Uji Antikanker Kombinasi Ekstrak Etil Asetat Daun Poguntano (Picria fel-terrae Lour.) dengan Doksorubisin Terhadap Sel Kanker Payudara Secara In Bitro

(1)

(2)

Lampiran 2. Gambar daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

a

b

Keterangan:

a. Gambar daun poguntano

(3)

Lampiran 3. Hasil pemeriksaan mikroskopik serbuk SDPuntano

Keterangan (Perbesaran 10 x 40): a. Trikoma

b. Sel epidermis

c. Kristal kalsium oksalat bentuk prisma d. Stomata tipe diasitik

e. Stomata tipe anomositik

f. Berkas pembuluh angkut bentuk spiral g. Sel tetangga

a b

d

g e

c

(4)

Lampiran 4. Bagan ekstraksi serbuk simplisia secara maserasi bertingkat

dimaserasi dengan n-heksana

dimaserasi dengan etil asetat dipekatkan

dimaserasi dengan etanol dipekatkan diskrining

dipekatkan

diskrining

Keterangan : * = Uji Sitotoksik dan Uji Kombinasi dengan doksorubisin Serbuk simplisia

Ampas Maserat

Ampas Maserat Ekstrak n-heksana

Ampas Maserat

Ekstrak etil asetat*

Hasil

Ekstrak etanol

Hasil

(5)

(6)

Lampiran 6. Perhitungan kadar sari larut air SDP, ENDP, EEADP dan EEDP

Kadar sari

(7)

Lampiran 7. Perhitungan kadar sari larut etanol SDP, ENDP, EEADP dan EEDP

Kadar sari larut

(8)

Lampiran 8. Perhitungan kadar abu total SDP, ENDP, EEADP dan EEDP

Kadar abu total

(9)

Lampiran 9. Perhitungan kadar abu tidak larut asam SDP, ENDP, EEADP

Kadar abu total

(10)

Lampiran 10. Perhitungan persen sel hidup sel MCF-7

a. Kontrol sel dan kontrol media

Absorbansi kontrol sel

Rata-rata absorbansi kontrol sel

Absorbansi kontrol media

Rata-rata absorbansi kontrol media

Absorbansi kontrol sel dikurangi kontrol

media

Contoh pada kadar 250 ug/mL:

% Sel Hidup= x100%

(µg/mL) Absorbansi Absorbansi rata-rata

(11)

Lampiran 11. Perhitungan persen sel hidup sel T47D

media

% Sel Hidup= x100%

(12)

Lampiran 12. Perhitungan persen sel hidup sel Vero

media

% Sel Hidup= x100%

(13)

Lampiran 13. Bagan pembuatan media RPMI

Dimasukkan ke dalam erlenmeyer

Ditambahkan 800 mL aquabidest steril

Dihomogenkan menggunakan stirer magnet Diatur pH 7,2 – 7,4 (HCl 1 N atau NaOH 1 N)

Ditambahkan aquabidest steril sampai 1 liter

Dilakukan sterilisasi dengan penyaringan

Ditampung dalam botol steril

Diberi identitas pada botol media

Disimpan pada suhu 2 – 8oC

Keterangan : * = dapat diganti media DMEM atau M199 tergantung sel

RPMI Sachet* 2 g Hepes 2 g NaHCO3

(14)

Lampiran 14. Bagan pembuatan media komplit (MK) RPMI

Dicampur

Diberi identitas pada botol MK

Disimpan pada suhu 2 – 8oC

Fetal Bovine Serum (FBS)

(10%)

Penisilin- Streptomisin

(2%)

Fungizone (amphotericin B)

(0,5%)

RPMI ad 100%

(15)

