ISOLASI KAPANG ENDOFIT DAN UJI AKTIVITAS
PENGHAMBATAN ENZIM ALFA-GLUKOSIDASE
HASIL BIOPRODUKSI METABOLIT SEKUNDER KAPANG ENDOFIT
DARI DAUN DAN UMBI BAWANG DAYAK
(Eleutherine americana (Aubl)Merr)
Djuffi Nelwan, Shirly Kumala, Ros Sumarny.
Program Studi Fakultas Farmasi Universitas Pancasila
Email:
juffi_nelwan@yahoo.com
Abstrak
Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup di dalam tumbuhan dan bersimbiosis dengan tumbuhan inang tersebut, mikroba endofit diketahui memiliki kemampuan untuk menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang sesuai dengan tumbuhan inangnya. Dari penelitian sebelumnya telah diketahui bahwa ekstrak umbi tanaman bawang dayak (Eleutherine americana(Aubl.)Merr) memiliki aktivitas inhibitor α-glukosidase. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi kapang endofit dari daun dan umbi tanaman (Eleutherine americana(Aubl.)Merr.) dan menguji potensi inhibitor α-glukosidase dari metabolit sekunder isolat kapang endofit yang diperoleh. Kapang endofit dari daun dan umbi tanaman (Eleutherine americana(Aubl.)Merr.) ditumbuhkan dengan metode tanam langsung menggunakan media PDA. Kemudian dilakukan pengamatan morfologi terhadap kapang endofit secara makroskopik (visual) dan mikroskopik (slide culture) dan diperoleh 5 isolat tunggal. Kelima isolat kemudian difermentasi menggunakan media PDY selama 14 hari. Hasil fermentasi kemudian diekstraksi menggunakan etilasetat. Ekstrak kasar yang diperoleh dari pelarut etil asetat dilakukan uji aktivitas inhibitor α-glukosidase dengan metode Microplate reader dengan akarbose sebagai pembanding. Dari hasil penelitian diperoleh aktivitas inhibitor tertinggi adalah isolat d.E.a 1 dengan nilai IC50 196,22 bpj.
Sedangkan, akarbose sebagai pembanding memiliki nilai IC50 78,85 bpj. Semua Ekstrak hasil bioproduksi
kapang endofit tanaman (Eleutherine americana (Aubl)Merr.) memiliki potensi inhibitor α-glukosidase lebih kecil dari potensi inhibitor α-glukosidase akarbose sebagai pembanding.
Kata kunci: Kapang endofit, tanaman bawang dayak (Eleutherine americana(Aubl)Merr), Metaboli Sekunder, Isolasi, Inhibitor α-glukosidase.
Abstract
Endophytic microbes are microbes that live and in symbiosis with the the host plant, endophytic microbes are known to have the ability to produce secondary metabolites similar with their host plants. From previous studies it is known that the plant extract of bawang dayak (Eleutherine americana (Aubl.) Merr.) have alpha glucosidase inhibitor activity. This study aims to isolate the endophytic fungi from plant leaves and tubers (Eleutherine americana(Aubl.)Merr) and examined the potential of alpha-glucosidase inhibitor activity of secondary metabolites from the obtained isolates of endophytic fungi. The endophytic fungus from plant leaves and tubers (Eleutherine americana(Aubl.)Merr) are grown using the direct planting method and using PDA as the media. Then the morphological properties of the endophytic fungi are observed macroscopically (visual) and microscopically (slide culture) and 5 single isolates were obtained. The fifith isolates were fermented using PDY media for 14 days. Then the fermented isolated fungi were extracted using ethyl acetate. The obtained crude extract from solvent then examined its alpha glucosidase inhibitor activity using Microplate Reader method with acarbose as a comparison. The results obtained by the highest inhibitor activity was isolated d.E.a1 with a value IC50 196,22. Whereas, acarbose as a comparison have value IC50 78,85. All bioproduction extracts
of endophyte fungi Eleutherine americana (Aubl.)Merr have alpha-glucosidae inhibitor activity is smaller than Acarbose as a comparison
.
Keywords: Endophytic fungi, Bawang dayak plant (Eleutherine americana(Aubl)Merr,secondary metabolites, Isolation, Alpha- glucosidase inhibitor activity.
