KELOMPOK 14
1. DESI AMBARSARI (1548201086)2. FADILA CHUMAIRA (1548201124)
KROMATOGRAFI KOLOM
Kromatografi kolomKromatografi kolom adalah suatu metode pemisahan yang di dasarkan pada pemisahan daya adsorbsi suatu adsorben terhadap suatu senyawa, baik pengotornya maupun hasil isolasinya. Seberapa jauh komponen itu dapat diserap, tergantung pada sifat fisika komponen tersebut. Sebelum sampel dimasukkan dalam kolom, maka dilakukan percobaan sampel terlebih dahulu terhadap kromatografi lapis tipis untuk mencari eluen yang sesuai, sehingga senyawa terpisah sempurna. Komposisi eluen yang memberikan pemisahan sempurna, digunakan pada kromatografi kolom.
Kromatografi kolom adalah metode yang digunakan untuk memurnikan bahan kimia tunggal dari campurannya. Metode ini sering digunakan untuk aplikasi preparasi pada skala mikrogram hingga kilogram. Keuntungan utama kromatografi kolom adalah biaya yang rendah dan kemudahan membuang fasa diam yang telah digunakan. Kemudahan pembuangan fasa diam ini mencegah kontaminasi silang dan degradasi fasa diam akibat pemakaian ulang atau daur ulang.
Kromatografi kolom preparatif klasik berupa tabung kaca dengan diameter antara 5 mm hingga 50 mm dengan panjang 5 cm hingga 1 m dengan keran dan pengisi (dengan sumbat kaca atau serat kaca – untuk mencegah hilangnya fasa diam) pada bagian bawah. Dua metode yang umum digunakan untuk preparasi kolom adalah: metode kering dan metode basah.
Pada metode kering, kolom pertama kali diisi dengan serbuk kering fasa diam, kemudian kolom dialiri fasa gerak hingga seluruh kolom terbasahi. Mulai titik ini, fasa diam tidak diperkenankan mengering.
Pada metode basah, fasa diam dibasahi dengan fasa gerak hingga menjadi bubur di luar kolom, dan kemudian dituangkan perlahan-lahan ke dalam kolom. Pencampuran dan penuangan harus ekstra hati-hati untuk mencegah munculnya gelembung udara. Larutan bahan organik diletakkan di bagian atas fasa diam menggunakan pipet. Lapisan ini biasanya ditutup dengan lapisan kecil pasir atau katun atau wol kaca untuk melindungi bentuk lapisan organik dari tuangan eluen. Eluen kemudian dialirkan perlahan melalui kolom sambil membawa sampel bahan organik. Sering kali, wadah eluen sferis atau corong pisah bersumbat yang sudah diisi eluen diletakkan di bagian atas kolom.
pengumpul multi aliran. Komposisi aliran eluen dapat dimonitor dan masing-masing fraksi dianalisa senyawa terlarutnya, misalnya dengan kromatografi, absorpsi sinar UV atau fluoresensi. Senyawa berwarna (atau senyawa berfluoresensi di bawah lampu UV) dapat terlihat di dalam kolom sebagai pita-pita bergerak.
Prinsip kromatografi kolom
Komponen akan dipisahkan antara dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal, sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.
Bahan yang digunakan berupa adseorbent padat. Contohnya: silika gel dan alumina.
Fase diam dan fase gerak
Fasa diam atau adsorben (penjerap) dalam kromatografi kolom adalah zat padat. Fasa diam yang paling umum untuk kromatografi kolom adalah silika gel, diikuti dengan alumina. Serbuk selulosa pernah banyak digunakan. Kromatografi kolom memungkinkan melakukan teknik kromatografi pertukaran ion, kromatografi fasa terbalik, kromatografi afinitas, atau penjerapan bed ekspansi (bahasa Inggris: expanded bed adsorption, EBA). Fasa diam biasanya serbuk halus atau gel dan/atau mikropori untuk peningkatan permukaan, meskipun dalam EBA digunakan bed berfulida. Ada rasio penting antara berat fasa diam dan berat kering campuran analit yang dapat diaplikasikan ke dalam kolom. Untuk kolom silika, rasio berada antara 20:1 hingga 100:1, bergantung pada kedekatan jarak elusi antar komponen analit.
Bahan yang digunakan berupa adseorbent padat. Contohnya: silika gel dan alumina.
