ISOLASI GEN YANG TERLIBAT DALAM PELARUTAN
FOSFAT DARI Pseudomonas sp.AZM-1
MELALUI
MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON
ALI ZUM MASHAR
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
SURAT PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul:
Isolasi Gen Yang Terlibat Dalam Pelarutan Fosfat Dari Pseudomonas sp. AZM-1 Melalui Mutagenesis Dengan Transposon
adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber data dan informasi yang dikutip dalam tesis ini telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini. Oleh karena itu, semua isi tesis ini dapat dipertanggung jawabkan kebenarannya.
Bogor, April 2009
Ali Zum Mashar NRP P055040071
ABSTRACT
ALI ZUM MASHAR. Isolation of a Gene Involved In Phosphate-solubilizing From
Pseudomonas sp. AZM-1 Through Transposon Mutagenesis. Under the direction of
SUHARSONO, ARIS TRIWAHYUDI.
Pseudomonas sp. AZM-1 is soil microbe which have phosphate-solubilizing
from enzyme metabolite activities mechanism so this bacterium have a gene related to phosphate-solubilizing. The aim of this reseach was to isolate, clone and characterize gene involved in phosphate-solubilizing. To isolate a gene involved in phosphate-solubilizing, the mutant was contructed using transposon mini Tn5Km1 to yield become Non-Phosphate-Solubilizing (NPS) Pseudomonas sp. Transposon
delivery was carried out through conjugation between Pseudomonas sp. AZM-1 and E. coli S17 (λ pir) carrying pUTmini-Tn4Km1. The frequency of transconjugation
was abaut 3.0 x 10-9 cells per recipient. These NPS bacteria did not solubilize phosphate contained in the pykovskaya medium. DNA fragment interrupted by transposon (called flanking DNA) was isolated by Inverse Polymerase Chain Reaction (Inverse PCR) and cloned into pGEM-T Easy. DNA sequence analysis showed that the flanking DNA is 1006 bp and contains an Open Reading Frame (ORF). This ORF contains 215 amino acids allignment analysis of amino acid sequence reduced from this ORF showed that this ORF is identic with DNAse1
from Pseudomonas fluorescens strain Pf-5. This gene might function indirectly
in the phosphate solubilization in Pseudomonas sp. AZM-1.
Keyword: Pseudomonas sp. AZM-1, phosphate-solubilizing, Transposon mini Tn5, DNAse1, endA gene.
RINGKASAN
ALI ZUM MASHAR. Isolasi Gen Yang Terlibat Dalam Pelarutan Fosfat Dari Pseudomonas sp. AZM-1 Melalui Mutagenesis Dengan Transposon. Dibimbing
oleh: SUHARSONO, ARIS TRIWAHYUDI
Pseudomonas sp.AZM-1 adalah mikroba tanah yang memiliki kemampuan
dalam pelarutan fosfat melalui mekanisme enzimatik sehingga bakteri ini memiliki gen yang berhubungan dengan pelarutan fosfat. Mikroba gram negatif ini memiliki respon positif terhadap transposon mini Tn5Km1. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi, mengklon dan mengkarakterisasi gen yang terlibat dalam pelarutan fosfat.
Penelitian ini dimulai dengan mengisolasi bakteri pelarut fosfat, isolasi fragmen DNA genom dari mutan negatif pelarut, amplifikasi fragmen DNA pengapit menggunakan inverse PCR, pengklonan fragmen hasil PCR pada pGEM®-T Easy,
introduksi plasmid ke dalam bakteri E. coli galur DH5α. Fragmen DNA vektor
rekombinan dari mutan negatif pelarut fosfat yang didapat di sekuen dengan menggunakan primer T7 dan SP6. Untuk mengisolasi gen yang terlibat dalam pelarutan fosfat, bakteri ini dimutasikan dengan transposon mini Tn5Km1 sehingga menjadi bakteri mutan yang tidak mampu melarutkan fosfat. Introduksi transposon dilakukan melalui konjugasi antara Pseudomonas sp.AZM-1 dengan E. coli S17 (λ
pir) yang mengandung pUT mini–Tn5Km1. Frekuensi transkonjugasi sel bakteri mutan negatif pelarut fosfat didapatkan dari media sebar adalah 3.00 x 10-9. Bakteri mutan ini tidak dapat melarutkan fosfat di dalam media pykovskaya.