Lampiran 15. Bagan penumbuhan sel

Diambil diambil dari freezer

Diambil beberapa tetes

Dimasukkan ke dalam konikel yg berisi RPMI

Disentrifus 6000 rpm selama 5 menit

Dibuang supernatan

Ditambahkan 4 mL MK RPMI

Diresuspensi hingga homogen

Dimasukkan ke dalam flask

Ditambahkan 5 mL MK ke dalam setiap flask

Dihomogenkan

Diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted

Diberi identitas pada flask

Disimpan dalam inkubator CO2

Sel MCF-7, T47D dan Vero

Konikel

(16)

Lampiran 16. Bagan panen sel

Dipersiapkan dan dikondisikan

Diamati apakah sel telah konfluen 80%

Dibuang MK dari flask dengan mikropipet

Dicuci sel 2 x dengan PBS

Ditambahkan 400 µL trypsine-EDTA 0,25%

Diinkubasi dalam inkubator CO2

Ditambahkan 4 mL MK

selama 5 menit

Di resuspensi dengan mikropipet

Diamati sel dibawah mikroskop inverted

Diresuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol

Ditransfer sel ke dalam tabung konikel Sel MCF-7, T47D dan

Vero

(17)

Lampiran 17. Bagan penghitungan sel

Diambil 10 µL panenan sel

Dipipetkan ke dalam hemositometer

Dihitung jumlah sel dibawah mikroskop

Kultur Sel T47D, MCF-7 dan Vero

Jumlah Sel T47D, MCF-7

(18)

Lampiran 18. Bagan pembuatan larutan uji

Ditimbang sebanyak 50 mg

Dimasukkan ke dalam polytube

Dilarutkan dalam 1000 µL DMSO

Divortex

Dibuat pengenceran sampai diperoleh konsentrasi 250 µg/mL, 125 µg/mL,

62,5 µg/mL, 31,25 µg/mL, dan 15,63 µg/mL EEADP

(19)

Lampiran 19. Bagan pengujian sitotoksik

Ditanam pada microplate 96 sumuran dengan kepadatan 1 x 10

Diinkubasi selama 24 jam

4

Dibuang medium

Ditambahkan medium baru

Ditambahkan larutan uji

Dibuang media dan larutan uji setelah 24 jam

Dicuci dengan PBS

Ditambahkan 100 µL MK dan 10 µL MTT (5 mg/mL)

Diinkubasi selama 4 - 6 jam

Ditambahkan SDS (sebagai stopper) Dibungkus dengan aluminium foil

Dibiarkan selama 1 malam

Dibaca serapan dengan ELISA readerpada λ 595 nm

Dihitung % sel hidup

Dihitung IC50

SPSS 17

dengan analisa probit menggunakan Sel

Absorbansi

(20)

Lampiran 20. Bagan pengujian flowsitometri

Ditanam pada microplate 6 sumuran dengan kepadatan 1 x 106

Diinkubasi selama 24 jam / sumuran

Dibuang medium

Larutan dipindahkan ke dalam tabung konikel berdasarkan konsentrasi

Dicuci dengan 1000 µL PBS. Hasil cucian dipindahkan konikel berdasarkan konsentrasi

Ditambahkan 150 µL Tripsin - EDTA

Ditambahkan MK untuk menginaktivasi Tripsin. Kumpulkan ke dalam konikel berdasarkan konsentrasi

Dicuci lagi dengan PBS. Hasil cucian dipindahkan konikel berdasarkan konsentrasi

Larutan yang terkumpul di masing-masing konikel disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 2500 rpm

Medium dibuang, ditambahkan PBS, diresuspensi. Suspensi dikumpulkan dalam polytube

disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 3000 rpm

larutan dibuang. Endapan di staining dengan Propidium Iodida

diukur dengan Flowsitometer Sel

(21)

Lampiran 21. Bagan pengujian imunositokimia

Dimasukkan 5 x 104 sel tiap sumuran yang telah diberi

coverslip pada bagian dasarnya

Dibuang medium

Dibuang media dan larutan uji setelah 24 jam

Dicuci dengan PBS

Difiksasi dengan metanol dingin selama 30 menit

Metanol dibuang. Coverslip diambil dari masing-masing sumuran menggunakan pinset. Coverslip

diletakkan di atas kaca objek

Dicuci dengan PBS 2 x masing-masing 500 µL

Dicuci dengan aquades masing-masing 500 µL, dikeringkan

Ditambahkan 300 µL H2O2

Ditambahkan prediluted blocking serum. Disimpan pada temperatur kamar. Didiamkan selama 15 menit.

