Eksplorasi Cendawan Endofitik Akar Asal Rawa Danau
BANTEN dan Potensi Pengembangannya Sebagai Agen
Pengendali Hayati Penyakit Layu
Fusarium
Sayuran
Nani MARYANI
1*, Andree SYAILENDRA
2, Rida OKTORIDA
KHASTINI
1Prodi Pendidikan Biologi FKIP UNTIRTA, Banten1 Jurusan Agroteknologi, Fakutas Pertanian UNTIRTA, Banten2
Email: nani.maryani29@gmail.com
Abstrak. Akar rumput asal Cagar Alam Rawa Danau Serang Banten digunakan sebagai sumber isolasi fungi endofitik. Fungi endofitik hasil isolasi diharapkan dapat digunakan sebagai agen biokontrol yang potensial melawan penyakit layu Fusarium yang menyerang sayuran. 6 isolat yang berhasil diisolasi hanya dapat diidentifikasi sampai tingkat morfologi koloninya. Isolat-isolat ini gagal membentuk struktur reproduksi seksual dan aseksual pada media kultur. Uji antagonisme tidak dapat dilakukan karena tingginya kontaminasi di laboratorium selama penelitian berlangsung. Penelitian selanjutnya akan difokuskan pada seleksi isolat-isolat yang memiliki aktifitas antagonis terhadap Fusarium dan identifikasi isolat dengan menginduksi fase seksual dan aseksual fungi.
Kata Kunci: fungi endofitik, isolat, agen biokontrol
PENDAHULUAN
Komoditas hortikultura berupa sayuran selama ini telah memberikan kontribusi yang cukup besar terhadap pendapatan petani. Hal ini berkaitan dengan jumlah konsumsi sayuran penduduk Indonesia semakin meningkat setiap tahunnya dan semakin bertambahnya kesadaran masyarakat untuk mengkonsumsi sayuran sebagai makanan sehat. Data yang diperoleh dari Departemen Pertanian menunjukkan pada tahun 2005, sayuran yang dikonsumsi penduduk Indonesia sebesar 35,30 kg/kapita/tahun, tahun 2006 sebesar 34,06 kg/kapita /tahun dan tahun 2007 meningkat sebesar 40,90 kg/kapita/tahun. Dengan semakin meningkatnya kebutuhan akan komoditas sayuran, maka diperlukan upaya-upaya dalam meningkatkan kualitas dan kuantitas produksi sayuran serta pendapatan petani sayuran.
Namun dalam upaya peningkatan kualitas dan kuantitas produksi sayuran ini, seringkali penyakit menjadi masalah
penting dalam budidaya tanaman sayur yang diusahakan petani. Selain petani, dampak penyakit tersebut secara tidak langsung juga dirasakan oleh masyarakat seperti adanya kenaikan harga pada saat terjadi kelangkaan produk sayuran akibat serangan penyakit.
dapat berakibat sangat merugikan kesehatan manusia. Mengingat dampak serius dari pemakaian pestisida kimia terhadap kesehatan manusia, lingkungan dan lahan pertanian, dan kepedulian terhadap pelestarian lingkungan perlu dipertimbangkan cara lain untuk mengendalikan penyakit tersebut.
Pengendalian secara hayati merupakan cara alternatif dalam mengendalikan penyakit layu yang disebabkan oleh Fusarium. Mikroorganisme termasuk cendawan mempunyai potensi yang dapat dikembangkan sebagai agen pengendali hayati. Cendawan yang dapat digunakan sebagai pengendali hayati diantaranya ialah cendawan endofitik akar. Cendawan endofit adalah cendawan yang hidup di dalam jaringan tanaman pada periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan inangnya. Berbagai penelitian melaporkan jenis cendawan endofit yang berperan sebagai agen pengendali hayati seperti penelitian yang dilaporkan mengenai cendawan endofit Heteroconium chaetospira dapat mengendalikan penyakit Verticillium kuning pada sawi.