Fragmen DNA yang tersisipi transposon diisolasi dengan cara Polymerase Chain Reaction terbalik (inverse PCR) dan diklon ke dalam pGEM®-T Easy.
Analisis mutan menunjukkan bahwa DNA pengapit transposon berukuran 1006 pb dan mengandung kerangka baca (Open Reading Frame). Kerangka baca ini
mengandung 215 asam amino. Analisis penyejajaran urutan nukleotida dan asam amino yang menggunakan program BLAST X, menunjukkan bahwa fragmen tersebut adalah endonuklease 1 yang memiliki kesamaan genom dengan Pseudomonas fluorescens Pf-5. Analisis kesejajaran dari urutan asam amino yang
dideduksi dari ORF ini menunjukkan bahwa ORF ini memiliki kesamaan dengan
DNAse1 yang disandikan oleh gen endA dari Pseudomonas fluorescens galur Pf-5.
Gen ini mungkin secara tidak langsung dalam pelarutan fosfat di dalam
Pseudomonas sp. AZM-1.
Kata kunci: Pseudomonas sp. AZM-1. pelarut fosfat, Transposon mini Tn5, DNAse1,
@ Hak Cipta milik IPB, tahun 2009
Hak Cipta dilindungi Undang-undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebut sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
ISOLASI GEN YANG TERLIBAT DALAM PELARUTAN
FOSFAT DARI Pseudomonas sp.AZM-1 MELALUI
MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON
ALI ZUM MASHAR
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul Penelitian : Isolasi Gen Yang Terlibat Dalam Pelarutan Fosfat Dari Pseudomonas sp.AZM-1 Melalui Mutagenesis Dengan Transposon
Nama Mahasiswa : Ali Zum Mashar
Nomor Pokok :
P055040071
Program Studi : BioteknologiMenyetujui Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Suharsono, DEA, Ketua
Dr. Aris Triwahyudi, M.Si. Anggota
Diketahui Ketua Program
Studi Bioteknologi
Dr. Ir. Muhammad Jusuf, DEA.
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS.
i
KATA PENGANTAR
Bismillairrahmanirrahiim,
Segala puji penulis panjatkan kepada Allah Subhanaahu Wa Ta’alaa atas limpahan berkat dan rahmat-Nya yang tiada terhingga sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis ini yang berjudul ” Isolasi Gen Yang Terlibat Dalam Pelarutan Fosfat Dari Pseudomonas aeroginosa Melalui Mutagenesis Dengan Transposon”.
Terima kasih penulis sampaikan kepada pihak-pihak yang telah membimbing dan membantu dengan penuh perhatian dan kecintaan selama proses penelitian ini baik secara langsung maupun tidak langsung. Terimakasih disampaikan kepada Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB yang telah menyediakan fasilitas penelitian ini. Untuk itu penulis menyampaikan terima kasih kepada:
1. Dr. Ir. Suharsono, DEA selaku pembimbing yang telah meluangkan waktu didalam memberikan pembimbingan dan wawasan berfikir yang sangat berharga bagi penulis.
2. Dr. Aris Triwahyudi, M.Si selaku pembimbing yang telah memberi bimbingan, nasehat dan bahan selama proses penelitian bagi penulis.
3. Dr. Ir.Muhammad Jusuf, DEA selaku ketua Program Studi Bioteknologi SPs IPB.
4. Anak dan Istriku tercinta atas segala pengorbanannya yang memberikan dukungan moril dan materiil.
5. Teman-temanku: Firdaus (Btk), mbak Pepy (Biorin), mbak Arie (Seafast), Rika Indri Astuti (Biologi), Syahnada Jaya, Pak Mulya, Efrizal, dan teman-teman se-angkatan bioteknologi 2004 yang banyak membantu.