PENDAHULUAN
Enzim α-glukosidase merupakan enzim yang mempunyai kemampuan untuk menguraikan senyawa oligosakarida. Enzim amilase menguraikan senyawa polisakarida terlebih dahulu menjadi senyawa oligosakarida yang kemudian diuraikan kembali oleh enzim α-glukosidase menjadi monosakarida(Borges de Melo, da Silveira Gomes, & Carvalho, 2006). Hal ini sangat bermanfaat bagi manusia dalam memperoleh energi untuk melakukan aktivitas sehari-hari. Sedangkan, pada pasien diabetes mellitus terutama diabetes mellitus tipe II dimana adanya aktivitas dari enzim α-glukosidase menyebabkan terjadinya peningkatan monosakarida dalam darah(Suharti K. Suherman, 2007).
Inhibitor α-glukosidase merupakan senyawa yang mempunyai kemampuan menghambat aktivitas enzim α-glukosida. Inhibitor α-glukosidase umumnya merupakan senyawa poliol (-OH) yang dapat menghambat sisi aktif enzim α-glukosidase secara kompetitif. Keberadaan inhibitor α-glukosidase di usus halus dapat menghambat metabolisme oligosakarida menjadi glukosa. Hal ini sangat berguna bagi pasien DM untuk mencegah terjadinya hiperglikemia posprandial(Borges de Melo et al., 2006).
Bawang dayak merupakan tanamana khas kalimantan. Air rebusan atau perasan umbi bawang dayak secara tradisional diyakini mempunyai berbagai khasiat, antara lain sebagai antikanker payudara, darah tinggi (hipertensi), Diabetes Mellitus, kolesterol dan bisul(Yuniar & Bhermana, n.d.).Umbi bawang dayak telah dibuktikan aktivitas antioksidan dan inhibito α-glukosidase. Perpaduan kapasitas antioksidan dan kemampuan penghambatan enzim α-glukosidase yang terdapat pada ekstrak etanol umbi bawang dayak memiliki potensi sebagai agen antidiabetik. Nilai IC50 inhibitor α-glukosidase ekstrak etanol umbi bawang dayak adalah 241ppm
yang lebih rendah daripada akarbose dengan nilai IC50 288 ppm. Hal ini menunjukan bahwa aktivitas inhibitor α-glukosidase dari ektrak etanol bawang dayak lebih baik daripada akarbose yang dikenal sebagai agen antidiabetik koersial(Early Febrinda, Astawan, Wresdiyati, & Dewi Yuliana, 2013).
Tanaman dan mikroorganisme mempunyai hubungan mutualime satu sama lain. Salah satu mikroorganisme tanaman adalah kapang endofit. Kapang endofit dapat membantu proses metabolisme dan menghasilkan metabolit sekunder(Tan & Zou, 2001). Kemampuan kapang endofit memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder dari kapang endofit yang diisolasi dari tanaman inangnya. Diketahui tanaman bawang dayak mengandung beberapa golongan senyawa berupa alkaloid, saponin, tanin, fenolik, flavonoid, triterpenoid, dan steroid yang berpotensi sebagai inhibitor α-glukosidase. Sehingga, perlu dilakukan penelitian untuk pengembangan obat herbal melalui bioproduksi metabolit sekunder kapang endofit dari tanaman bawang dayak(Early Febrinda et al., 2013).
Kapang endofit dari tanaman bawang dayak telah dilakukan isolasi. Hasil ekstraksi fase etilasetat biaoproduksi metabolit sekunder kapang endofit tanaman bawang dayak (Eleutherine amricana(Aubl)Merr) diketahui mempunyai potensi sebagai antimikroba terhadap bakteri gram positif dan gram negatif. Ekstrak etilasetat dari isolat d.IEP.4.2 memiliki aktivitas antimikroba tertinggi dengan nilai DDH sebesar 17,61mm terhadap Staphylococcus aureus dan sebesar 20,83 mm terhadap Escherichia coli. Ekstrak etilasetat metabolit sekunder kapang endofit tanaman bawang dayak dari isolat d.IEP.1.2 juga diketahui memiliki potensi antioksidan dengan nilai IC50 terendah yaitu 82,97µg/mL. Hasil dari penelitian tersebut membuktikan bahwa
pada penapisan kapang endofit yang diekstraksi dari hasil fermentasi kapang endofit dengan pelarut etilasetat diketahui terdapat golongan senyawa flavonoid dan fenolik(Inthan kaerunnisa, 2015). Senyawa flavonoid dan fenolik telah diketahui dapat menghambat kerja enzim glukosidase(Hikmah, 2015). Senyawa penghambat α-glukosidase umumnya adalah senyawa semi polar hingga polar yang memiliki ikatan glikosida pada ikatan strukturnya(Borges de Melo et al., 2006).
