VALIDASI METODE SPEKTROFLUOROMETRI UNTUK
PENENTUAN ALFA TOKOFEROL DALAM MINYAK JAGUNG
VALIDATION OF SPECTROFLUOROMETRIC METHOD
FOR DETERMINATION OF ALPHA TOCOPHEROL IN CORN OIL
Leny Irawati*
Jurusan Teknik Kimia, Politeknik Negeri Ujungpandang, Makassar* (email: irawatileny@yahoo.co.id)
Abstrak
Penentuan kadar alfa tokoferol dalam minyak jagung dapat dilakukan dengan metode spektrofluorometri. Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi metode penentuan alfa tokoferol dalam minyak jagung secara spektrofluorometri berdasarkan parameter linieritas, presisi, akurasi, limit deteksi dan limit kuantitasi. Linieritas ditentukan dengan mengukur intensitas fluoresensi standar alfa tokoferol pada rentang 0.5-16 mg/L. Presisi ditentukan dengan menghitung koefisien variasi (%RSD) intra dan antar hari. Akurasi ditentukan berdasarkan hasil perolehan kembali (%Recovery) menggunakan metode spike sampel . Limit Deteksi (LOD) dan Limit Kuantitasi (LOQ) ditentukan dengan mengukur intensitas fluoresensi larutan blanko, dimana LOD = X+3SD dan LOQ= X+10SD. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode linier pada rentang konsentrasi 0,5-16 mg/L dengan koefisien korelasi 0,998, koefisien variasi (%RSD) presisi intra dan antar hari kurang dari 5%, akurasi/recovery 99.48-102.55%, limit deteksi 0.007 mg/L, limit kuantitasi 0.17 mg/L dan konsentrasi alfa tokoferol minyak jagung 38.98 ± 0.02 mg/L. Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa metode spektrofluorometri relatif mudah, sensitif, cepat dan ekonomis untuk penentuan alfa tokoferol dalam minyak jagung.
Kata kunci: Minyak jagung, alfa tokoferol, spektrofluorometri, validasi metode
Abstract
Determination of alpha tocopherol in corn oil can be analyzed by using spectrofluorometric method. This research aimed to validate Spectrofluorometric method for determination of alpha tocopherol in corn oil. The method was based on linierity, precicion, accuracy, limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ). The linierity was dermine by measuring fluoroscens intensity of standar alfa tocopherols in range 0.5-16 mg/L. Precicion was determine from %RSD of intra and interday. Acuracy was determine from recovery of sampel spike method. Limit of Detection (LOD) and Limit of Quantitation (LOQ) was determine from fluorescens intensity of the blank. The result show that the method of spektrofluorometric have a linearity with the correlation coefficient 0.998, %RSD intra and inter-day precicion less than 5%, accuracy/recovery is 99.48-102.55%, LOD 0.007 mg/L, LOQ 0.17 mg/L, and concentration alpha tocopherol in corn oil is 38.98 ± 0.02 mg/L. The proposed spectrofluorometric method is simple, sensitive, fast, and economical for determining alpha tocopherol in corn oil.
Keywords: Corn oil, alpha tocopherol, spectrofluorometric and method validation
1. Pendahuluan
Validasi metode adalah suatu proses yang digunakan untuk mengkonfirmasi bahwa prosedur analisis yang digunakan untuk suatu uji tertentu telah sesuai peruntukannya. Hasil dari validasi metode dapat digunakan untuk menilai kualitas, reliabilitas dan konsistensi hasil analisis. (Kalra, 2011).