Akhirnya berharap Allah SWT memberikan balasan rahmat dan kebaikan kepada kita semua. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi kita semua.
Bogor, April 2009
ii
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bakung, Kec. Mijen, Kabupaten Demak, Propinsi Jawa Tengah pada tanggal 19 Mei 1972. Penulis adalah anak keenam dari tujuh bersaudara dari pasangan yang berbahagia H. M. Ali Mukti dan Hj. Sri Tasriah. Saat ini penulis telah menikah dengan Sonni Anna, SPt. dan dikaruniai tiga orang anak : Zumarizka Akbar Ibrahim, Kalyana Daeva Ali dan Mughni Vada Ali.
Penulis lulus dari SMU Negeri I Kudus tahun 1991 dan melanjutkan di Fakultas Pertanian UNSOED Purwokerto. Penulis pada bulan September 2004 melanjutkan pendidikan Sekolah Pascasarjana di Institut Pertanian Bogor, Program Studi Bioteknologi. Setelah lulus S1 (1997) bekerja sebagai PNS Deptrans dan PPH Kalteng dan saat ini menjadi peneliti di Puslitbangtrans Depnakertrans serta tenaga ahli di beberapa perusahaan swasta Nasional.
Selama mahasiswa penulis aktif di organisasi kegiatan kampus seperti ketua Badan Pelaksana Harian SMPT Unsoed, ketua Unit Kerohanian Islam (UKI) Faperta, ketua pembinaan UKKI Unsoed, ketua Perhimpunan Mahasiswa Agroindustri Jateng, ketua KSIMP Faperta, dan lain.lain. Penulis aktif di dalam kegiatan kompetisi keilmiahan antara lain mendapatkan Juara I LCTQ Unsoed (1993), Juara I LP2P4 Unsoed dan antar perguruan tinggi se-Jawa Tengah (1994), finalis Lomba Karya Inovatif Produktif Nasional LKIP (1994), Juara I LKTI Mapres Unsoed (1995), Juara I LP2PA (1995), Juara II LKTI Nasional di UGM (1996), juara harapan I pameran ilmiah PIMNAS IX dan menjadi mahasiswa berprestasi utama I Faperta Unsoed dan Mahasiswa berprestasi utama dan teladan Unsoed (1995), menerima beasiswa PERTAMINA, Supersemar dan PPA Dikti.
Beberapa hasil karya ilmiah penulis yang bersifat penemuan (invent) antara lain: Teknologi Bio Perforasi (International patent Reg: PCT/ID 01/00003.); Teknologi Pupuk Hayati Bio P 2000 Z (patent: ID 0000348S), Komposisi produk turunan dan cara pembuatan Pupuk Bio Perforasi (paten:ID 0016722, P20000368, P20000367); 21 jenis galur kedelai unggul baru produktivitas; Rekor Guiness Book MURI membuat ”Kedelai Raksasa” buah terlebat 2.400 – 3.030 polong/pohon dan setinggi “3,80 meter” dan ”4,5 meter”.
