian diinkubasikan pada suhu
Bahan datl Meloda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Grup C lsolat -17 asal Babi dan Kera
37'C selama 18 jam. Pengamatan dilakukan terhadap bentuk koloni yang tumbuh, dan ini dikategorikan sebagai koloni difus dan koloni kompak. Koloni difus berbentuk oval seperti kapas sedangkan koloni kompak berbentuk bulat kecil (Kane et a/.. 1975; Wibawan dan Laemmler. 1990).
3.2.6 Pengujian Kimiawi dan Konfirmasi Struktural Kapsul
Sifat-sifat kimia kapsul diuji dengan uji akriflavin, uji dekapsulasi dan
salt aggregation test / SAT. Keberadaannya dikonfirmasi dengan elektron mikroskop.
3.2.6.1 Uji Akriflavin :
Untuk mendeteksi kelompok asam uronat pada streptokokus grup C dikenal uji akriflavin. Uji ini telah digunakan untuk menentukan kapsul Fasteurella multocida tipe A (Carter dan Subronto, 1973; Carter, 1990). Prosedur uji sebagai berikut :
Bakteri yang telah ditumbuhkan pada 50 ml THB (37OC, 18 jam) medium cair selama 18 jam dicuci dengan prosedur seperti pada percobaan sebelumnya. Disiapkan larutan 0,1% akriflavin netral dengan cara rneiarutkannya dalam akuades steril. Larutan ini harus segar dan hanya layak digunakan dalam seminggu di dalam botol gelap (Carter, 1990). Sebanyak satu oese suspensi pelet pekat dicampur dengan larutan akriflavin, kemudian campuran dihomogenkan dan dibiarkan pada suhu kamar selama
Balian dan Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Sfreptokokus Grup C lsolat 48 asal Babi dan Kera
lima menit. Prosedur dilakukan juga terhadap bakteri yang tidak berkapsul. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya agregasi oleh bakteri berkapsul.
3.2.6.2 Uji Dekapsulasi
Uji ini dilakukan untuk mengetahui keberadaan kapsul streptokokus grup C menggunakan Staphylococcus aureus SN 2440 penghasil hyaluronidase (Carter dan Rundell, 1975). Aktivitas hyaluronidase diharapkan rnampu mengubah permukaan koloni bakteri yang tumbuh di sekitar S. aureus dari mukoid menjadi kasar. Untuk uji ini isolat S. aureus SN
2440 ditanam pada media agar darah secara tegak lurus dengan arah goresan bakter~ streptokokus yang diuji (berjarak 3 sampai 5 mm). Biakan diinkubasi pada suhu
37OC
selama 18 jam. Perrnukaan koloni bakteri streptokokus yang tumbuh di sekitar koloni S. aureus dinilai terhadap perubahan penarnpakan koloni. Diharapkan perubahan permukaan koloni dari mukoid menjadi kasar menunjukkan kapsul tersusun dari asam hyaluronat.3.2.6.3 Salt Aggregation Test (SAT)
Uji ini bertujuan untuk mengamati keberadaan kapsul di permukaan sel bakteri. Sel bakteri dengan permukaan yang didominasi oleh kapsul akan sulit diendapkan dengan larutan amonium sulfat konsentrasi rendah 1
hidrofilik. Sebaliknya jika permukaan sel tidak berkapsul akan mudah diendapkan dengan larutan tersebut I hidrofobik (Lindahl et at., 1981;
Bahan dan Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivifas Biologi Streptokokus Grup C lsolat 49 asal Babi dan Kera
Wibawan dan Laemmler, 1990). Dalam penelitian ini digunakan larutan 2 M
amonium sulfat untuk mengamati derajat hidrofobisitas permukaan selnya. Prosedur uji ini adalah sebagai berikut :
