SCIENTIA
Jurnal Farmasi dan Kesehatan
Diterbitkan oleh STIFI Perintis Padang setiap bulan Februari dan Agustus
Website : http://www.jurnalscientia.org/index.php/scientia
7 (2) ; 151 – 158, 2017
UJI EFEK TERATOGENIK EKSTRAK ETANOL DAUN WUNGU
(Graptophyllum pictum (L.) Griff) PADA MENCIT PUTIH
Hilmarni, Uri Rahmawati, dan Riki Ranova
Akademi Farmasi Imam Bonjol Bukittinggi Email : [email protected]
ABSTRAK
Daun wungu (Graptophyllumpictum(L.) Griff) merupakan salah satu tanaman obat yang memiliki aktifitas farmakologis sebagai antidiabetes, antioksidan dan estrogenik. Untuk melihat keamanan daun wungu, telah dilakukan penelitian tentang uji efek teratogenik ekstrak daun wungu terhadap mencit putih. Hewan uji yang telah hamil diberikan ekstrak daun wungu secara oral pada hari ke-6 sampai hari ke-15 kehamilan dengan dosis yang digunakan adalah 50, 150 dan 450 mg/KgBB. Pada hari ke 18 kehamilan, mencit dibunuh dengan cara dislokasi leher, kemudian dilakukan laparaktomi untuk mengeluarkan fetusnya. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak daun wungu pada dosis yang digunakan tidak mempengaruhi berat badan induk mencit secara nyata. Pengamatan secara makroskopis terdapat tapak resorpsi, fetus lambat pertumbuhan dan fetus mengalami celah pada langit. Namun demikian, potensi teratogen dari ekstrak wungu belum dapat dipastikan karena adanya kerentanan spesies.
Kata Kunci : Ekstrak daun wungu, Teratogenik, Mencit putih
ABSTRACT
Graptophyllumpictum (L.) Griff is one of the medicinal plants which have pharmacological activity as an antidiabetic, antioxidant and estrogenic. To view the safety of Graptophyllum pictum, has been done research on the teratogenic effect of test extract Graptophyllum pictum against white mice. Animal tests that have been pregnant were given wungu extract orally on day 6 to day 15 of pregnancy with doses used were 50, 150 and 450 mg /kg. On day 18 of pregnancy, mices were killed by cervical dislocation, then did laparaktomi to remove the fetus. The result showed wungu extract at used doses did not affect the parent body weight of mice significantly. Macroscopic observations showed resorption sites, retarded growth fetuses and cleft palate were found on fetus. However, the teratogenic potential of wungu extract could not be ascertained because of the vulnerability of the species.
Keywords : Wungu extract, teratogenic, white mice
PENDAHULUAN Teratogenik merupakan
perkembangan tidak normal pada embrio dan penyebab cacat bawaan atau kelainan
waktu lahir (Almahdy, 2010). Kelainan ini diketahui penyebab utama morbiditas serta mortalitas pada bayi baru lahir. Kelainan yang ditimbulkan salah satunya seperti gangguan pertumbuhan tulang, cacat wajah, bibir dan langit-langit sumbing (Lu, 1995). Pada umumnya efek teratogenik disebabkan oleh obat-obatan yang digunakan wanita hamil dapat melewati plasenta serta memberikan pemaparan pada embrio dan janin yang tumbuh (Katzung, 1998).
Selain dari obat-obat kimia penggunaan beberapa jenis tanaman obat juga mempunyai efek samping yang mungkin membahayakan dan dapat menimbulkan efek teratogen (Handayani, 2003). Beberapa penelitian yang telah dilakukan terhadap infusa daun pegagan yang menunjukkan efek pada mencit yang berupa cacat fisik dan kekerdilan pada janin (Anfiandi, 2013). Penelitian lain juga menunjukkan bahwa ekstrak mahkota dewa (Widyastuty dkk., 2006) dan ekstrak mengkudu dapat menyebabkan cacat pada tubuh fetus (Anggadiredja dkk., 2006).
Daun wungu
(Graptophyllumpictum(L.) Griff) merupakan salah satu tanaman obat yang banyak digunakan masyarakat. Di Sumatera Barat tanaman ini digunakan untuk pengobatan wasir dengan cara minum air rebusan daun wungu sekali sehari setiap pagi secara teratur. Sedangkan di Pulau Jawa tanaman ini juga digunakan untuk pengobatan wasir, pembengkakan, nyeri, pendarahan, pencahar dan panas dalam (Trubus, 2002).