iii
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR GAMBAR...………….……..…… iv DAFTAR LAMPIRAN...……..…… vi PENDAHULUAN Latar Belakang...…………. 1 Tujuan Penelitian ...…………. 3 TINJAUAN PUSTAKA Mobilitas Unsur Phosfat ...…………. 4Mikroba Pelarut Phosfat ... 5
Peran Transposom dalam Mutagenesis... 7
aBAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian...…………. 9
Bahan...…………. 9
Metode Penelitian...…………. 10
Isolasi bakteri pelarut fosfat...…………. 11
Mutagenesis dengan Transposon ... 12
Seleksi mutan ...…………. 13
Isolasi DNA genom mutan P. aeroginosa ... 14
Pemotongan dan ligasi DNA yang mengandung mini-Tn5Km1... 15
Amplifikasi DNA yang diapit mini Tn5Km1 ... 16
Pengklonan hasil amplifikasi fragmen DNA pengapit mini Tn5... 17
Transformasi E. coli DH5α... 18
Seleksi transforman rekombinan...…………. 19
Isolasi Plasmid ... 19
Pengurutan nukleotida dan analisis bioinformatika ... 19
HASIL DAN PEMBAHASAN Skrining Pseudomonas sp. mikroba pelarut fosfat ... 21
Mutagenesis dengan Transposon dan seleksi mutan ... 21
Isolasi dan pemotongan DNA genom total mutan negatif pelarut fosfat -P. aereus ..... ... 22
Amplifikasi Fragmen DNA Pengapit MiniTn5 Menggunakan Inverse PCR... 23
Pengklonan dan Hasil Amplifikasi Fragmen DNA Pengapit mini Tn5... 24
Pengurutan fragmen DNA pengapit miniTn5... 26
Analisis Kesamaan Gen Sisipan Dengan Data Gen di Genbank... 28
Peta Enzim Restriksi Endonuklease fragmen ... 31
Urutan asam amino deduksi dari DNA yang disisipi Tn5………... ... 31
Analisis Domain Fragmen DNA Pengapit Tn5………... 33
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ... 35
Saran ... 35
DAFTAR PUSTAKA ... 36
iv
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1. 2. 3. 4. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.Peta plasmid pUT mini-Tn5Km1 (7.055 kb) yang berada dalam sel E. coli S17-1 (λ pir), peta restriksi transposon mini-Tn5Km1 (1.835 kb) yang membawa gen resistensi ...
Peta plasmid pGEMT-Easy ... Tahapan isolasi, pengklonan dan karakterisasi fragmen gen yang terlibat dalam pelarutan fosfat dari P. aeroginosa.... Diagram skematis proses mutagenesis dengan transposon. Konjugasi dilakukan di atas filter milipore (0.45 µm) pada media LB. Pada suspensi campuran donor (D) dengan resipien (R) akan terjadi serangkaian proses transfer dan penyisipan transposon ...
Proses mutagenesis dengan transposon. Konjugasi dilakukan di atas filter milipore (0.45 µm) pada media LA modifikasi. Pada suspensi campuran donor (D) dengan resipien (R) akan terjadi serangkaian proses transfer dan penyisipan transposon ...
Skema proses amplifikasi fragmen DNA genom pengapit transposon. a) DNA genom Pseudomonas Aereus mutan non pelarut phosfat yang dipotong dengan enzim EcoRV, b) Proses sirkularisasi menggunakan enzim T4 DNA ligase, c) Proses amplifikasi DNA genom pengapit transposon dengan inverse PCR ...
Penampilan koloni P. aeroginosa pembawa gen pelarut fosfat pada media phykovskaya: a. Peremajaan dari sel tunggal P. aeroginosa hasil isolasi, b. Pertumbuhan fase logaritmatik, c. Penampilan pertumbuhan murni pada media pykovskaya menunjukkan zona bening... Mutan P. aeroginosa padapikovskaya agar + Chl 50 µg/mL + Km 50 µg/mL yang diinkubasi selama 24 jam ... Penapisan terhadap mutan untuk mendapatkan mutan negatif pelarut fosfat: a. koloni P. aeroginosa tipe liar pelarut fosfat, b. mutan P. aeroginosa negatif pelarut fosfat... Elektroforesis gel agarose DNA genom mutan P. aeroginosa yang bukan pelarut fosfat... DNA hasil Inverse PCR (1. sampel; 2. penanda ukuran 1 kb plus). ...
9 10 11 13 15 16 21 22 22 23 24
v 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. .