Bakteri dibiakan pada 50 ml THB lalu diinkubasi pada suhu 37OC selama 18 jam. Pelet yang telah dicuci disuspensikan dalarn PBS dan ditentukan secara fotometrik
(A
O.' 1 6 0 0 , 0,9) ini setara dengan kandungan sel sebesar 10'' per ml (Wadstrom, Schmidt, Kuhnemund, Havlick dan Kohler, 1984). Sebanyak masing-masing 50 pl suspensi - bakteri dicampurkan dengan 50 pl larutan amonium sulfat konsentrasi 2,O M, campuran dihomogenkan dengan cara mengoyang-goyang gelas objek selama satu menit.Pembacaan hasil diamati segera setelah campuran digoyang-goyang, hasil positif ditandai dengan adanya agregasi sel bakteri yang berbentuk seperti pasir. Sebagai kontrol negatif digunakan suspensi
S G C
yang bereaksi negatif dengan larutan 0,014 M PBS, sedangkan kontrol positif digunakan S.aureus
yang dapat beragregasi dengan larutan 0,014 M PBS (Rozgonyi et a/. , 1985).3.2.6.4 Pengarnatan Elektron Mikroskopi
Pengamatan ini mendeteksi kapsul langsung secara visual, pengamatan ini dapat terlaksana atas kebaikan dari Justus-Leibig University, Giessen-Germany yang telah bersedia membantu preparasi untuk elektron
Bahar~ dan Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Btologi Streptokokus Grup C lsolat 50
asal Babi dan Kera
mikroskopi. Prosedur pembuatan sediaan elektron rnikroskopi (Wibawan, Groelz-Krug dan Laemmler, 1991 a) sebagai berikut :
Suspenst bakteri disentrifus (10.000 G, 10 rnenit) kemudian supernatannya dibuang dan disuspensikan dalam bufer PIPES (pH 7,O) dan difiksasi selama 20 menit. Kemudian disentrifus dan pelet disuspensikan dalam larutan fiksasi (mengandung 0,5% glutaraldehid dan 2% paraformaldehid yang dicampur dengan medium cair BHI sama banyak) lalu difiksasi selarna 24 jam pada suhu 4%. Setelah pencucian dengan larutan 50 p M glisin, sel dilapisi dengan larutan 2% agar dan proses ini dilakukan di atas es. Sel yang telah terlapis agar (suhu dingin) diberikan kembali larutan fiksasi, bufer glisin dan diinfiltrasi dengan larutan 2,3 M sukrosa. Lama perlakuan tersebut berturut-turut 1 jam, 1 jam dan 14 jam. Setelah pembekuan dalam cetakan spesimen yang terbuat dari kuningan, cetakan bakteri dipotong pada suhu -90% dan diletakan pada tetesan larutan 2,3
M
sukrosa yang terdapat di loop platina. Setelah dipindah ke grid tembaga yang dilapis karbon dan formvar kemudian spesimen diwarnai menggunakan larutan 2% uranil asetat (pH 7 , O ) selama 10 menit. Setelah pencucian dengan akuades, spesimen di "embedding" menggunakan larutan 2% metil selulosa yang juga mengandung 209 pl larutan 2% uranil asetat per ml-nya (pH 2,5). Setelah 15 menit, grid ditaruh kernbali pada loop platina, kelebihan larutan metil selulosa dibuang hingga terbentuk lapisan gelap selama pengeringan. Potongan ini siap diamati menggunakan mikroskop elektron.Ballan dan Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Grup C lsolat 5 1
asal Babi dan Kera
3.2.7 Elektroforesis SDS-PAGE
Untuk mengetahui pola protein permukaan sel bakteri streptokokus grup C berkapsul dan tidak berkapsul ditakukan elektroforesis SDS-PAGE terhadap ekstrak antigen permukaan sel bakteri.