Cagar alam Rawa Danau yang terletak di kabupaten Serang, Provinsi Banten merupakan kawasan konservasi yang kaya akan ekosistem. Sebanyak 250 jenis burung, dan fauna lainnya seperti reptil, ular, buaya bermukim area seluas 2.500 ha. Sedangkan untuk flora didominasi oleh jenis tumbuhan rawa seperti Rumput Liar, Kaso (Saccharum spontaneum), dan Gempol (Glochidion glomerulatum). Selama ini informasi mengenai keragaman hanya berkisar pada populasi flora dan fauna sedangkan informasi keragaman mikroorganisme pada kawasan ini masih belum diketahui. Informasi keragaman mikroorganisme sangat penting untuk diketahui karena dapat dijadikan sebagai dasar untuk pengembangan potensi yang
dimiliki mikroorganisme tersebut, dalam hal ini sebagai agen pengendali hayati penyakit tanaman dan kesempatan untuk menemukan agen pengendali hayati penyakit layu Fusarium sangat besar, mengingat Indonesia merupakan negara dengan biodiversitas yang tinggi dan Cagar Alam Rawa Danau merupakan salah satu lokasi yang dapat dieksplorasi untuk mendapatkan isolat-isolat yang berpotensi sebagai agen pengendali hayati.
Penelitian yang dilakukan memiliki tujuan mendapatkan isolat-isolat cendawan endofitik akar yang berpotensi sebagai agen pengendali hayati penyakit layu fusarium, mengetahui tingkat keragaman cendawan endofitik akar asal rawa danau. Informasi data keragaman dapat dijadikan sebagai data dasar untuk menganalisis potensi isolat cendawan yang diperoleh.
METODE PENELITIAN
Bahan dan Alat
Bahan yang diperlukan dalam penelitian ini ialah sampel akar tanaman rumput asal cagar alam Rawa danau yang akan diisolasi dan diidentifikasi serta dianalisis potensinya sebagai agen pengendali hayati. Isolat cendawan Fusarium oxisporum sebagai sumber inokulum cendawan patogen. Media tumbuh yang digunakan untuk isolasi cendawan berupa media Corn Meal Agar (CMA), sedangkan untuk pemeliharaan cendawan digunakan media CMMY (Corn Meal Malt Yeast) dan Oat Meal Agar (OMA). Alat-alat yang diperlukan ialah alat-alat gelas dan mikroskop, peralatan diseksi, laminar, autoklaf.
rawa danau sedalam 10 cm dari permukaan tanah.
Isolasi Cendawan Endofitik Akar
Cendawan endofitik akar diisolasi dengan menggunakan metode Isolasi Langsung. Sampel akar tanaman yang dikoleksi dari Rawa Danau dicuci menggunakan air mengalir dan dipotong dengan ukuran panjang ± 0.3-1 cm. Akar kemudian disterilisasi permukaannya menggunakan alkohol 70% (v/v) selama 1 menit dilanjutkan NaOCl 0.1% (v/v) selama 15 menit dan dibilas dengan menggunakan air steril sebanyak 3 kali. Akar kemudian dikeringkan dengan menggunakan tissue steril. Potongan akar ditempatkan dalam media Corn Meal Agar (CMA) yang mengandung antibiotik kloramfenikol 0,1 µg/l . Media tersebut diinkubasikan pada suhu ruang selama 7 hari. Miselium cendawan yang tumbuh selanjutnya dimurnikan pada media PDA (potato dextrose agar) sampai didapatkan isolat murni. Pemurnian dan pengelompokan isolat fungi yang berbeda berdasarkan karakterisitik fenotipik morfologi koloni, warna koloni dan growth rate. Isolat murni kemudian disimpan pada media PDA agar mring.