Pada penelitian ini akan dilakukan isolasi kapang endofit dari umbi dan daun bawang dayak, sehingga kapang endofit tersebut diharapkan dapat menghasilkan metabolit sekunder yang berpotensi sebagai inhibitor α-glukosidase. Potensi penghambatan enzim α-glukosidase dari metabolit sekunder kapang endofit maka perlu dilakukan pengujian secara invitro dengan pengukuran aktivitas inhibitor α-glukosidase.
BAHAN DAN METODE BAHAN
Sampel berupa daun dan umbi (Eleutherine americana(Aubl.)Merr) telah dideterminasi di herbarium Bogoriense, etanol 75%, natrium hipoklorit (NaOCl) 5,3%, medium Potato Dextrose Agar (Difco), medium cair Potato Dextrose Yeast (PDY), aquadest steril, etilasetat, etanol, enzim α-glukosidase, p-nitrofenil-α-D-Glukopiranosida, kalium dihidrogenfosfat, dikalium dihidrogen fosfat, dimetil sulfoksida (DMSO), natrium karbonat, kalsium karbonat, kloramfenikol dan akarbose.
ISOLASI KAPANG ENDOFIT
Isolasi kapang endofit tanaman bawang dayak dilakukan dengan metode tanam langsung, yaitu sebagai berikut: Sampel berupa daun dan bulbus dicuci bersih dan dibilas aquadest mengalir selama 10 menit, lalu ditiriskan. Daun dan Bulbus dipotong menjadi potongan-potongan kecil berukuran 2-3cm. Permukaan daun dan bulbus disterilisasi bertingkat dengan menggunakan metode sterilisasi permukaan dengan cara : mencelupkan kedalam etanol 75% selama 1-2 menit, dengan larutan NaOCL 5,25% selama 5 menit, kemudian dengan etanol 75% selama 30 detik dan terakhir dibilas dengan aquadest steril. Selanjutnya potongan-potongan daun dan bulbus tersebut dibelah membujur menjadi dua bagian yang sama dan masing-masing bagian diletakkan diatas media PDA (Potato Dextrose Agar) yang telah diberikan kloramfenikol 0,005% sebagai antibiotik dengan posisi permukaan belahan menempel pada agar medium (telungkup). Kultur diinkubasi pada suhu ruang (270-300C) selama 5-7 hari. Kapang endofit yang tumbuh dimurnikan dengan dikulturkan kembali pada medium yang sama sampai diperoleh isolat tunggal(murni).
FERMENTASI KAPANG ENDOFIT
Fermentasi kapang endofit tunggal dilakukan dalam medium cair PDY (Potato Dextrose Yeast) 50 ml dalam erlenmeyer 250 ml. Medium PDY yang akan digunakan disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 1210 selama 15 menit. Dengan menggunakan sedotan bubble steril, isolat tunggal kapang endofit diambil 5 potong dengan diameter 1 cm dan dimasukkan ke dalam medium PDY 50 ml dalam erlenmeyer 250 ml. Selanjutnya diinkubasikan dengan penggojokan pada kecepatan 130 rpm pada suhu ruang (270-300C) selama 5 hari. Lalu dipindahkan ke dalam medium PDY 200 ml dalam erlenmeyer 1L dan diinkubasikan dengan penggojokan kecepatan 130 rpm pada suhu ruang (270-300C) selama 7 hari. Setelah itu di sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit pada suhu ruang (270-300C). Supernatan yang diperoleh selanjutnya dilakukan ekstraksi.
EKSTRAKSI METABOLIT SEKUNDER
Supernatan yang diperoleh diektraksi dengan pelarut etilasetat sampai tersari sempurna. Fase etilasetat yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan rotavaptor, sehingga diperoleh ekstrak pekat. Kemudian ekstrak yang telah dipekatkan digunakan untuk uji penghambatan aktivitas enzim α-glukosidase.