Ekstraksi antigen dilakukan terhadap sel bakteri yang telah dibiakan pada medium THB selama 18 jam pada suhu 37OC. Suspensi sel dicuci menggunakan PBS 0,?4M dengan prosedur seperti pada percobaan sebelumnya. Setelah pencucian, dilakukan ekstraksi antigen menggunakan larutan yang terdiri dari 0,625 M Tris HCI pH 6,8, 4% sodium dodesil sulfat (SDS), 20% gliserol, 10% 2-merkaptoetanol dan 0,002% biru brom fenol. Suspensi ini dipanaskan pada suhu 95OC selama 5 menit dan supernatannya siap dielektroforesis (Sudarmanto, Pasaribu, Wibawan dan Laemmler, 1996). Prosedur elektroforesis sebagai berikut (Wibawan, 1993) :
Pernbuatan gel pemisah / running gel ( 3 I %) terdiri dari :
1. 3,7 mi akrilamid yang terdiri daii 30% akrilamid dan 0,8% bisakrilamid (Sigma, USA).
2. 3.7 ml akuades .
3. 2,5 ml Larutan 2 M Tris HCI, pH 8,8.
4. 25 LLI larutan 20% SDS.
5. 5 p1 TEMED (tetra metil etilenediamin) (Serva, Germany)
Bahan dan Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Grup C lsolat 52
asal Babi dan Kera
Setelah gel pemisah membeku, disiapkan gel pengumpul (stacking gel) yang terdiri dari :
1. 0,65 rnl akrilarnid (dengan komposisi seperti untuk pembuatan gel pernisah).
2 3 ml akuades
3. 7,25 ml larutan 0.625 M Tris HCI, pH 6.8
4. 25 p1 larutan 20% SDS
5. 5 p1 TEMED (Serva, Germany)
6. 25 p1 larutan amonium persulfat (1 00 mglml akuades)
Untuk preparasi gel pengurnpul dicetak dengan bantuan sisir (comb)
untuk rnembuat sumur-sumur tempat rnemasukkan contoh yang akan dipisahkan. Setelah gel membeku, sisir diangkat. Preparasi contoh mengunakan bufer contoh yang terdiri dari 2,5 ml SDS 20%; 1 rnl Gliserin; 1 ml Tris HCI 0,625 M, pH 6,8; 2,5 ml PMSF (fenil metil sulfonil fluorida) 40 mM; 1,8 g Urea dan 500 p1 biru brom timol. Sebanyak 50 wl contoh dicampur dengan 25 ~1 bufer denaturan yang terdiri dari 80 mg. Tris; 5 rnl gliserol; 500 mg SDS dan 1.25 mi rnerkaptoetanol (kalau perlu dipanaskan pada suhu 80°C selama 5 rnenit untuk denaturasi contoh). Sebanyak 70 pl contoh dirnasukkan ke surnur-surnur yang telah tersedia pada gel. Proses peinisahan protein rnengunakan bufer pemisah (running buffer) yang terdiri dari Tris HCI 0,025 M, glisin 0,192 M dan SDS 0,1% (pH 8,3). Pemisahan
Ballan clan Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Grup C lsolat 53 ass1 Babi dan Kera
dilakukan pada tegangan 200 V dengan suhu karnar selama 60 menit atau jika zat warna contoh telah hampir sarnpai (jangan sarnpai rnelewati) ujung bawah gel pemisah. Sebagai penanda molekul (molecular marker) digunakan campuran a-2 rnakroglobulin (180 kD); p-2 galaktosidase ( 1 16
kD); fruktosa 6-fosfat kinase (84 kD]; piruvat kinase (58 kD); fumarase (48,6 kD); dan laktatdehidrogenase (36,5 kD)
Setelah elektroforesis selesai, gel diwarnai dengan larutan 0,25% biru komasi (Coomassie blue R 250, Serva, Germany) yeng dilarutkan dalam 5 %
metanol dan 7,5 % asam cuka dalam 1 I akuades) Pewarnaan dilakukan selama 2 jam (minimal), setelah itu, gel dipucatkan dengan larutan yang terdiri dari campuran metanol, asam cuka, dan akuades dengan perbandingan : 5 : 4 : 1 sambil digoyang-goyang selama 3 jam.