Identifikasi Cendawan Endofitik Akar Isolat-isolat cendawan yang telah diisolasi kemudian diidentifikasi. Identifikasi dilakukan menggunakan mikroskop dengan mengamati beberapa karakter morfologi baik secara makroskopis maupun secara mikroskopis. Secara makroskopis karakter yang diamati meliputi; warna dan permukaan koloni, tekstur, zonasi, daerah tumbuh, garis-garis radial dan konsentris, warna balik koloni (reverse color), dan tetes eksudat (exudate drops). Pengamatan secara mikroskopis meliputi; ada tidaknya septa pada hifa, pigmentasi hifa, clamp connection, bentuk dan ornamentasi spora (vegetatif dan generatif), bentuk dan ornamentasi tangkai
spora, dan lainnya. Identifikasi berdasarkan panduan Barnett and Hunter, dan Alexopolous.
Uji Antagonisme antara Cendawan Endofitik Akar dengan Fusarium sp. sebagai Agen Penyebab Penyakit Fusarium Sayuran
Potensi cendawan endofitik akar sebagai agen biokontrol dapat diketahui dengan menumbuhkan cendawan endofitik akar pada medium CMMY dan diinkubasi selama 1 minggu. Setelah 1 minggu inkubasi, pada medium yang sama ditumbuhkan pula cendawan patogen Fusarium dan diinkubasi selama 1 minggu. Isolat cendawan endofit yang berpotensi sebagai agen pengendali hayati dapat diketahui dari kemampuannya menghambat pertumbuhan Fusarium melalui mekanisme antagonisme.
Setiap isolat cendawan endofitik yang berhasil diisolasi dari akar tanaman vegetasi dominan asal rawa danau di uji sifat antagonistiknya terhadap Fusarium sp. Dengan menggunakan metode oposisi langsung. Fusarium ditumbuhkan secara berpasangan dengan setiap isolat cendawan endofitik yang diperoleh di tengah media CMMY dalam cawan petri (ф 9 cm) dengan jarak 3 cm. Inokulus dari setiap isolat terdiri dari potongan biakan berdiameter 5 mm. Semua cawan petridiinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari. Persentase hambatan pertumbuhan setiap isolat Fusarium oleh cendawan uji dihitung berdasarkan Forkema : isolat cendawan uji (mm)
j2 = jari-jari koloni fusarium yang tumbuh
Pengamatan mekanisme antagonisme dilakukan secara makroskopis dengan mengamati interaksi antar cendawan berupa tipe interaksi maupun pembentukan zona hambatan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kawasan cagar alam Rawa Danau merupakan kawasan rawa pegunungan yang terbagi menjadi tiga daerah dominan yaitu kawasan rawa, daerah pasang surut rawa, dan persawahan. Kawasan persawahan umumnya sudah tidak memiliki vegetasi khas Rawa Danau, daerah ini sepenuhnya sudah dikelola penduduk sehingga vegetasi dominan adalah padi yang ditanami. Vegetasi dominan pada daerah rawa dan daerah pasang surut adalah rumput. Dominasi vegetasi Rawa Danau pada tingkat semai dan pancang adalah dari jenis rumput dengan INP (indeks nilai penting) tertinggi. Vegetasi dominan yang digunakan sebagai bahan sampel untuk mengisolasi endofitik fungi adalah vegetasi dari jenis rumput (GAMBAR 2). Rumput jenis yang sama diambil pada daerah rawa (basah) dan daerah pasang surut (kering).
Endofitic fungi umumnya dapat di temukan pada semua tanaman herba, woody angiosperm, termasuk famili rerumputan (grass). Biodoversitas endofitik fungi telah diketahui sangat tinggi terutama dari host famili rerumputan. Sebanyak 290 spesies rumput terinfeksi endofit, 80 genus, 259 spesies Graminae dilaporkan merupakan tanaman host clavicipitaceous endofit. Jumlah ini masih terus bertambah dan diperkirakan sekitar 20-30% spesies rumput diseluruh dunia berasosiasi dengan endofit.