(1 : 9 dalam aquades). Dicuci dengan PBS 2 x masing-masing 500 µL, dikeringkan

Ditambahkan antibodi primer Bcl-2/siklin D1. Didiamkan selama 60 menit. Dicuci dengan PBS 2 x masing-masing 500 µL, dikeringkan

(22)

Lampiran 21. (Lanjutan)

Ditambahkan antibodi sekunder. Didiamkan 20 menit. Dicuci dengan PBS 2 x masing-masing 500 µL,

dikeringkan.

Ditambahkan 100 µL larutan label. Didiamkan 10 menit. Dicuci dengan PBS 2 x masing-masing 500 µL, dikeringkan.

Ditambahkan 100 µL campuran 1 : 100 DAB Substrat. Didiamkan 10 menit. Dicuci dengan aquadest masing-masing 500 µL, dikeringkan.

Digenangi dengan 100 µL Mayer Hematoxicilin. Didiamkan 10 menit. Dicuci dengan aquadest hingga bersih masing-masing 500 µL, dikeringkan.

Ditambahkan etanol absolut

Ditambahkan xylol

Ditambahkan entelan untuk melekatkan coverslip

Diamati di bawah mikroskop cahaya

(23)

Lampiran 22. Sel MCF-7 dan T47D di bawah mikroskop

Keterangan: a. Sel MCF-7 sebelum diberi larutan uji (perbesaran 10 x 10) b. Sel MCF-7 setelah diberi larutan uji (sel mengalami perubahan bentuk morfologi) (perbesaran 10 x 10)

Keterangan: a. Sel T47D sebelum diberi larutan uji (perbesaran 10 x 10) b. Sel T47D setelah diberi larutan uji (sel mengalami perubahan bentuk morfologi) (perbesaran 10 x 10)

(24)

Lampiran 23. Sel Vero di bawah mikroskop

Keterangan: a. Sel Vero sebelum diberi larutan uji (perbesaran 10 x 10) b. Sel Vero setelah diberi larutan uji (sel mengalami perubahan

(25)

Lampiran 24. Microplate-96 sumuran

Keterangan: microplate-96 sumuran yang berisi sel dan larutan uji a.250 µg/mL

b.125µg/mL c.62,5 µg/mL d.31,25 µg/mL e.15,625 µg/mL f. Kontrol media g.Kontrol sel

a

b

e c

d

f

(26)

Lampiran 25. Hasil IC50

SPSS 17

EEADP pada sel MCF-7 dengan analisis probit

Confidence Limits

Probabil ity

95% Confidence Limits for konsentrasi

95% Confidence Limits for log(konsentrasi)a

Estimate

Lower Bound

Upper

Bound Estimate

(27)

SPSS 17

EEADP pada sel T47D dengan analisis probit

Probabil ity

Estimate

Lower Bound

Upper

Bound Estimate

(28)

SPSS 17

EEADP pada sel Vero dengan analisis probit

Probabi lity

Estimate

Lower Bound

Upper

Bound Estimate Lower Bound Upper Bound

(29)

Lampiran 28. Indeks kombinasi (IK) EEADP - doksorubisin pada sel MCF-7 I = (D)1/(Dx)1 + (D)2/(Dx)

I = IK

2

Dx = konsentrasi dari satu senyawa tunggal (IC50

(D)

)

1 dan (D)2 = besarnya konsentrasi kedua senyawa untuk memberikan efek

yang sama

Absorbansi (tunggal)