PENAPISAN FITOKIMIA
Penapisan fitokimia yang meliputi flavonoid, saponin, tanin, kuinon, steroid, triterpenoid, alkaloid, kumarin, minyak atsiri dilakukan menurut metode standaryang terdapat didalam Biological and Phytochemical Screening of Plant.
PENGUJIAN AKTIVITAS PENGHAMBATAN α-GLUKOSIDASE
Campuran pereaksi yang digunakan dalam uji ini mengandung larutan sampel sebanyak 20µL ditambahkan dengan 80µL dapar fosfat pH 7,0 dan 50 µL p-nitrofenol α-d-glukopiranosida dengan konsentrasi 10mM, lalu diinkubasi selama 5 menit pada suhu 370C. Selanjutnya ditambahkan 50 µL enzim yang telah diencerkan dengan konsentrasi 0,025 U/mL dan diinkubasi kembali selama 20 menit pada suhu 370C. Setelah masa inkubasi selesai, larutan sempel ditambah 200µL natrium karbonat 0,2M. Larutan sampel diukur absorbansinya dengan dengan microplate reader pada panjang gelombang 405nm.
HASIL DAN PEMBAHASAN
ISOLAT KAPANG ENDOFIT DARI DAUN BAWANG DAYAK (Eleutherine americana(Aubl)Merr) Tabel V. Karakteristik makroskopik dan mikroskopik kapang endofit daun bawang dayak No Kode Isolat Diameter (cm) kapang hari ke-7
Ciri-Ciri Morfologi makroskopik Kapang Ciri-Ciri Morfologi Mikroskopik kapang
Warna depan koloni Warna belakang koloni
1 d.E.a1 7,6 Warna koloni putih-hitam, tepi koloni bulat,
Permukaan koloni rata, Tidak ada garis radial,
Terdapat lingkaran konsentris
Warna Putih-Hitam, Tepi rata
Hifa tida berseptum, tidak bewarna, berbentuk akar, Spora
tidak terlihat
2 d.E.a3 5,5 Warna koloni putih-bintik hitam, tepi koloni bergelombang,
permukaan koloni kasar, Ada garis radial,
Tidak ada Lingkaran konsentris
Warna Putih-Bintik Hitam, Tepi
bergelombang
Hifa tida berseptum, tidak bewarna, berbentuk akar, Spora
tidak terlihat
3 d.E.a4 7,3 Warna koloni Hitam, Tepi koloni bergelombang, Permukaan koloni menggunung, Tidak ada
garis radial dan lingkaran konsentris
Warna Hitam-Kuning, Tepi bergelombang
Hifa tida berseptum, tidak bewarna, berbentuk akar, Spora
4 d.E.a5 7,1 Warna koloni Putih, Tepi koloni bergelombang, Permukaan koloni menggunung seperti kapas , Tidak ada garis
radial dan lingkaran konsentris
Warna Putih-Hitam, Tepi bergelombang
Hifa tida berseptum, tidak bewarna, berbentuk akar, Spora
tidak terlihat
5 d.E.a6 8,1 Warna putih-kuning, tepi koloni rata, Permukaan koloni menggunung seperti kapas, tidaka ada garis
radial dan lingkaran konsentris
Warna Kuning,Tepi
Tidak rata
Hifa tida berseptum, tidak bewarna, berbentuk akar, Spora
tidak terlihat
Tabel V. Gambar mikroskopik dan makroskopik kapang endofit daun bawang dayak Permukaan Depan Permukaan Belakang Mikroskopik
Gambar V.1 Isolat d.E.a1
Gambar. V.3 Isolat d.E.a4
Gambar.V.4 Isolat d.E.a5
Gambar. V.5. Isolat d.E.a6
PENAPISAN FITOKIMIA
Tabel 1. Hasil penapisan fitokimia ekstrak etilasetat
Senyawa d.E.a1 d.E.a3 d.E.a4 d.E.a5 d.E.a6
Flavonoid + + + + + Saponin + + + - - Tanin + + - - + Kuinon - - - - - Steroid - - - - - Triterpenoid + + + + + Alkaloid + + - + + Kumarin - + + - + Minyak atsiri - + - - +
Data penapisan metabolit sekunder hasil bioproduksi kapang endofit daun tanaman bawang dayak menunjukan bahwa setiap isolat menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang berbeda-beda. Isolat d.E.a1 mengandung flavonoid, saponin, tanin, triterpenoid, dan alkaloid. Isolat d.E.a3 mengandung flavonoid, saponin, tanin, triterpenoid, alkaloid, kumarin dan minyak atsiri. Isolat d.E.a4 mengandung flavonoid, saponin, triterpenoid dan kumarin. Isolat d.E.a5 mengandung flavonoid, triterpenoid, dan alkaloid. Isolat d.E.a6 mengandung flavonoid, tanin, triterpenoid, alkaloid, kumarin dan minyak atsiri. Sedangkan dari ekstrak etanol umbi bawang dayak diketahui mengandung alkaloid, saponin, tanin, fenolik, flavonoid, triterpenoid dan steroid. Ekstrak air umbi bawang dayak alkaloid, saponin, tanin, fenolik, triterpenoid dan steroid(Early Febrinda et al., 2013).