Suatu metode analisis yang baku atau standar dapat
adalah metode non-standar, metode yang didisain/dikembangkan oleh laboratorium, metode standar yang digunakan diluar ruang lingkup (rentang) yang ditentukan dan metode standar yang mengalami modifikasi (Arifin, 2013)
Parameter yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis antara lain adalah spesifisitas, akurasi, presisi, limit deteksi, limit kuantitasi, linearitas, rentang dan ketegaran /robustness (ICH, 2005). Dalam melakukan validasi metode analisis, tidak selalu harus mengerjakan semua parameter validasi. Penentuan parameter didasarkan pada kesepakatan antara laboratorium (jika melibatkan lebih dari satu laboratorium), atau berdasarkan pada penilaian yang dilakukan oleh analis yang akan melakukan validasi (Ajay & Rohit, 2012). Vitamin E merupakan antioksidan penting di dalam makanan yang terdapat dalam delapan senyawaan: yaitu alfa (α), beta (β), gamma (γ) dan delta (δ) tokoferol dan α,β,γ dan δ tokotrienol. Alfa tokoferol memiliki aktifitas vitamin E yang paling besar, sedangkan alfa tokotrienol memiliki aktivitas antioksidan yang sangat baik (Cahoom et al., 2003). Sebagai penangkal radikal bebas, vitamin E dipercaya melindungi tubuh dari penyakit generative khususnya penyakit kanker dan jatung (Irakli et al., 2012), penyakit arthritis, penyakit pada hati (liver), proses penuaan, katarak, alzheimer dan atherosclerosis (Hashim et al., 2013). Minyak sayuran (vegetable oils), kacang-kacangan , sayuran hijau dan serealia merupakan sumber utama vitamin E(Cho, et al. 2007). Minyak jagung curah mengandung alfa tokoferol sekitar 0,12%, sedangkan minyak jagung murni mengandung 0.08% alfa tokoferol (Corn Revines Assosiation, 2006).
Untuk menentukan kadar alfa tokoferol dalam makanan dan produk pangan, beberapa metode telah dilakukan antara lain metode kolorimetri, spektrofotometri, kromatografi lapis tipis dan metode fluorometri (Zaman, et al. 2011). Metode tersebut memiliki kekurangan seperti memerlukan waktu
lama, perlu keterampilan dan pengalaman serta presisi yang kecil. Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan metode yang paling umum digunakan untuk identifikasi dan kuantifikasi alfa tokoferol. Metode ini sangat sensitif dan presisi tinggi tetapi memerlukan biaya yang tidak sedikit (Razagui et al., 1992).
Kemampuan alfa tokoferol untuk berfluoresensi digunakan sebagai dasar untuk penentuan secara kuantitatif, dan diaplikasikan untuk menentukan alfa tokoferol dalam sampel matriks biologi menggunakan alat spektrofluorometer pertama kali dilakukan oleh Duggan (1959). Spektrofluorometer juga telah digunakan untuk analisis alfa tokoferol dalam suplemen makanan (Rasagui et al., 1991), pada minyak zaitun (Sikorska et al., 2005) dan pada sediaan farmasi (Hossu, et al., 2009). Keuntungan menggunakan metode fluoresensi adalah lebih cepat, prosedurnya lebih sederhana dan relatif murah dibandingkan metode KCKT (Aoun et al., 2005). Atas dasar penelitian tersebut, penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi metode spektrofluorometri pada penentuan alfa tokoferol minyak jagung. Manfaat penelitian ini adalah memperoleh metode baru untuk analisis alfa tokoferol minyak yang tervalidasi dan dapat digunakan dalam analisis rutin di laboratorium.
2. Metode Penelitian 2.1 Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilakukan di laboratorium analisis pangan Jurusan Teknik Kimia Politeknik Negeri Ujungpandang
.
2.2 Peralatan dan bahan penelitian
Penelitian ini
menggunakan instrumen
2.3.Validasi Metode
2.3.1 Pembuatan larutan standar alfa tokoferol.
Dibuat larutan standar alfa tokoferol dengan konsentrasi 1000 mg/L dengan pelarut n-heksan yang kemudian diencerkan menjadi 100 mg/L. Larutan standar ini kemudian diencerkan menjadi 0.5, 1, 2, 4, 8, dan, 16 mg/L. kemudian dilakukan pengukuran intensitas fluoresensi untuk menentukan linearitas, presisi, akurasi, limit deteksi, dan limit kuantitasi .
2.3.2 Penentuan λ eksitasi dan λ emisi.
Panjang gelombang dengan mengukur Intensitas fluoresensi dari masing-masing konsentrasi larutan standar seri sebanyak lima kali ulangan, kemudian diplot terhadap konsentrasi. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi (R) fluoresensi larutan standar 0.5 -16 mg/L secara intra hari dan antar Recovery dilakukan dengan
menambahkan 1 mg/L, 8 mg/L dan 16 mg/L α-tokoferol standar terhadap sampel minyak jagung . R% = [ ( A – B ) / C ] x 100 A = Konsentrasi spike sampel B = Konsentrasi sampel. C = Konsentrasi spike.
2.3.6 Penentuan Limit deteksi dan Limit kuantitasi.
Limit deteksi dan limit kuantitasi dihitung berdasarkan standar deviasi pembacaan blanko atau standar yang paling dekat dengan blanko.