Bagian tanaman yang digunakan untuk isolasi adalah akar rumput. Hampir semua bagian tanaman dapat berasosiasi dengan endofitic fungi termasuk bagian akar. Ilyas
et al. berhasil mengisolasi 53 isolat endofitic fungi dari seluruh bagian tanaman Uncaria gambier asal sumatera barat, bagian tanaman yang diisolasi adalah akar, batang, daun dan buah.
Isolasi endofitik fungi asal rumput diambil dari dua kawasan utama Rawa Danau yaitu daerah rawa dan daerah pasang surut. 6 isolat endofitik fungi berhasil diisolasi dari akar rumput daerah pasang surut (kering) sedangkan pada akar rumput asal rawa (basah) tidak ditemukan adanya kolonisasi fungi pada media isolasi. Isolat-isolat endofitic fungi tersebut dengan kode KR1B, KR3B, KR2B, KR5A, KR2A, dan KR2C hanya dapat diidentifikasi dan diklasifikasikan sampai pada tahap pengelompokkan melalui pengamatan karakter morfologi koloni (TABEL 1).
Pengamatan mikroskopis seluruh isolat tidak menunjukkan pertumbuhan struktur reproduksinya sehingga identifikasi melalui jenis spora tidak dapat dilakukan. Struktur seksual dan aseksual fungi merupakan kunci penting identifikasi yang paling valid digunakan dalam klasifikasi dan taxonomi Fungi.
Tabel 1. Hasil isolasi endofitic fungi asal akar
Kode Isolat Karakter morfologi koloni isolat
KR1B Diameter koloni pada media CMA hari ke 7 ± 2 cm, pada Media PDA hari ke 7 ± 3 cm. koloni: greyish white, reverse coloni white, slow growing, dence submerge mycelium, form grey cosentric zone, white eksudates .
KR3B Diameter koloni pada media CMA hari ke 7 ± 3 cm, pada Media PDA hari ke 7 ± 5 cm. koloni: green-cottony, reverse colony green, aerial mycelium with cocentric zone.
KR2B Diameter koloni pada media CMA hari ke 7 ± 3 cm, pada Media PDA hari ke 7 ± 4 cm. koloni: red yellow-cottony, reverse colony orange, slow growing, dence aerial mycelium, yelowish eksudates. KR5A Diameter koloni pada media CMA hari ke 7 ± 3 cm, pada Media
PDA hari ke 7 ± 4 cm. koloni: cottony-greyish back, reverse coloni black, slow growing, dence aerial mycelium, form black eksudates. KR2A Diameter koloni pada media CMA hari ke 7 ± 4 cm, pada Media PDA hari ke 7 ± 6 cm. koloni: cottony-greyish red, reverse colony red, slow growing, dence aerial mycelium, redish eksudates. KR2C Diameter koloni pada media CMA hari ke 7 ± 4 cm, pada Media
PDA hari ke 7 ± 6 cm. koloni: cottony-greyish green, reverse coloni green, slow growing, dence aerial mycelium, white eksudates.
Metode klasifikasi pada penelitian ini menggunakan metode tradisional sederhana melalui pengamatan struktur reproduksinya. Pengelompokkan isolat Fungi secara tradisional yang hanya menunjukkan miselium streril berdasarkan karakter morfologi yang mirip disebut ‖morphospecies‖. Sulitnya mengidentifikasi endophytic fungi yang tidak menunjukkan struktur reproduksinya sangat umum terjadi, isolat yang ditumbuhkan pada medium PDA hanya menunjukkan miselium steril. Dengan metode tradisional, Guo, Hyde dan Liew hanya mampu mengidentifikasi karakter morfologi 16 isolat endofitic fungi asal palem tropis Livistona chinensis, sedangkan 19 isolat lainya di identifikasi menggunakan analisis sekuensing rDNA. Isolat-isolat endophytic fungi tidak dapat diidentifikasi karena gagal membentuk tubuh buah pada media kultur, dan hanya dapat dilakukan melalui identifikasi molecular dari ekstrak DNA
kemudian dianalisis nuclear ribosomal DNA-nya (rDNA).