Dari penelusuran literatur daun wungu mengandung senyawa golongan tanin, flavonoid, saponin, steroid, antosianin dan leukoantosianin (Isnawati dkk., 2003). Dari penelitan juga diketahui ekstrak daun wungu mempunyai aktivitas efek estrogenik (Suhargo, 2005), aktivitas antidiabetes (Irwan, 2011), aktivitas antioksidan (Winata, 2011) dan belum ditemukan adanya uji efek teratogen dari daun wungu.
Dilakukan uji teratogenik dengan parameter yang diamati meliputi kelainan langit-langit dan bentuk morfologis fetus. Pada pengujian ini akan dilihat pengaruh
pemberian ekstrak daun wungu pada mencit betina pada masa kritis kehamilan dan melihat perngaruhnya terhadap pertumbuhan fetus mencit.
METODOLOGI PENELITIAN Alat
Alat yang digunakan adalah timbangan hewan, timbangan analitis, kandang mencit, alat-alat bedah, jarum oral, alat injeksi, wadah perendaman fetus, kaca pembesar, gelas ukur, spatel, batang pengaduk, pipet tetes dan oven.
Bahan
Daun wungu, larutan Bouin’s (formaldehid 14%, asam asetat glacial, asam pikrat jenuh), etanol destilasi, air suling, kloroform, amoniak, asam sulfat, mayer, asam anhidrat, FeCl3, serbuk Mg
dan HCl pekat, serta hewan uji yang digunakan adalah mencit putih betina berumur lebih kurang 2 bulan dan berat 20 – 30 gram. Serta belum pernah digunakan untuk percobaan (Akbar, 2010).
Tahapan Penelitian a. Penyiapan ekstrak
Daun wungu (Graptophyllum pictum(L.) segar diambil di Kebun Tanaman Obat Universitas andalas kemudian dikering anginkan dan ditimbang sebanyak 900 g, selanjutnya dirajang halus. Setelah itu diekstraksi dengan metode maserasi dimana sampel dimasukkan kedalam wadah yang tertutup baik dan terlindung cahaya lalu ditambahkan etanol destilasi sampai sampel terendam sempurna, di biarkan selama 3 hari dengan diaduk setiap hari, saring dan ganti pelarut yang baru dilakukan pengulangan 3 kali. Hasil maserasi digabung dan diuapkan secara vacuo dengan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental. Susut pengeringan ditentukan dengan metoda oven.
b. Penyiapan Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang digunakan adalah mencit putih betina yang berumur lebih kurang 2 bulan dan diaklimatisasi selama 10 hari. Pengawinan hewan
dilakukan pada masa estrus, jika ditemukan sumbat vagina mencit dianggap berada kehamilan hari ke-0 (Manson et al.,1982). c. Prosedur Uji Teratogen
Mencit dikelompokan menjadi 4 kelompok yang masing- masingnya terdiri dari 5 ekor. Kelompok perlakuan kontrol diberi aqua destilata, sedangkan kelompok perlakuan uji diberikan ekstrak wungu dengan dosis 50, 150, dan 450 mg/KgBB/hari. Sediaan uji diberikan mulai pada hari ke 6-15 kehamilan.
Pada hari ke 18 kehamilan, mencit dibunuh dengan cara dislokasi leher, kemudian dilakukan laparaktomi untuk mengeluarkan fetusnya. Selanjutnya diamati apakah ada resorpsi yang ditandai dengan adanya gumpalan merah sebagai bekas tempat tertanamnya fetus. Fetus yang sudah dikeluarkan di tekan hati-hati, untuk mengetahui hidup atau matinya fetus tersebut. Fetus yang hidup akan memberikan respon gerakan bila ditekan, sedangkan fetus yang mati tidak memberikan respon yang demikian. Fetus yang hidup dan yang mati pada masing-masing tanduk uterus dijumlahkan terlebih dahulu kemudian masing-masing fetus dikeringkan dengan kertas tisu, timbang berat fetus untuk mengetahui berat rata-rata kelahiran. Sepertiga jumlah fetus dari satu induk difiksasi dengan larutan Bouin’s selama empat belas hari sampai berwarna kuning dan keras, kemudian fetus dikeringkan, diperiksa bagian luar fetus meliputi telinga, mata, kaki dan ekor. Semua hasil pengamatan dibandingkan dengan kontrol.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Sediaan uji yang digunakan pada penelitian ini adalah ekstrak etanol daun wungu (Graptophyllum pictum (L) Griff). Dari pemeriksaan organoleptis, didapatkan ekstrak dengan bentuk ekstrak kental, berbau khas, dengan warna hijau pekat dan berasa pahit. Susut pengeringan ekstrak etanol daun wungu adalah 15,70%. Susut pengeringan menunjukan jumlah bagian yang mudah menguap serta air yang hilang selama pemanasan. Susut pengeringan
ditetapkan untuk memberikan batasan maksimal banyaknya senyawa yang hilang pada proses pengeringan. Hasil uji pendahuluan skrining fitokimia daun wungu positif fenolik, flavonoid, saponin dan steroid.