µg/mL EEADP

60 0,697 0,655 0,584

45 0,649 0,621 0,698

30 0,635 0,706 0,680

15 0,652 0,594 0,575

µg/mL Doksorubisin tunggal Kontrol sel

4 0,480 0,504 0,524 0,688 0,658 0,632 0,659

3 0,433 0,458 0,497

2 0,486 0,515 0,628 Kontrol media

1 0,497 0,465 0,506 0,104 0,101 0,115 0,107

% Sel hidup (tunggal)

µg/mL EEADP (%) Rata-rata (%)

60 106,82 99,22 86,37 97,47

45 98,13 93,06 107,00 99,40

30 95,60 108,44 103,74 102,59

15 98,67 88,18 84,74 90,53

µg/mL Doksorubisin (%) Rata-rata (%)

4 67,55 71,89 75,51 71,65

3 59,05 63,57 70,63 64,41

2 68,64 73,88 94,33 78,95

(30)

Lampiran 28. (Lanjutan)

Absorbansi (kombinasi)

Dokso 4 µg/mL Dokso 3 µg/mL

EEADP 60 0,510 0,522 0,503 0,499 0,515 0,445 µg/mL 45 0,535 0,547 0,549 0,518 0,431 0,511 30 0,547 0,592 0,603 0,790 0,730 0,566 15 0,587 0,545 0,538 0,562 0,633 0,484

Dokso 2 µg/mL Dokso 1 µg/mL

EEADP 60 0,522 0,482 0,513 0,464 0,458 0,457 µg/mL 45 0,529 0,537 0,520 0,473 0,463 0,538 30 0,561 0,582 0,519 0,517 0,601 0,559 15 0,539 0,542 0,458 0,463 0,771 0,412

% Sel hidup (kombinasi)

Dokso 4 (%) Dokso 3 (%)

EEADP 60 72,98 75,15 71,71 70,99 73,88 61,22 µg/mL 45 77,50 79,67 80,04 74,43 58,69 73,16 30 79,67 87,82 89,81 123,64 112,79 83,11 15 86,91 79,31 78,05 82,39 95,24 68,28

Dokso 2 (%) Dokso 1 (%)

EEADP 60 75,15 67,91 73,52 64,66 63,57 63,39 µg/mL 45 76,42 77,86 74,79 66,28 64,48 78,05 30 82,21 86,01 74,61 74,25 89,45 81,85 15 78,23 78,77 63,57 64,48 120,21 55,25

Dokso µg/mL EEADP

µg/mL

0 4 3 2 1

0 100 71,65 64,41 78,95 69,24

60 97,47 73,28 68,70 72,20 63,87

45 99,40 79,07 68,76 76,36 69,60

30 102,59 85,77 106,51 80,94 81,85

(31)

Dokso tunggal

µg/mL 4 3 2 1

4 9,939 8,829 9,676 7,661

3 11,341 8,844 10,684 9,048

2 12,962 17,986 11,794 12,013

1 11,911 12,042 9,998 11,560

EEADP µg/mL 60 45 30 15

60 50,272 70,736 55,119 92,276

45 24,423 70,466 36,540 66,697

30 5,464 98,089 16,076 12,038

15 13,922 11,499 49,195 20,384

Indeks Kombinasi

Dokso µg/mL

EEADP µg/mL 4 3 2 1

60 0,79 0,51 0,88 0,52

45 1,49 0,30 1,04 0,56

30 5,80 0,47 1,70 2,41

(32)

Lampiran 29. Indeks kombinasi (IK) EEADP - doksorubisin pada sel T47D I = (D)1/(Dx)1 + (D)2/(Dx)

I = IK

2

Dx = konsentrasi dari satu senyawa tunggal (IC50

(D)

)

1 dan (D)2 = besarnya konsentrasi kedua senyawa untuk memberikan efek

yang sama

Absorbansi (tunggal)