LOD = X + 3 SD LOQ= X + 10 SD
2.3.7 Pengukuran alfa tokoferol minyak jagung dengan spektrofluorometer.
Sebanyak 1.0 mL sampel minyak jagung dilarutkan dengan n- heksan dalam labu ukur 10 mL, divorteks selama 5 menit, dimasukkan ke dalam kuvet non fluoresensi, lalu diukur intensitas fluoresensinya sebanyak 5 kali ulangan.
3. Hasil dan Pembahasan
Limit Kuantitasi (mg/L) 0.17
Gambar 1. Kurva kalibrasi alfa tokoferol Berdasarkan perhitungan statistik regresi linear diperoleh nilai koefisien korelasi untuk alfa tokoferol yaitu 0,998 dengan persamaan garis y=5,771x+3,082. Hal ini menunjukkan bahwa metode analisis alfa tokoferol menggunakan spektrofluorometer memiliki linieritas yang baik. Linieritas adalah kemampuan ( dalam rentang penggunaan ) dari suatu metode untuk memberikan hasil uji secara proporsional terhadap kepekatan yang ada. Linieritas suatu metode harus diuji untuk membuktikan adanya hubungan yang linier antara konsentrasi analit dan respon alat, selain itu linieritas juga dapat digunakan untuk mengetahui kemampuan standar dalam mendeteksi analit dalam contoh. Dalam pelaksanaannya linieritas
dapat ditetapkan dengan
menggunakan minimal lima sampel dengan memperhitungkan rentang konsentrasi yang diberikan. Linieritas atau kecenderungan korelasi antara dua variabel (konsentrasi dan absorbansi) biasanya dinyatakan dalam koefisien korelasi (r) yang dapat dihitung secara statistika. Linieritas yang baik ditunjukan dengan harga r yang mendekati satu. Nilai koefisien korelasi yang memenuhi persyaratan menurut ICH (1995) adalah lebih besar dari 0.9970.
Presisi adalah kedekatan beberapa nilai pengukuran dari sampel yang sama dan diuji secara berurutan. Menurut metode ICH , presisi terbagi tiga yaitu repibilitas, presisi antara (intermadiate precision) dan reproduksibilitas. Pada penelitian ini yang digunakan adalah repibilitas dan salah satu bagian dari presisi antara yaitu perbedaan hari. Repibilitas dinyatakan sebagai hasil presisi pada perlakuan yang sama (analis dan alat yang sama) dalam interval waktu pemeriksaan yang singkat. Pada penentuan presisi intra hari, yaitu pengukuran sebanyak lima kali ulangan pada hari yang sama dipeoleh nilai RSD < 5, demikian pula pada penentuan presisi antar hari, yaitu pengukuran selama lima hari berturut-turut juga diperoleh nilai RSD <5, yang berarti metode memiliki ketelitian yang cukup baik.
Akurasi merupakan ukuran ketepatan dari suatu metode pengujian, atau kedekatan antara nilai hasil uji yang diukur dan nilai benar, atau nilai konvensional atau nilai acuan yang dapat diterima. Pada penelitian ini, akurasi diukur dengan metode adisi standar. Sampel sejumlah 1 mL yang telah diencerkan dengan n- heksan diukur intensitas fluoresensinya dan diadisi dengan standar 1, 8 dan 16 mg/L yang juga telah diukur intensitas fluoresensinya. Intensitas fluoresensi spike sampel diukur lalu dihitung % recovery. Mean Recovery untuk konsentrasi bawah sebesar 102.5 %, untuk konsentrasi tengah sebesar 100.5 % dan untuk konsentrasi atas sebesar 99.4 %. Hasil yang diperoleh masih memenuhi kriteria pengukuran recovery yaitu 95-110%..
metode spektrofluorometri memiliki sensitifitas yang tinggi. Berbeda dengan pengukuran absorbsi, emisi foton dideteksi pada saat kembali ke keadaan dasar mengakibatkan spektroskopi fluoresensi memiliki sensitifitas yang sangat tinggi, 100-1000 kali lebih tinggi dibandingkan teknik absorbsi sehingga dapat mengukur konsentrasi rendah hingga ppb ( Sikorska et al., 2012).