Hewan percobaan yang digunakan adalah mencit betina putih yang sehat dan memiliki daur estrus yang teratur yakni 4-5 hari. Penggunaan mencit putih mempunyai beberapa keuntungan seperti waktu kehamilannya yang singkat, jumlah fetusnya yang banyak, pemeliharaannya mudah, harga relatif murah dan juga memiliki fisiologi reproduktif yang mirip dengan manusia yaitu memiliki sistem plasenta yang berfungsi sebagai membran barier terhadap masuknya zat-zat asing dari tubuh induk ke janin. Selain itu dalam beberapa penelitian menyebutkan bahwa mencit lebih rentan terhadap teratogen dibandingkan hewan lainnya (Lu, 1995; Wilson et al, 1975)
Sebelum perlakuan, mencit diaklimatisasi terlebih dahulu selama kurang lebih 10 hari untuk membiasakan hewan berada dalam lingkungan percobaan dan menghindari hewan percobaan mengalami stres yang dapat mempengaruhi data. Selama aklimatisasi diamati daur estrus. Pengamatan daur estrus dilakukan secara visual dimana vagina mencit betina yang berada dalam fase estrus akan berwarna merah muda dan tampak basah. Selain itu juga dilakukan penimbangan berat badan dan pengamatan tingkah laku. Hewan yang sehat berdasarkan farmakope Indonesia edisi III adalah tidak mengalami perubahan berat badan lebih dari 10 % dan selama pemeliharaan menunjukan perilaku normal.
Pengujian teratogenik dilakukan dengan metoda in vivo. Metoda pengujian teratogenitas dapat dilakukan dengan beberapa metoda : (1) In ovo, dimana sediaan uji disuntikan pada bagian kuning telur yang fertil kemudian selanjutnya telur diinkubasikan. Pengamatan efek dilakukan setelah pertumbuhan embrio sempurna. Kelebihan metoda ini yaitu dapat dilakukan dalam jumlah yang banyak dan sederhana pengerjaannya, namun hasil yang didapat tidak bisa dianalogkan begitu saja pada
manusia. (2) In vitro, dilakukan dengan pemberian sediaan uji pada biakan embrio yang dibuat pada tempat yang dikondisikan menyerupai keadaan rahim selama masa kehamilan. Kelebihan metoda Ini adalah dapat dilakukan dalan jumlah yang lebih banyak dan dalam waktu yang singkat. Kekurangannya sama dengan in ovo. (3) In vivo, sediaan uji langsung disuntikan pada hewan percobaan yang hamil pada masa organogenesis. Hewan percobaan digunakan dapat berupa rodensia atau primata. Kelebihan metoda ini yaitu proses yang terjadi dapat dianalogkan dengan proses yang terjadi pada manusia, sedangkan kekurangannya adalah memakan waktu yang lama (Anita dkk, 1995).
Pemberian sediaan uji ekstrak daun wungu terhadap mencit secara oral selama periode kritis kehamilan, yaitu hari ke-6 sampai hari ke-15 kehamilan terjadi peningkatan presentase kenaikan berat badan induk mencit bila di bandingkan dengan kontrol yang terlihat pada grafik kenaikan berat badan induk mencit (Gambar 1). Periode kritis selama kehamilan pada perkembangan manusia dapat dibagi dalam periode embrionik dan periode perkembangan fetus. Selama fase awal, dua minggu pertama, proliferasi sel berlangsung dengan cepat. Sejumlah hasil pembagian sel ini memiliki potensial yang berbeda, tergantung pada posisi relatif masa embrionik. Proses ini umumnya tidak terganggu oleh senyawa-senyawa teratogenik kecuali beberapa kerusakan yang dapat mematikan embrio. Selama periode embrionik cacat morfologis dapat terjadi (Drew, 1996).