Fasa gerak atau eluen dapat berupa pelarut murni atau campuran pelarut. Pemilihan dilakukan sedemikian rupa sehingga nilai faktor retensi senyawa yang diinginkan berada pada kisaran 0,2 - 0,3 untuk meminimalkan waktu dan jumlah eluen yang diperlukan selama kromatografi. Eluen dapat pula dipilih berdasarkan daya pisahnya sehingga senyawa yang berbeda dapat dipisahkan secara efektif. Optimasi eluen dilakukan melalui uji pendahuluan berskala kecil, biasanya menggunakan kromatografi lapisan tipis (KLT) dengan fasa gerak yang sama.
atas fasa diam, atau diturunkan dengan mengatur keran di bagian bawah. Laju aliran yang lebih cepat dapat diperoleh dengan menggunakan pompa atau gas bertekanan (misalnya: udara, nitrogen, atau argon) untuk menekan pelarut melalui kolom (kromatografi kolom kilat)
Ukuran partikel fasa diam pada kromatografi kolom kilat biasanya lebih halus daripada kromatografi kolom gravitasi. Misalnya, silika gel untuk kromatografi kilat berukuran antara 230 – 400 mesh (40 – 63 µm), sementara untuk kromatografi gravitasi antara 70 – 230 mesh (63 – 200 µm).
Telah dikembangkan lembar lajur (spreadsheet) yang mendukung suksesnya pengembangan kolom kilat. Lembar lajur memperkirakan volume retensi dan pita volume analit, jumlah fraksi yang diperkirakan untuk masing-masing kandungan analit, dan resolusi antara dua puncak yang berdekatan. Informasi ini memungkinkan pengguna memilih parameter optimal untuk pemisahan berskala preparatif sebelum dicobakan pada kolom kilat.
Bahan dari kromatografi yang membawa campuran komponen yang akan dipisahkan dan bergerak sepanjang fase diam.
Contoh: etanol, metanol
Manfaat kromatografi kolom
Dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif, senyawa dalam protein. a. Untuk memurnikan senyawa atau campuran.
b. Mengontrol kondisi obat tersebut sehingga bisa bertahan lama.
c. Dalam bidang clinical (klinik), menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien, dokter dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut.
d. Deteksi senyawa oksalat dalam air kencing bagi pasien kidney stones (batu ginjal).
Prosedur kromatografi kolom
CARA PENYIAPAN KROMATOGRAFI KOLOM SKALA MIKRO
Pada kromatografi kolom berskala mikro, tidak dibutuhkan kolom yang berkeran. Sebagai gantinya digunakan pipet tetes yang berujung lancip dan keluarnya pelarut diatur menggunakan prop karet pipet.
(A) Penyiapan Kolom
1) Ujung pipet diisi dengan sedikit kapas. Gunakan batang lidi untuk mendorong dan menekan kapas untuk tetap dalam posisinya di dalam pipet.
2) Masukkan adsorben silika gel. Salah satu caranya ialah dengan mencelupkan ujung bagian atas pipet kedalam wadah berisi silika gel.
3) Kemudian posisikan pipet dengan ujung pipet di bawah.
4) Cara lain adalah dengan mengisinya langsung menggunakan gelas kimia 10 ml, sedangkan pipetnya diklem pada statif.
5) Kemudian lakukankan selalu untuk mengetukkan pipet di atas meja untuk memadatkan silika gel dan agar udara keluar dari dalam pipet.
6) Setelah terisi baik, biarkan ruang sekitar 4-5 cm di atas permukaan silika. Klem pipet pada statif.
4 5 6
(B) Pre-elusi Kolom
Prosedur ini umum untuk mengembangkan adsorben agar siap untuk mengabsorbsi pelarut beserta sampel yang akan dipisahkan. Pelarut non polar seperti n-heksana merupakan pilihan yang umum dipilih untuk melakukan pre-elusi.
1) Tambahkan pelarut n-heksana (atau pelarut khusus lainnya), biarkan turun melewati silika
2) Monitor laju turunnya pelarut melewati kolom secara gravitasi
3) Percepat proses turunnya pelarut menggunakan prop karet pipet. Tempatkan prop karet pada bagian atas pipet, lalu tekan sampai pelarut turun melalui silika gel. Untuk menambah pelarut, lepaskan prop karet dari pipet dalam keadaan masih kempes (tertekan) lalu isi kembali pipet dengan pelarut.
4) Ketika pelarut telah mencapai bagian dasar pipet, proses pre-elusi telah selesei dan kolom siap untuk diisi sampel.
Jika belum siap untuk mengisi sampel kedalam kolom, kolom jangan dibiarkan kering! Selalu ingat untuk menambahkan pelarut seperlunya agar kolom tidak kering. Tutup bagian atas kolom dengan aluminium foil.