PENGHAMBATAN AKTIVITAS ENZIM ALFA-GLUKOSIDASE
Gambar.V.1 Nilai IC50 dari akarbose dan metabolit sekunder hasil bioproduksi kapang endofit
dari daun bawang dayak (Eleutherine americana (Aubl)Merr)
Pengujian aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase dilakukan terhadap ekstrak etil asetat metabolit sekunder isolat kapang endofit dengan kode d.E.a1, d.E.a3, d.E.a4, d.Ea.5, d.E.a6 dan akarbose sebagai pembanding. Reaksi antara enzim α-glukosidase dengan substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida akan menghasilkan p-nitrofenol. Pada penelitian ini, serapan p-nitrofenol akan diukur menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 405nm.
Pengujian aktivitas metabolit sekunder dari bioproduksi kapang endofit terhadap penghambatan enzim α-glukosidase, dilakukan dengan menggunakan larutan enzim konsentrasi 0,030U/mL, larutan substrat konsentrasi 10 mM dan larutan dapar fosfat pH 7,0 dengan waktu inkubasi 20 menit. Sampel ekstrak etil asetat setiap isolat dibuat konsentrasi induk 20.000 µg/mL. Dari konsentrasi induk dibuat larutan seri konsentrasi 0,05%; 0,10%; 0,20%; 0,40% dan 0,80%. Sehingga di peroleh larutan konsentrasi 500, 1000, 2000, 4000, 8000 µg/mL dan konsentrasi akhir pengujian 25, 50, 100, 200 dan 400 µg/mL.
Pada pengujian aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase, inkubasi 370C dilakukan untuk memprcepat reaksi enzimatis antara enzim α-glukosidase dan substrat p-nitrofenil-D-glukopiranosida agar reaksi berlangsung sempurna. Sedangkan penambahan Na2CO3 bertujuan untuk menghentikan reaksi. Pada
penelitian ini kontrol menghasilkan serapan berupa p-nitrofenol utuh tanpa adanya penghambatan. Serapan S berupa sisa p-nitrofenol yang terbentuk sebagai akibat sampel memiliki kemampuan menghambat enzim α-glukosidase sehingga p-nitrofenol yang dihasilkan berkurang semakin tinggi konsentrasi sampel maka semakin kecil p-nitrofenol yang terbentuk dan semakin kecil pula serapan yang diperoleh, tetapi persentase penghambatan yang didapat semakin tinggi. Semakin kecil nilai IC50 yang didapat maka aktivitas yang
dihasilkan baik, sedangkan semakin besar IC50 maka aktivitas yang dihasilkan kurang baik.