3.2.8 Uji Aktivitas Biologi lsolat
Uji ini dibagi dalam uji fagositosis bakteri rnenggunakan darah babi secara in vitro dan menggunakan rnencit Balb-C secara in vivo. Selain itu
dilakukan pula pengujian kernampuan pertekatan bakteri pada epitel mukosa buccalis babi.
3.2.8.2 Uji Fagositosis In
vitro
Uji ini rnenggunakan darah babi (sebagai sumber sel polirnorf I PMN) yang diarnbil dari Rurnah Potong Hewan Kotamadya Bogor dengan
Bahan dar? Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Gfup C lsolat 54 asal Babi dan Kera
antikoagulan dinatrium sitrat 3,8% dalam akuades dengan keperluan sebanyak 1 ml untuk 9 ml darah (Jain, 1986). Prosedur isolasi PMN sebagai berikut (Pruzanski, Saito dan Nizzan, 1983; Wibawan dan Laemmler, 1994). :
Ke dalarn tabung reaksi steril diisi 5 rnl larutan ficoll (Pharmacia, Sweden) dingin, kemudian secara perlahan-lahan ke dalam tabung tersebut diisi 5 ml darah babi sehingga terbentuk 2 lapisan. Campuran disentrifus (1 500 g, 15 menit), kemudian supernatan dibuang. Endapan yang terdiri dari eritrosit dan PMN ditambahkan larutan NH&I 0,87% (pH 7,2) dingin sambil dikocok kuat hingga terjadi hemolisis sempurna. Suspensi disentrifus dan dicuci beberapa kali hingga endapan PMN terbebas dari eritrosit. Endapan PMN disuspensikan dalam 1 ml larutan Minimal Essential Medium (MEM). Uji viabilitas sel PMN menggunakan larutan biru tripan 0,4% dalam larutan NaCl 0,81% dan 0,06 % Na2HP04 steril, (Sigma-USA) (Anon., 1997) dan perhitungan lekosit menggunakan hemositometer. Suspensi lekosit disimpan pada suhu dingin untuk pekobaan selanjutnya.
Penentuan jumlah sel bakteri untuk uji fagositosis dilakukan secara spektrofotometrik
( h =
620 nm, transmisi lo%), ini setara dengan 10' sel per ml. Suspensi bakteri dicampur dengan suspensi lekosit dengan perbandingan 1000 : 1 (Wibawan dan Laemmler, 1994), kemudian campuran diinkubasi pada suhu 37'C selama 30 menit.. 'Penentuan parameter fagositosis ialah aktivitas dan kapasitas fagositosis dan dilakukan di bawah mikroskop setelahBahan dan Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Grup C lsolat 5 5
asal Babi dan Kera
sediaan diwarnai dengan Giemsa. Definisi ke dua paramater tersebut ialah :
Aktivitas fagositosis ialah jumlah sel PMN yang rnenelan bakteri per 100
PMN.
Kapasitas fagositosis ialah jumlah bakteri yang ditelan oleh lekosit per 50
PMN yang menunjukkan aktivitas fagositosis (Wibawan, 1993; Wibawan dan Laemrnler, 1994).
Dalam percobaan ini diamati pula pengaruh opsonisasi sel bakteri terhadap aktivitas dan kapasitas fagositosis. Opsonisasi dilakukan menggunakan serum babi sehat secara klinis yang didapat dari Rumah Potong Hewan Kotamadya Bogor. Sebanyak 5 ml suspensi bakteri berkapsul dan tidak berkapsul (masing-masing mengandung
l o 9
sel / ml P8S 0,14 M)disentrifus (10000 G , 10 menit). Pelet dicampur dengan 0 , l
rnl
serum dan dihomogenkan, kemudian diinkubasikan selama 30 menit pada suhu 37'C. Setelah inkubasi, suspensi sel dicuci menggunakan larutan PBS 0,14 M untuk membuang kelebihan serum. Pelet kemudian disuspensikan kernbali seperti sernula ( l o 9 sel / ml PBS), suspensi bakteri teropsonisasi siap digunakan untuk assay fagositosis dengan prosedur seperti di atas.Percobaan lain ialah uji fagositosis
in
vitro menggunakan biakan sel makrofag peritoneal mencit (Kode J-774 dari Justus-Leibig Universitaet Giessen, Germany) digunakan untuk uji. Prosedur pengujian sebagai ber~kutKultur sel makrofag yang telah tumbuh pada coverglass dicampur dengan 100 pl suspensi bakteri
(lo8
sel ! ml) kernudian diinkubasi selama 30 menitBalian dan Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Grup C lsolat 56 asal Babi dan Kera
pada suhu 37' C. Setelah itu dibilas 3 kali dengan MEM, diwarnai dengan akridin orange dan diamati di bawah mikroskop fluoresen menggunakan cahaya biru. Penilaian aktivitas dan kapasitas fagositosis dilakukan seperti percobaan 3.2.8.1.