(C) Pengisian sampel ke dalam kolom
Ada 2 metode berbeda untuk mengisikan sampel ke dalam kolom : metode basah dan metode kering. Pada metode basah, sampel yang akan dimurnikan (dipisahkan) dilarutkan dalam sedikit pelarut. Larutan ini langsung dimasukkan ke dalam kolom.
Metode basah
Kolom diisi dengan larutan berisi sampel. Biarkan sampel secara perlahan melarut ke dalam silika, kemudian isilah kolom dengan pelarut dan proses pemisahan siap dimulai.
Metode Kering
kertas, lalu masukkan serbuk ke dalam kolom yang telah disiapkan. Tambahkan pelarut perlahan, dan proses kromatografi siap dimulai.
(D) Mengelusi Kolom
Laju pelarut dipercepat dengan mendorong pelarut menggunakan prop karet. Jangan biarkan silika kering ! Selalu tambahkan pelarut setiap saat.
Jika sampel senyawa berwarna, senyawa berwarna akan bergerak turun melalui kolom dan kemudian di tampung. Ketika fraksi berbeda warna keluar, ganti dengan wadah penampung yang lain. Selalu beri label wadah tempat hasil pemisahan untuk analisis berikutnya.
(E) Mengelusi kolom dengan pelarut kedua dan seterusnya
Jika memisahkan dua atau lebih komponen, maka perlu mengganti pelarut dengan pelarut yang lebih polar daripada pelarut pertama.
(F) Analisis fraksi eluat
Jika fraksi yang keluar dari kolom berwarna, gabungkan fraksi-fraksi yang berwarna. Jika fraksi-fraksinya tidak berwarna, lakukan analisis dengan KLT, sehingga fraksi yang mengandung noda sama kemudian digabungkan.
Penyiapan kolom yang dilakukan hampir sama dengan kolom skala mikro, namun disini dipakai kolom dengan ukuran lebih besar, sehingga dibutuhkan silika, sampel dan pelarut dalam jumlah yang lebih banyak.
Penyiapan kolom proses pemisahan sampel
Cara membaca kromatografi kolom
Tujuan utama kromatografi adalah untuk memisahkan komponen yang berbeda dari suatu campuran larutan. Resolusi menyatakan daya pemisahan antar komponen dalam campuran. Semakin tinggi resolusi kromatogram, semakin baik pemisahan sampel yang dihasilkan oleh kolom. Data ini adalah cara terbaik menentukan sifat pemisahan kolom untuk sampel tertentu. Resolusi dapat dihitung dari kromatogram.
Kurva terpisah dalam diagram mewakili profil konsentrasi elusi sampel yang berbeda selama proses, berdasarkan afinitasnya terhadap resin kolom. Untuk menghitung resolusi, diperlukan waktu retensi dan lebar kurva.
Lebar kurva: lebar kurva profil konsentrasi sampel yang berbeda dalam kromatogram dalam satuan waktu.
Metode yang sudah disederhanakan dalam menghitung resolusi kromatogram adalah menggunakan model pelat. Model pelat berasumsi bahwa kolom dapat dibagi menjadi sejumlah seksi tertentu, atau pelat, dan kesetimbangan massa dapat dihitung untuk masing-masing pelat tunggal. Pendekatan ini memperkirakan kurva kromatogram sebagai kurva distribusi Gaussian. Dengan melakukan ini, lebar kurva diperkirakan 4 kali standar deviasi kurva, 4σ. Waktu retensi adalah waktu dari awal deteksi sinyal hingga waktu di titik puncak kurva Gaussian.
Menghitung resolusi pada kromatografi kolom
Resolusi, jumlah pelat, dan tinggi pelat model pelat kolom dapat dihitung menggunakan persamaan:
Resolusi (Rs):
Rs = 2(tRB – tRA)(wB + wA)
dengan: tRB = waktu retensi solut B tRA = waktu retensi solut A
wB = lebar alas kurva Gaussian solut B wA = lebar alas kurva Gaussian solut A Jumlah pelat (N):
Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative.
Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran.
Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi. Kekurangan:
Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual.
Waktunya lama (time consuming).
DAFTAR PUSTAKA
https://id.wikipedia.org/wiki/Kromatografi_kolom#Fasa_diam
Sudjadi.2014. Kimia Analisis Instrumental. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. Hardjono,S.2006. Kromatografi. Yogyakarta: Liberty.