Karakter morfologi isolat umumnya adalah slow growing coloni kecuali isolat KR3B yang menunjukkan pertumbuhan cepat pada media PDA, isolat KR1B adalah isolat yang paling lambat pertumbuhan koloninya. Pertumbuhan diameter miselium sangat lambat, steril, dan tidak terbentuk struktur reproduksi seksual maupun aseksual sampai hari ke 30 inkubasi pada suhu kamar. Isolat endophytic fungi yang hanya memiliki steril hypha gagal membentuk struktur aseksual ataupun seksualnya sampai hari ke 60 inkubasi pada media PDA. Beberapa isolat endofit fungi yang ditumbuhkan pada medium PDA menunjukkan slow growth micelium fungi sedangkan pada media Czapek‘s Dox agar miselium tumbuh cepat.
zona kosentrik (Gambar 2 dan 3). Tipe pertumbuhan miselium isolat KR2A dan KR2C (Gambar 4 dan 5) sangat mirip, pada hari ke 7 inkubasi diameter miselium pada media PDA ± 6 cm. Karakter miselium seperti beludru, masa miselium bagian tengah lebih jelas menunjukkan warna gelap masing-masing isolat sedangkan semakin ke luar diameter miselium warna semakin abu-abu. Miselium endofitic fungi yang tidak membentuk struktur reproduksi ditemukan mengeluarkan eksudates pada permukaan koloninya.
Gambar 2. Morfologi koloni isolat KR1B
Gambar 3. Morfologi koloni isolat KR3B
Gambar 4. Morfologi koloni isolat KR2AB
Gambar 5. Morfologi koloni isolat KR2A
Gambar 6. Isolat pada PDA agar cawan terkontaminasi
Gambar 7. Isolat pada PDA agar miring, tingkat kontaminasi rendah
Uji antagonisme gagal dilakukan pada penelitian ini disebabkan tingkat kontaminasi yang sangat tinggi. Kultur murni yang ditumbuhkan pada medium PDA agar cawan (Gambar 6) rentan sekali kontaminasi, dibanding yang disimpan pada media simpat PDA agar miring (Gambar 7). Pengukuran diameter koloni menjadi sulit dilakukan dengan banyaknya fungi kontaminan yang tumbuh pada media uji.
Penelitian selanjunya akan fokus pada penanganan kontaminasi laboratorium pada uji antagonisme dan penapisan isolat-isolat yang potensial sebagai agens biokontrol penyakit layu Fusarium. Uji endofitic akan dilakukan untuk menguji efektifitas isolat melalui metode dual culture. Efek infeksi dapat diketahui dengan cukup mudah melalui teknik kultur jaringan dengan modifikasi menggunakan media OMA.
berbagai keperluan diantaranya mampu menghasilkan substansi aktif penghambat mikroba dengan spketrum luas. Karakter ini menjadikannya sangat potensial untuk dijadikan agen bikontrol pengendali hayati baik bakteri maupuan fungi lain. Abdel-Motaal et al. berhasil menunjukkan bahwa endofitik fungi yang diisolasi dari Hyoscyamus muticis L. mampu mensekresi substansi ekstraseluler yang memiliki aktifitas antifungal yang tinggi sehingga dapat digunakan untuk menghambat cendawan patogen tanaman. Sebagai agens biokontrol, endofitic fungi yang diisolasi dari tanaman yang sama Theobroma cacao terbukti secara in vitro antagonis terhadap patogen utama tanaman cacao seperti Phytophthora spp. Endophytic morphospesies ini juga menunjukkan pengahambatan melalui mekasnisme antibiosis.