Pertumbuhan awal, pertumbuhan sejak zigot mengalami pembelahan berulang kali sampai saat embrio memiliki bentuk primitif. Pada periode ini terdapat kerawanan terhadap embrio tetapi jarang menyebabkan teratogenitas. Pada fase tersebut masih terdapat suatu sifat totipotensi masing-masing bakal organ. Periode praimplantasi diikuti oleh periode embrionik dan saat itu terjadi fase embriogenesis, pada manusia pada minggu ke-3 sampai minggu ke-8 dan hari ke-7 sampai ke-16 pada rodensia. Periode organogenesis ditandai oleh adanya migrasi dan asosiasi sel dan jaringan menjadi organ rudimen (Drew,1996).
Harbinson (2001) telah mengamati periode kritis kehamilan mengunakan senyawa uji rubratoksin terhadap mencit dan berkesimpulan bahwa periode kritis pada mencit dengan lama kehamilan 19 hari adalah hari ke-6 sampai hari ke-15 kehamilan. Pada manusia periode kritis adalah pada fase diferensiasi organ yaitu pada hari ke-21 kehamilan sampai ke-56 hari kehamilan (trimester pertama).
Kenaikan berat badan mencit disebabkan karena berkembangnya fetus dan bertambahnya volume cairan amnion, plasenta serta selaput amnion (Almahdy dkk, 2007). Pada dosis 50 mg/KgBB terjadi penurunan berat badan yang cukup drastis pada hari ke-15 kehamilan, hal ini disebabkan karena terjadinya aborsi spontan pada salah salah satu induk mencit. Aborsi spontan ini bisa saja terjadi karena kerentanan genetik pada individu mencit walaupun dari satu anakan yang sama (Aloomis, 1994).
Tabel I. Pertambahan Berat Badan Induk Mencit Selama Kehamilan No.Mencit Rata-rata berat badan Induk Mencit (g)
Kontol (-) 50mg/KgBB 150mg/KgBB 450mg/KgBB 1 14 17 11 13 2 16 11 10 10 3 16 19 22 12 4 20 14 16 18 5 18 - 16 16 ∑X 84 61 75 69 ±SD 16.8±2.28 15.2±3.5 15±4.79 13.8±3.19
Gambar 1. Grafik kenaikan rata-rata berat badan induk mencit selama kehamilan pada tiap kelompok dosis
Pengamatan terhadap rata-rata jumlah fetus mencit pada kelompok dosis 150 mg/KgBB terjadi penurunan jumlah fetus bila dibandingkan dengan kelompok kontrol. Dari hasil perhitungan statistik menunjukkan pemberian ekstrak daun wungu tidak mempengaruhi jumlah fetus mencit secara bermakna (p>0,05). Pengamatan terhadap berat rata-rata fetus adalah 1,072 gram, pada kelompok dosis 50
mg/KgBB mencit adalah 0,947 gram, pada kelompok 150 mg/KgBB mencit adalah 1,172 gram serta pada kelompok 450mg/KgBB mencit adalah 1,195 gram. Berdasarkan perhitungan statistik pemberian ekstrak daun wungu tidak mempengaruhi berat rata-rata secara bermakna(p>0,05).
Tabel II. Rata-rata berat badan fetus mencit setelah dilaparaktomi pada hari ke 18 kehamilan. No.Mencit Rata-rata berat badan fetus (g)
Kontrol (-) 50 mg/KgBB 150 mg/KgBB 450 mg/KgBB 1 0,725 1,170 0,768 1,159 2 1,003 1,009 1,040 0,929 3 1,274 1,365 1,297 1,203 4 1,204 1,190 1,285 1,350 5 1,156 * 1,471 1,333 ∑X 5,362 4,734 5,861 5,974 ±SD 1,072±0,04 0,947±0,11 1,172±0,05 1,195±0,03 *Induk mencit aborsi spontan pada hari ke-17 kehamilan
Pengamatan secara mikroskopis menunjukkan adanya 3 tapak resorpsi dan 1 fetus lambat pertumbuhan saat dilaparaktomi pada kelompok kontrol, 1 fetus lambat pertumbuhan pada kelompok 50 mg/KgBB mencit dan 5 tapak resorpsi dan 1 lambat pertumbuhan pada kelompok 150 mg/KgBB. Sedangkan untuk kelompok dosis 450 mg/KgBB mencit tidak ditemukan adanya tapak resorpsi dan
lambat pertumbuhan pada fetus. Pengamatan terhadap fetus yang direndam dalam larutan Bouin’s ditemukan 1 fetus ada celah langit-langit pada kelompok dosis 150mg/ KgBB mencit.