3.2.8.2 Uji Fagositosis In vivo
Uji ini dilakukan dengan menginokulasikan suspensi bakteri hidup (1 '0 sel per
ml.)
pada mencit Balb-C rute intraperitoneal dengan dosis 0,05 ml. (Watson, 1975; Watson, 1982; Vecht, Wisselink, Dijk dan Smith, 1992). Percobaan dilakukan pada 20 ekor mencit, dimana sepuluh ekor untuk pengamatan 1 jam pasca inokulasi dan sisanya untuk pengamatan 2 jam pasca inokulasi. Digunakan isolat bakteri berkapsul (untuk 5 ekor mencit) dan tidak berkapsul (untuk 5 ekor mencit). Mencit dibunuh dengan menggunakan kloroform, ruang pe;itonealnya dibuka dan dibuat sediaan sentuh (masing-masing 2 sediaan) yang kemudian diwarnai dengan Giemsa (Jain. 1986). Dihitung nilai rata-rata (dari dua pengamatan) aktivitas dan kapasitas fagositosis PMN dan sel makrofag peritoneal mencit.Pengujian lain adalah respon fagositosis
in
vivo pada darah mencit. Pengujian ini sama dengan percobaan 3.2.8.2 di atas, perbedaannya, disini digunakan 10 ekor mencit (5 ekor masing-masing untuk isolat berkapsul dan tidak berkapsul), diamati dan dihitung jumlah lekosit sediaan ulas darah yang diambil dari ekor dengan cara menggunting ujungnya. Disini dilakukan pengamatan sediaan ulas selama 1 , 2, 6, 21 jam dan setelah mencit rnati.Ba17an dan Metoda - Ekspresi fenofip dan Aktivifas Biologi Streptokokus Grup C lsolat 57 asal Babi dan Kera
Sediaan ulas darah diwarnai dengan Giemsa seperti pada percobaan sebelumnya. Dihitung aktivitas dan kapasitas fagositosis PMN dan sel makrofag darah rnencit.
3.2.9 Uji Perlekatan pada Sel lnang
Uji ini menggunakan sel epitel buccalis babi dan kultur sel HeLa.