KESIMPULAN
6 isolat endofitik fungi berhasil diisolasi dari akar rumput asal Rawa Danau, Serang Banten. Rumput yang disiolasi merupakan vegetasi dominan Rawa Danau daerah pasang surut rawa (kering). Isolat-isolat ini hanya dapat diidentifikasi sampai tingkat morfologi koloni karena ketiadaan struktur reproduksi seksual dan aseksual pada media isolasi. Morfologi dan karakter koloni mirip, miselium steril, morphospesies. Uji antagonisme belum berhasil dilakukan karena tingkat kontaminasi laboratorium yang sangat tinggi saat penelitian berlangsung. Penelitian selanjutnya akan difokuskan pada pengujian potensi isolat sebagai agen biokontrol penyakit layu Fusarium sayuran.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini didanai program penelitian dosen muda (PDM) LPPM UNTIRTA tahun 2010.
DAFTAR PUSTAKA
Semangun H. (2007). Penyakit-penyakit Tanaman Hortikultura di Indonesia Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.
Nuryani W, Hanudin, Djatmika I, Evi S, dan Muhidin. (2003). Pengendalian penyakit layuFusarium pada Anyelir dengan formulasi Pseudomonas fluorescens, Gliocladium sp., dan Trichoderma harzianum. Jurnal Fitopatologi Indonesia. J. Fitpat. Ind. 7(2): 71-75.
Shaw, I., E. Burke, F. Suharyanto, and G. Sihombing. (2000). Residues of p,p‘ -DDT and hexachlorobenzene in human milk from Indonesian women. Environmental Science and Pollution Research 7 (2): 75-77.
Narisawa KF, Usuki T and Hashiba. (2005). Control of Verticillium yellows in Chinese cabbage by the Dark-septate endophytic fungus LtVB3, , Phytopathology, 94, , 412-418, , 2004
Leksono S. et al. (2009). Kajian valuasi ekologi dan ekonomi biodiversitas di Cagar Alam Rawa Danau dan Tukung Gede, Serang Banten. Laporan Hibah Penelitian STRANAS. Unpublished.
Barnet H.L, Hunter B.B. (1978). Illustrated Genera of Imperfect Fungi. APS press home.
Alexopoulos C.J., Mims C.W., Blackwell M. (1996). Introductory Mycology, 4th Edition. John Wiley & Sons Inc.
Dennis C, Webster J. (1971). Antagonistic Properties of species groups of Trichoderma; Hyphal interaction. Trans Brit Mycol Soc 57: 363-369
plates on rye leaves with pollen. Physiol Plant Path 3: 195-205
Cheplick GP, Faeth SH. (2009). Ecology and Evolution of the Grass-Endophyte Symbiosis. Oxford: Oxford University Press, Inc.
Ilyas M, Kanti A, Jamal Y,Hertina, Agusta A. (2008). Biodiversity of endophytic fungi associated with Uncaria gambier Roxb. (Rubiaceae) from west Sumatera. Biodiversitas Vol.10.No.1.: 23-28.
Moore E and Landecker. 1996. Fundamentals of the Fungi, 4th ed. New Jersey: Prentice Hall,inc.
Guo LD, Hyde KD, and Liew CY. (2000). Identification of endophytic fungi from Livistona chinensis based on morphology and rDNA sequences. New Phytol. (2000), 147, 617±630
Crozier J. et al. (2006). Molecular characterization of fungal endophytic morphospecies isolated from stems and pods of Theobroma cacao. Plant Pathology (2006) 55, 783–791
Khan R, Shahzad S, Choudary MI, Khan SA, Ahmad A. (2007). Biodiversity of endophytic fungi isolated from Calothropis Procera (AIT) R.BR. J. Bot., 39(6): 2233-2239, 2007.
Abdel-Motall et al. (2010). Antifungal activity of endophytic fungi isolated from egyptian henbane (Myoscyamus musticus L). Pak. J. Bot., 42(4): 2883-2894, 2010.