Fetus mencit yang direndam dengan larutan Bouin’s akan keras dan berwarna kuning serta dapat digunakan untuk mengamati tubuh bagian luar dan visceral. Formaldehid dan asam asetat yang
terdapat didalam larutan Bouin’s akan mengawetkan jaringan embrio. Proses kimiawi yang terjadi dalam hal ini bersifat komplek dan belum dimengerti sepenuhnya. Sedangkan asam pikrat akan mewarnai fetus mencit sehingga berwarna kuning dan lebih mudah diamati. Parameter yang diamati antara lain kelopak mata, daun telinga, ekor, kaki dan jari-jari kaki, serta celah pada langit-langit. Jenis cacat yang terjadi tergantung pada periode pertumbuhan, karena tidak semua organ rentan pada saat yang sama dari suatu kehamilan. Umumnya embrio mencit rentan pada hari ke-8 sampai hari ke-12 kehamilan (Almahdy, 2010; Manson 1982).
Lambat pertumbuhan pada fetus diduga adanya faktor kerentanan genetik (kepekaan) dari fetus tersebut sebagai individu terhadap senyawa yang terkandung pada ekstrak daun wungu. Adanya tapak resorpsi berupa gumpalan merah yang tertanam pada uterus disebabkan pengaruh pemberian ekstrak daun wungu pada masa organogenesis. Pada masa ini tidak terdapat lagi sifat totipotensi sehingga tidak bisa memperbaiki kerusakan jaringan dan tidak bisa berkembang sehingga fetus mati (Almahdy dkk., 2007).
Gambar 2. Foto fetus setelah laparaktomi A : Tapak resorpsi; B: Fetus yang mengalami lambat pertumbuhan dibandingkan dengan fetus normal C: Fetus yang mengalami cleft palate.
Satu ekor fetus pada kelompol 150 mg/KgBB mencit ditemukan celah langi-langit. Terjadinya celah langit-langit diduga pemberian ekstrak daun wungu mempengaruhi pembentukan palate. Namun demikian, potensi teratogenik ekstrak daun wungu ini masih belum dapat dipastikan karena adanya kerentanan antar spesies dan kerentanan antar spesies walaupun berasal dari induk yang sama (Harbinson, 2001). Disamping itu cacat bawaan selain disebabkan faktor genetik juga di sebabkan faktor lain seperti lingkungan atau infeksi tertentu.
Cacat dapat terjadi pada janin induk yang kena penyakit infeksi terutama virus. Diantaranya penyakit infeksi campak jerman yang disebabkan oleh rubella, kasus ini mempengaruhi mata, jantung, telinga dan langit-langit, sehingga dikenal istilah sindroma rubella ; kelainan mata, jantung,
tuli waktu lahir. CMV (Citomegalovirus) yang menginfeksi ibu yang sedang hamil, bayinya akan jadi tuli, kelainan hati dan keterbelakangan mental. Toksoplasmosis dan sipilis juga dapat menimbulkan cacat pada janin seperti buta, tuli, gangguan jantung, microphtalmia (mata kecil), microcephaly (otak kecil), hydrocepalus (penimbunan cairan otak) dan keterbelakangan mental.
Berbagai macam obat yang diminum ibu pada waktu hamil juga dapat menimbulkan cacat pada janinnya, contoh obat terkenal yang menimbulkan cacat ialah : Thalidomid, untuk obat penenang dan pusing, jika ibu meminumnya ketika hamil muda maka janinnya memiliki anggota badan yang pendek. Aminopterin, antagonis terhadap asam folat, dipakai untuk menggugurkan janin, tapi jika gagal bersifat teratogen.