lsolat yang digunakan ialah isolat berkapsuf dan tidak berkapsul. Prosedur uji ini sebagai berikut (Valentin-Weigand, Chhattwall dan Blobel, 1988a). Epitel buccalis dikerok menggunakan spatula, kemudian disuspensikan dalam PBS dingin dan direndam dalam es batu agar tetap dingin.. Biarkan suspensi epitel selama 30-60 menit agar kotorannya mengendap, kotoran akan berada di bagian paling bawah tabung, sedangkan suspensi epitel berada di atasnya. Dengan pipet perlahan-lahan diambil suspensi dan dipindahkan ke dalam tabung lain yang telah berisi PBS dingin. Hitung jumlah epitel dengan menggunakan hernositometer. Usahakan jurnlah epitel di atas 10' sel per ml. Disiapkan suspensi bakteri berkapsul dan tidak berkapsul yang telah dicuci dan telah dikalibrasi menggunakan spektrofotometer hingga mencapai kepadatan sel sebesar 10' per ml (
X=
620 nm, transmisi 10%).Suspensi epitel dicarnpur dengan suspensi bakteri berkapsul dan tidak berkapsul dengan perbandingan 1 epitel untuk 1000 sel bakteri. Kemudian
Bahan dari Metoda r Ekspresi fenofip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Grup C /Solat 5 8 asal Babi dan Kera
campuran sekitar 0.5 sampai 1 ml. Sambil menunggu, dibuat larutan ficoll 50O/0 dengan cara mencampur 9 bagian ficoll asli (Pharmacia, Sweden) dan I
bagian larutan PBS pekat (30 x atau 1,4 M). Larutan ini dikenal dengan ficoll
isotonik. Satu bagian larutan ficoll isotonik dicampur dengan satu bagian
PBS normal (0,14M) menjadi larutan ficoll 50%. Sebanyak 2 ml larutan ficoll 50% dimasukan ke dalam tabung sentrifus, kemudian perlahan-lahan (melalui dinding tabung) ditambahkan campuran epitel dan bakteri (jangan sampai tercampur), biarkan membentuk dua lapisan. Campuran-disentrifus dengan kekuatan 1000-1 500 G selama 10 menit. Sel epitel dan bakteri yang melekat padanya akan rnengendap, dan suspensi bakteri yang tidak melekat akan terdapat di supernatan. Endapan diambil dengan pipet (perlahan- lahan), jangan sampai supernatan ikut terbawa, kemudian endapan dicuci lagi menggunakan larutan PBS 0,14 M dingin. Endapan dibuat sediaan ulas untuk diwarnai dengan Giemsa. Hitung jumlah bakteri yang melekat pada 40
sel epitel. Dibuat juga sediaan apus epitel yang tidak diinkubasikan oleh S.
equi subsp. zooepidemicus dan diwarnai dengan Giernsa (sebagai kontrol).
Khusus data yang berasal dari epitel buccalis babi dihitung perlekatan berupa indeks perlekatan dengan rurnus :
Jumlah bakteri kokus vana melekat nada e ~ i t e l buccalis babi (Derlakuan]
Ballan clan Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Grup C lsolat 59 asal Babi dan Kera
Percobaan lain ialah mengamati kemampuan bakteri rnelekat pada kultur sel HeLa yang telah ditumbuhkan pada gelas obyek. Kultur sel dilaburkan dengan masing-masing 100 111 suspensi bakteri berkapsul dan tidak berkapsul ( l o 9 sel I ml) yang masing-masing telah dilabel menggunakan larutan 1 rng I ml FlTC (Wibawan et
at.,
1992). Kemudian campuran diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37O C. Setelah inkubasi dilakukan pencucian dengan larutan MEM untuk membuang bakteri yang tidak melekat. Penentuan kernampuan melekat dilakukan dengan menggunakan mikroskop fluoresen untuk mengamati bakteri yang melekat pada 50 sel Hela.3.2.9.1 Pengaruh Perlakuan terhadap Sel Bakteri Berkapsul
Pelet sel bakteri diberi perlakuan dengan pronase (100 unit/ ml MEM) dan hyaluronidase (250 unit / ml MEM) dengan cara mencampur dan dihomogenkan. Campuran kemudian diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37OC. Setelah itu campuran sel bakteri dicuci menggunakan larutan PBS 0,14 M untuk membuang kelebihan pronase dan hyaluronidase. Pelet disuspensikan kembali dalam PBS 0,14 M hingga mengandung
l o 9
sel I ml PBS dan kemudian dilabel menggunakan larutan FlTC seperti pada percobaan 3.2.9 di atas. Pelet disimpan pada suhu dingin untuk perlakuan assay perlekatan pada sel Heta. Assay dilakukan dengan mencampurkan suspensi sel HeLa dan suspensi sel bakteri yang telah diberi perlakuan diBahan dan Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Grup C lsolat 60
asal Babi dan Kera
atas dengan perbandingan 1 : 1000 dan diinkubasikan selama 30 menit pada suhu 37OC. Dihitung jumlah baktert yang melekat pada 50 sel HeLa.