Pada pengukuran alfa tokoferol minyak jagung, sampel dilarutkan dengan pelarut n-heksan dan langsung diukur intensitas fluoresensinya sehingga tidak memerlukan waktu lama dan lebih ekonomis jika dibandingkan dengan metode Kromatografi Gas ataupun Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Dari hasil pengukuran dan perhitungan diketahui bahwa konsentrasi alfa tokoferol dalam minyak jagung adalah 38.98 ± 0.02 mg/L.
4. Kesimpulan
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa metode spektrofluorometri untuk penentuan alfa tokoferol minyak jagung telah tervalidasi dengan baik. Metode ini relatif mudah, sensitif, cepat, ekonomis sehingga dapat digunakan untuk analisis rutin di laboratorium.
5. Ucapan Terima kasih
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ketua Jurusan Teknik Kimia Politeknik Negeri Ujungpandang, Bapak Wahyu Budi Utomo, M.Sc dan Kepala Laboratorium Analisis Pangan, Bapak Ir. Zulmanwardi, M.Si yang telah memberi kesempatan seluas-luasnya kepada penulis untuk melakukan penelitian diantara tugas rutin sehari-hari.
6. Daftar Pustaka
Ajay, S., Rohit, S., (2012). Validation Of Analytical Procedur: A Comparison Of ICH Vs Pharmacopoeia (USP) Vs FDA. International Journal Of Pharmacy. 3 (6) :39 – 42.
Aoun, E., Rima, J., Chidiac, G., Hanna, K. (2005). High-Performance Liquid
Chromatographic and
Spectrofluorometric Determination of Tocopherol in a Natural Plant Ferula Hermonis (Zalooh root). J Food and Comp Anal. 18: 607-615
Arifin, Z. (2013). Validasi Metode Analisis dan Verifikasinya Secara HPLC.
http://www.zonazaenal.wordpress.com/ 2011/01/02/verifikasi-metode-analisis-secara-hplc/ diakses 12 Juni 2014 Cho, I.K., Rima, J., Chang, C.L., Qing X, L.
(2007). Spectrofluorometric and High Performance Liquid Chromatograhic Determination of all-rac- α -tocopheryl acetat in Virgin Olive Oil. J Food and Comp Anal 20: 57-62.
Corn Revines Association. (2006). Corn Oil. 5th Edition. Washington DC. Available from www.corn.org. Diakses 09 Juli 2014.
Cahoom, E.B., Hall, S.E..,Ripp.K.G., Ganzle, T.S., Hitz, W.D., Coughlan, S.J. (2003). Metabolic redesign of vitamin E biosynthesis in plants for tocotrienol production and increased antioxidant content. Nat Biotechnol 21, 1082-1087. Hashim S, F.A. Aisha A, Abdul Majid A, Ismail Z.(2013). A Validated RP-HPLC Method for Quantification of Alpha-tocopherol in Elaeis guineensis Leaf Extracts.WebmedCentral
Pharmaceutical Science. 4(7). Diakses 09 Juli 2014. Available from: http://www.webmedcentral.com/article _view/4275
Hossu, A.M., Maria, M.F., Stoica, A., Ilie, M. and Iordan, M. (2009). Determination of Tocopherol in Oil Pharmaceutical By Using Spectrofluorimetry and Method Validation. Ovidus University Annals of Chemistry. 20: 53-56.
Irakli, Maria N., Victoria F Samanidou, and Ioannis. Papadoyannis. (2012). Optimization and Validation of the Reserved-Phase High-Performance Liquid Chromatography with Fluoresence Detection Method for the Separation of Tocopherol and Tocotrienol Isomers in Cereals, Employing a Novel Sorbent Material. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 : 2076-2082.
Methodology Q2(R1) [terhubung berkala]. www.ich.org. [09 Juli 2014]. Kalra, K. (2011). Method Development and
Validation of Analytical Procedures, Quality Control Of Herbal Medicines and Related Areas. Intech. Available from http://www.intechopen.com/ diakses 09 Juli 2014.
Razagui, I.B., Barlow, P.J., and Taylor, Keith D.A.(1992).Spectrofluorimetric Procedure for Determination of α -tocopherol in Nutritional Supplement products .Food Chem. 44: 221-226
Sikorska, E., Khmelinskii, I and Sikorski, M. (2012). Analysis Of Oil by Fluorescence Spectroscopy, Methods and Aplication. Available From: http://www.intechopen.com Diakses 09 Juli 2014.