µg/mL EEADP

50,0 0,712 0,665 0,681

37,5 0,750 0,759 0,752

25,0 0,823 0,648 0,730

12,5 0,903 0,735 0,798

µg/mL Doksorubisin Kontrol sel

1,00 0,439 0,530 0,527 0,761 0,842 0,707 0,77

0,75 0,398 0,471 0,400

0,50 0,226 0,218 0,221 Kontrol media

0,25 0,220 0,211 0,210 0,102 0,110 0,110 0,107

Sel hidup (tunggal)

µg/mL EEADP Rata-rata

50,0 91,25 84,15 86,57 87,32

37,5 96,98 98,34 97,28 97,54

25,0 108,00 81,59 93,96 94,52

12,5 120,07 94,72 104,23 106,34

µg/mL Doksorubisin Rata-rata

1,00 50,05 63,78 63,33 59,05

0,75 43,86 54,88 44,16 47,64

0,50 17,91 16,70 17,15 17,25

(33)

Absorbansi (kombinasi)

Dokso 1 µg/mL Dokso 0,75 µg/mL

EEADP 50,0 0,512 0,505 0,484 0,534 0,551 0,565 µg/mL 37,5 0,597 0,565 0,577 0,521 0,581 0,632 25,0 0,588 0,532 0,563 0,519 0,475 0,520 12,5 0,537 0,572 0,545 0,489 0,474 0,596

Dokso 0,50 µg/mL Dokso 0,25 µg/mL

EEADP 50,0 0,218 0,212 0,276 0,198 0,241 0,189 µg/mL 37,5 0,208 0,213 0,241 0,220 0,227 0,197 25,0 0,214 0,205 0,287 0,253 0,223 0,198 12,5 0,238 0,251 0,209 0,202 0,183 0,217

% Sel hidup (kombinasi)

Dokso 1,00 (%) Dokso 0,75 (%)

EEADP 50,0 61,07 60,01 56,84 64,39 66,59 69,06 µg/mL 37,5 73,89 69,06 70,88 62,42 71,48 79,18 25,0 72,54 64,08 68,76 62,12 55,48 62,27 12,5 64,84 70,12 66,05 57,60 55,33 73,74

Dokso 0,50 (%) Dokso 0,25 (%)

EEADP 50,0 16,70 15,79 25,45 13,68 20,17 12,32 µg/mL 37,5 15,19 15,95 20,17 17,00 18,06 13,53 25,0 16,10 14,74 27,11 21,98 17,45 13,68 12,5 19,72 21,68 15,34 14,29 11,42 16,55

Doksorubisin µg/mL

EEADP µg/mL

0 1,00 0,75 0,50 0,25

0 100 59,05 47,64 17,25 16,05

50,0 87,32 59,31 66,80 19,32 15,39

37,5 97,54 71,28 71,03 17,10 16,20

25,0 94,52 68,46 59,96 19,32 17,71

(34)

Dokso tunggal

µg/mL 1,00 0,75 0,50 0,25

1,00 1,960 5,064 14,605 16,231

0,75 6,919 6,815 15,522 15,897

0,50 5,752 2,231 14,605 15,272

0,25 5,148 3,168 14,772 16,773

EEADP µg/mL 50,0 37,5 25,0 12,5

50,0 95,409 62,823 269,279 286,338

37,5 43,358 44,451 278,902 282,838

25,0 55,605 92,566 269,279 276,277

12,5 61,948 82,725 271,028 292,024

Indeks Kombinasi Doksorubisin µg/mL

EEADP µg/mL 1,00 0,75 0,50 0,25

50,0 0,06 0,64 0,22 0,19

37,5 0,72 0,73 0,17 0,15

25,0 0,28 0,09 0,13 0,11

(35)

Lampiran 30. LAF (Laminar Air Flow), inkubator CO2 dan mikroskop inverted

Keterangan: Laminar Air Flow

Keterangan : Mikroskop inverted

(36)

Lampiran 31. ELISA reader dan Flowsitometer

Keterangan : ELISA reader