Selain perlakuan di atas, sel bakteri juga diberi perlakuan dengan hyaluronidase (1000 dan 2000 unit I ml MEM) dan diinkubasi selama 60
menit pada suhu 37'C. Setelah tnkubasi sel bakteri dicuci menggunakan larutan PBS 0,14 M untuk membuang kelebihan hyaluronidase dan disuspensikan dalam larutan PBS 0,14 M hingga mencapai konsentrasi
lo9
sel I rnl PBS. Suspensi ini dicampur dengan suspensi sel epitel buccalis babi seperti pada percobaan 3.2.9.1. Dihitung perlekatan berupa indeks perlekatan bakteri pada 40 sel epitel inukosa buccalis babi.3.2.9.2 Pengaruh Perlakuan terhadap Set Epitel
Perlakuan terhadap sel epitel buccalis babi menggunakan bahan kimia yang terdiri dari :
1. Larutan 20 mg / ml N-aseti[ glukosamin (NAG) dalam PBS. 2. Larutan 20 mg I ml asam glukuronat dalam PBS
3. Campuran larutan 1 dan 2.
4. Larutan 20 rng I rnl glukosa dalam-PBS.
5. Larutan asarn hyaluronat 5 mg 1 ml dalam PBS. 6. Larutan asam hyaluronat 10 mg I ml dalam PBS.
Pelet sel epitel diinkubasikan dengan masing-masing larutan di atas pada suhu 37OC selama 60 menit (Esslinger et a/., 1992). Setelah inkubasi,
Bahan dan Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Grup C Isolat 61
as81 Babi dan Kera
campuran dicuci menggunakan larutan
PBS
0,14 M untuk membuang kelebihan bahan kimia di atas. Kemudian dilakukan percobaan perlekatan bakteri seperti pada percobaan 3.2.9.1 sebelumnya. Digunakan bakteri berkapsul (satu isolat berasal dari kera dan dua dari babi) kemudian dihitung indeks perlekatan bakteri pada 40 sel epitel. Percobaan lain dilakukan dengan menginkubasikan kultur set HeLa dengan larutan asam hyaluronat (4mg / rnl MEM) dengan cara melaburkan tarutan asam hyaluronat tersebut pada kultur sel yang melekat di obyek glass dan inkubasi dilakukan selama 30 menit pada suhu 37' C. Setelah itu, suspensi sel dibilas menggunakan larutan MEM (Gibco, USA) dingin dan disimpan pada suhu dingin. Uji kemampuan melekat dilakukan pada kuttur sel HeLa dengan cara menuangkan 0,l ml suspensi bakteri
(lo9
sel / ml) berkapsul yang telah terlabel FlTC dan menginkubasikannya selama 30 menit pada suhu 37' C. Setelah itu, sel HeLa dicuci menggunakan larutan MEM dingin untuk membuang kelebihan bakteri yang tidak melekat. Untuk melihat kemampuan melekat dilakukan di bawah mikroskop fluoresen dan dihitung jumlah bakteri yang melekat pada 50 set HeLa.3.2.10 Analisis Data
Analisis data kuantitatif dilakukan dengan uji t-Student, analisis kehomogenan ragam dan anatisis varians. Jika terdapat perbedaan nyata
Bahan dan Metoda : Ekspresi fenotip dan Aktivitas Biologi Streptokokus Grup C ISOlat 62
asal Babi dan Kera .
(kontras orthogonal) sesuai dengan prosedur menurut Steel dan Torrie
(1 989).
3.2.11 Waktu dan Tempat Penelitian
Pengambilan spesimen kiinik di lakukan di daerah Jembrana-Bali. Penelitian dilakukan di Laboratorium Bakteriologi dan Laboratorium Patologi Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan lnstitut Pertanian Bogor, berlangsung dari bulan Oktober ?994 hingga Oktober 1997.