Koloni-koloni E. coli DH5α berwarna biru (diduga tidak membawa plasmid rekombinan dan putih diduga membawa palsmid rekombinan) pada media LA yang mengandung 100 μg/ml ampisilin, 10 μl 100 mM isopropiltio-β -galaktosida (IPTG) (Promega) dan 50 μl 2%(b/v) X-gal ( 5-bromo-4-choloro-3-indolyl-β-D-galactoside) (Promega) hasil inkubasi pada suhu 37°C semalam...………….... Hasil PCR dengan koloni putih sebagai cetakan. 1. penanda 1 kb plus; 2. koloni 1; 3. koloni 2; 4. koloni 3; 5. koloni 4. ……….……… Verifikasi palsmid rekombinan dengan pemotongan enzim restriksi EcoRI (1. penanda 1 kb plus; 2. plasmid tidak dipotong; 3. plasmid dipotong dengan
EcoRI)... Urutan nukleotida dari DNA sisipan di dalam pGEM®-T Easy ….……….
Urutan gen sesungguhnya yang diinaktivasi oleh mini-Tn5 ... Kesejajaran endonuklease 1 yang disandikan oleh gen endA dari Pseudomonas Fluorescen Pf-5……….……….. Dendogram filogenetik berdasarkan urutan nukleotida menunjukkan kesejajaran
endonuklease P. aeroginosa dengan endonuklease I pada P. Fluorescens Pf-5. Filogenetik berdasarkan urutan nukleotida………...…….. Peta restriksi endonuklease1 (DNAse1) dari P. aeroginosa ………..……….
Deduksi asam amino penyusun enzim DNAse1 berdasarkan kodon-kodon pada daerah ORF fragmen gen pada P. aeroginosa ….………..
Kesejajaran asam amino lokal fragmen EcoRV dari P. aeroginosa dengan endonuclease I (P. fluorescens Pf-5) YP_259205………. Daerah terjaga yang menunjukkan domain endonuclease 1 pada P. fluorescens Pf-5………. 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
vi
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Hasil pengurutan nukleotida dengan primer T7 - SP6... 40 2. Komposisi berbagai media pertumbuhan Pseudomonas sp. AZM-1……...... 42 3. Multiple aligment Pseudomonas sp. AZM-1dengan berbagai strain mikroba
kekerabat... ... ... ... 43 4. Filogenetik tree nukleotida model real branch dan model cladogram... 48 5. Jarak genetik berdasarkan pada urut-urutan enzim DNAse I di GenBank dengan gen
Pseudomonas spp ... 49 6. Kesejajaran jarak genetik Pseudomonas sp. sesuai urutan enzim DNAseI………….. 50 7. Hasil analisis penyejajaran sesuai urutan nukleotida fragmen gen yang diperoleh
dengan transposon Tn5Km1 dari Pseudomonas sp.AZM-1 dengan yang dimiliki
Pseudomonas spp lain pada data Gene Bank dengan menggunakan program Blast-n dan Blast-p... 51 8. Pohon filogenetik dari fragmen gen yang diperoleh dengan transposon Tn5Km1
vii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
9. Hasil pengurutan nukleotida dengan primer T7... 40 10.Komposisi berbagai media pertumbuhan Pseudomonas sp.AZM-1..……...... 42 11.Multiple aligment Pseudomonas sp.AZM-1dengan berbagai strain mikroba
sekerabat... ... 43 12.Filogenetik tree nukleotida model real branch dan model cladogram... 48 13.Jarak genetik berdasarkan pada urut-urutan enzim DNAse I di GenBank dengan
gen Pseudomonas sp Jarak Genetik berdasarkan pada urut-urutan nukleotida gen
DNAse I di GenBank dengan gen Pseudomonas sp.AZM-1 ...... 49 14.Kesejajaran jarak genetik Pseudomonas sp.AZM-1 sesuai urutan enzim DNAseI.... 50 15.Hasil analisis penyejajaran sesuai urutan nukleotida fragmen gen yang diperoleh
dengan transposon Tn5Km1 dari Pseudomonas sp.AZM-1 dengan yang dimiliki
Pseudomonas spp lain pada data Gene Bank dengan menggunakan program Blast-n dan Blast-p... 51 16.Pohon filogenetik dari fragmen gen yang diperoleh dengan transposon Tn5Km1