Dari 5 isolat kapang endofit dari daun Eleutherine americana(Aubl.)Merr. diketahui semuanya mempunyai efek penghambatan aktivitas enzim α-glukosidase. Isolat kapang d.E.a1 dengan nilai IC50 196,22
µg/mL, Isolat kapang d.E.a3 dengan nilai IC50 309,59 µg/mL, Isolat kapang d.E.a4 dengan nilai IC50 251,01
µg/mL, Isolat kapang d.E.a5 dengan nilai IC50 283,49µg/mL, Isolat kapang d.E.a6 dengan nilai IC50 270,97
µg/mL. Nilai tersebut diperoleh dari perhitungan berdasarkan persamaan regresi dari data pengujian pada lampiran 13. Dari hasil penelitian ini, nilai aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase tertinggi yaitu isolat kapang d.E.a1 dengan nilai IC50 196,22 µg/mL dan nilai aktivitas terendah yaitu isolat kapang d.E.a3 dengan
nilai IC50 309,59 µg/mL, sedangkan nilai aktivitas akarbose sebagai pembanding mempunyai nilai IC50 78,85
µg/mL. Data tersebut menunjukan bahwa metabolit sekunder isolat kapang d.E.a1, pada konsentrasi 196,22 µg/mL dapat menghambat 50% enzim α-glukosidase.
78.85 196.22 309.59 251.01 283.49 270.97 Akarbose (kontrol)
d.E.a1 d.E.a.3 d.E.a.4 d.E.a.5 d.E.a.6 IC50 (µg/mL)
Hasil pengujian pembanding akarbose didapat nilai IC50 sebesar 78,85 µg/mL. Nilai IC50 akarbose yang didapat
berbeda dengan penelitian sebelumnya yaitu 288 µg/mL. Hal ini disebabkan karena metode yang digunakan juga berbeda yaitu dengan menggunakan microplate reader. Pada penggunaan microplate reader, volume sempel uji yang digunakan lebih kecil daripada spektofotometer sehingga kesalahan pemipetansangat berpengaruh besar. Akibatnya perbedaan tinggi volume sedikit saja akan mempengaruhi nilai absorbansi yang didapat.
KESIMPULAN
Jumlah Isolat kapang endofit dari daun tanaman bawang dayak Eleutherine americana(Aubl) Merr ada 5 yaitu isolat d.E.a1, d.E.a3, d.E.a4, d.E.a5, d.E.a6. Nilai IC50 Isolat kapang d.E.a1 sebesar196,22 µg/mL, Isolat kapang
d.E.a3 sebesar IC50 309,59 µg/mL, Isolat kapang d.E.a4 dengan nilai IC50 251,01 µg/mL, Isolat kapang d.E.a5
sebesar IC50 283,49µg/mL, Isolat kapang d.E.a6 dengan nilai IC50 270,97 µg/mL. Nilai aktivitas penghambatan
enzim α-glukosidase tertinggi yaitu isolat kapang d.E.a1 dengan nilai IC50 196,22 µg/mL dan nilai aktivitas
terendah yaitu isolat kapang d.E.a3 dengan nilai IC50 309,59 µg/mL.
DAFTAR PUSTAKA
Borges de Melo, E., da Silveira Gomes, A., & Carvalho, I. (2006). α- and β-Glucosidase inhibitors: chemical structure and biological activity. Tetrahedron, 62(44), 10277–10302. http://doi.org/10.1016/j.tet.2006.08.055 Early Febrinda, A., Astawan, M., Wresdiyati, T., & Dewi Yuliana, N. (2013). Kapasitas Antioksidan Dan Inhibitor Alfa Glukosidase Ekstrak Umbi Bawang Dayak. Jurnal Teknologi Dan Industri Pangan, 24(2), 161– 167. http://doi.org/10.6066/jtip.2013.24.2.161
Hikmah, Z. (2015). Uji Aktivitas Inhibitor alfa-glukosidase Fraksi Etanol Daun Kenitu (Chrysophyllum cainoto L.) Berbagai Varian dari Daerah Jember. Jember.
Inthan kaerunnisa. (2015). Isolasi dan identivikasi senyawa aktif antioksidan hasil biopoduksi kapang endofit daun bawng dayak (Eleutherine americana (Aubl.) Merr).(Skripsi).2015. Fakultas Farmasi Universitas Pancasila.
Suharti K. Suherman. (2007). insulin dan antidiabetik oral (5th ed.). departemen farmakologi dan terapeutik fakultas kedokteran universitas indonesia.
Tan, R. X., & Zou, W. X. (2001). Endophytes : a rich source of functional metabolites, (March), 448–459. Yuniar, R., & Bhermana, A. (n.d.). Pewilayahan plasma nutfah tanaman obat berbasis sistem informasi geografi di kalimantan tengah, 1–12.