Ibu hamil yang diradiasi sinar-X (untuk terapi dan diagnosa) ada yang melahirkan bayi cacat pada otak. Ibu yang defisiensi vitamin atau hormon dapat menimbulkan cacat pada janin yang dikandung, seperti defisiensi vitamin A menyebabkan cacat pada mata. Selain itu, sumbing dan celah pada langi-langit, dapat disebabkan oleh emosi ibu bila terjadi pada minggu 7 sampai 10 kehamilan. Stres psikis ibu membuat cortex adrenal hiperaktif sehingga produksi hidrokortison menjadi tinggi. Hormon ini, dari hasil eksperimen pada mencit mengiduksi terjadinya celah pada langit-langit (Cunningham dkk, 1995)
KESIMPULAN
Dari uji teratogenitas ekstrak daun wungu yang dilakukan dapat diambil kesimpulan bahwa efek teratogenik yang ditemukan pada sejumlah fetus berupa lambat pertumbuhan, tapak resorpsi dan 1 fetus terdapat celah pada langit-langit. Namun demikian, potensi teratogenik ekstrak daun wungu ini masih belum dapat dipastikan karena adanya kerentanan antar spesies.
DAFTAR PUSTAKA
Akbar, B., 2010, Tumbuhan dengan Kandungan Senyawa Aktif yang Berpotensi Sebagai Bahan Antifertilisasi, edisi I, Adabia press, Jakarta.
Almahdy, A., 2010, Teratogenik Sebuah Perspektif Toksisitas yang Terabaikan, Universitas Andalas, Padang.
Almahdy, A., Delvita, V & Arifin, H ., 2007, Pengaruh Pemberian Vitamin C Terhadap Fetus pada Mencit Diabetes, Jurnal Sain dan Teknologi Farmasi (12)1 32-40. Aloomis, T., 1994, Toksikologi Dasar,
Edisi III, Alih Bahasa Oleh Imono Argo Donatus, Penerbit UGM, Yogyakarta.
Anita, K., V. Mehta, U. Gupta, S. Prabhu & J. S. Bapha, 1995, Method for
Teratogenicity Testing-Exiting and Future models, Indian Journal of Phamacology, 27, 204-213.
Anggadiredja, K., Sukandar, E.Y & Santosa, S., 2006, Studi Efek Teratogenik Ekstrak Buah Mengkudu (Morinda citrifolia) pada Tikus Wistar Putih, Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung & Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha. Cunningham.F.G., N.F. Gant, K.J.Leveno,
1995, Obstetri Williams, edisi 18, alih bahasa Joko Suyono dan Andry Hartono, Penerbit Buku Kedokteran, EGC, Jakarta.
Drew, U., 1996, Atlas Berwarna dan Test Embriologi, Alih Bahasa oleh Hendra Laksman, Penerbit Hipokrates, Jakarta.
Harbinson, R.D. 2001. The basic science of poison cassaret and doull’s toxicology. New York.
Handayani, L., 2003, Tanaman Obat untuk Masa Kehamilan & Pasca-Melahirka, Argomedia Pustaka, Jakarta.
Irwan, F., 2011, Aktivitas Antidiabetes dan Analisis Fitokimia Ekstrak Air dan
Etanol Daun Wungu
(Graptophyllum pictum (L.) Griff), Skripsi, Institut Pertanian Bogor. Isnawati, A & Soediro, I., 2003,
Pemeriksaan Senyawa-Senyawa Turunan Fenol Daun Handeuleum (Graptophyllum pictum (L.) Griff, Media Litbang Kesehatan.
Lu, F. C., 1995, Toksikologi Dasar, Asas, Organ Sasaran dan Penilaian Resiko, edisi II, Alih Bahasa oleh Edi Nugroho, Penerbit Universitas Indonesia press, Jakarta.
Manson, J.M., H. Zenick, R.D. Costlow, 1982, Teratology test methods for laboratory animals. New York : Ravent Press.
Suhargo, L., 2005, Efek Estogenik Ekstrak Daun Handeuleum (Graptophyllum pictum (L.) Griff.) pada Histologi Uterus Mencit Betina Ovariektomi, Jurnal Biologi FMIPA Universitas Airlangga.
Trubus, R., 2002, Seri Pengalaman Obat Tradisional Sembuhkan Mereka, Redaksi Trubus, Jakarta.
Widyastuti, N., Widiyani, T & Listyawati, S., 2006, Efek Teratogenik Ekstrak Buah Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.) padaTikus Putih (Rattus noroegicus L.) Galur Winstar, Bioteknologi 3(2) : 56-62, Universitas Sebelas Maret, Surakarta.
Wilson, J. G., and J. Warkany, 1975, Teratology Principle and Techniques, University of Chicago Press, Chicago.
Winata, H., 2011, Aktivitas Antioksidan dan Kandungan Kimiawi Ekstrak Daun Wungu (Graptophyllum pictum (L.) Griff.), Skripsi, Institut Pertanian Bogor.
