NURKHULAILAH
STUDI HUBUNGAN KADAR SENYAWA AKTIF SULFAMETOKSAZOL, TRIMETOPRIM, DAN
KOTRIMOKSAZOL YANG DITETAPKAN SECARA SPEKTROFOTOMETRI
LEMBAYUNG ULTRA
DENGAN DIAMETER DAERAH HAMBATAN TERHADAP
BAKTERI ESCHERICHIA COLI ATCC 10536
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA
1995
STUDI HUBUNGAN KADAR SENYAWA AKTIF SULFAMETOKSAZOL, TRIMETOPRIM DAN KOTRIMOKSAZOL YANG DITETAPKAN SECARA SPEKTROFOTOMETRI LEMBAYUNG ULTRA DENGAN DIAMETER DAERAH
HAMBATAN TERHADAP
BAKTERI ESCHERICHIA COLI ATCC 10536
SKRIPSI
Dibuat untuk memenuhi syarat mencapai gelar Sarjana Sains pada Fakultas Farmasi
Universitas Airlangga 1995
oleh : Nurkhulailah 058911143
disetujui oleh pembimbing
D
DB*
Pembimbing Utama
Dr,g., Robbv Sondakh. MS Pembimbing Serta
Drs^ Bambang Tri Purwanto,MS Pembimbing Serta
KATA PENGANTAR
Puji syukur saya panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala anugerahNya, sehingga skripsl yang berjudul STUDI HUBUNGAN KADAR SENYAWA AKTIF SULFAMETOKSAZOL, TRIMETOPRIM DAN KOTRIMOKSAZOL YANG DITETAPKAN SECARA SPEKTROFOTOMETRI DENGAN DIAMETER DAERAH HAMBATAN TERHADAP BAKTERI ESCHERICHIA COLI dapat diselesaikan, sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Airlangga,
Dalam penyelesaian tugas ini banyak bantuan saya peroleh dari berbagai pihak. Rasa terima kasih yang tak terhingga kami ucapkan kepada :
1. Bapak DR. Purwanto , dari Laboratorium Kimia Medisinal Jurusan Kimia Farmasi Universitas Airlangga selaku Pembimbing Utama.
2. Bapak Drs. Robby Sondakh MS, dari Laboratorium Kimia Medisinal Jurusan Kimia Farmasi Universitas Airlangga selaku Pembimbing Serta.
3. Bapak Drs. Bambang Tri Purwanto MS, dari Laboratorium Kimia Medisinal Jurusan Kimia Farmasi Universitas Airlangga selaku Pembimbing Serta.
4. Bapak DR. Azis Hubeis, Bapak Drs. Radjaram MS, Bapak Drs. Siswandono MS, Bapak Drs. Soedarto MS, selaku Dosen Penguji.
5. PT Bernofarm, Sidoarjo yang telah membantu menyediakan
i
bahan untuk penelitian ini.
6. Bapak Ketua Jurusan Kimia Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Kepala Laboratorium Medisinal dan Kepala Laboratorium Analisis Farmasi serta segenap karyawan yang telah memberikan fasilitas dan bantuan yang kami perlukan dalam penelitian ini.
7. Keluarga dan teman-teman yang telah memberikan bantuan dan dorongan dalam menyelesaikan skripsi ini.
8. Pihak-pihak lain yang tak dapat kami sebut satu persatu. Harapan kami semoga penelitian yang telah kami lakukan dapat bermanfaat bagi kemajuan Fakultas Farmasi pada khususnya dan masyarakat luas pada umumnya.
Surabaya, Februari 1995 Penyusun
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR... i
DAFTAR ISI... '... iii
DAFTAR TABEL... vii
DAFTAR GAMBAR... ix
DAFTAR LAMP I RAN... xi
RINGKASAN... xii
BAB I . PENDAHULUAN... 1
1. Latar belakang permasalahan ... 1
2. Tujuan penelitian... 4
3. Hipotesa... 4
II. TINJAUAN PUSTAKA... 5
1. Tinjauan tentang sulfametoksazol... 5
1.1. Sifat fisika kimia sulfametoksazol... 5
1.2. Stabilitas sulfametokasazol... 6
1.3. Mekanisme aksi... 6
2. Tinjauan tentang trimetoprim... . 8
2.1. Sifat fisika kimia trimetoprim... 8
2.2. Stabilitas trimetoprim... 9
2.3. Mekanisme aksi... 9 Halaman
iii
10 10
12 12 12
12 13
13 13 13 13 14
14 17 17 18 20 20
21 21 Tinjau&n tentang kotrimoksazol...
3.1. Mekanisme aksi...
Penentuan kadar senyawa aktif secara kimia pada sulfametoksazol...
4.1. Metode kolorimutri...
4.2. Metode fluorometri...
4.3. Metode titrimetri...
4.4. Metode spektrofotometri...
Penentuan kadar senyawa aktif secara kimia pada trimetoprim...
5.1. Metode spektrofluorometri...
5.2. Metode titrimetri...
5.3. Metode polarografi...
5.4. Metode spektrofotometri...
Penentuan kadar senyawa aktif kotrimoksazol secara kimia...
Uji aktivitas secara mikrobiologis...
7.1. Metode dilusi...
7.2. Metode difusi...
TinJauan tentang Escherichia coll...
8.1. Morfologi...
B.2. Biakan... ...
8.3. Sifat-sifat pertumbuhan... .
III. METODOLOGI PENELITIAN... 22
1. Bahan-bahan... ... 22
2. Alat-alat... 22
3. Cara pelaksanaan... ... 23
3.1. Pemeriksaan kualitatif senyawa sulfametoksazol... 23
3.2. Pemeriksaan kualitatif senyawa trimetoprim... 24
3.3. Penetapan kadar sulfametoksazol, trimetoprim dan kotrimoksazol secara spektrofotometri... 24
3.4. Penetapan kadar sulfametoksazol dan trimetoprim dalam campuran... 25
3.5. Pemeriksaan terhadap Escherichia coli... 28
3.6. Penentuan diameter daerah hambatan larutan uji sulfametoksazol, trimetoprim dan kotrimoksazol... 30
3.7. Analisa data... 31
VI. HASIL PENELITIAN... 34
4.1. Identifikasi sulfametoksazol'... 34
4.2. Identifikasi trimetoprim... 34
4.3. Hasil penetapan kadar sulfametoksazol, trimetoprim, dan kotrimoksazol dengan metode spektrofotometri cara simultan... 35
4.4. Identifikasi Escherichia coll... 53
4.5. Hubungan antara kadar rata-rata larutan
uji yang ditetapkan secara spektrofotometri dengan diameter daerah hambatan... 61
V. PEMBAHASAN... ..6 6
V I . KESIMPULAN DAN SARAN... ... .. 70 VII. DAFTAR PUSTAKA... .. 72 LAMPIRAN... .. 74
DAFTAR TABEL
1. Hasil identifikasi dan data pustaka
sulfametoksazol ... 34 2. Hasil identifikasi dan data pustaka
trimetoprim ... 35 3. Penentuan panjang gelombang maksimum
sulfametoksazol ... 37 4. Penentuan panjang gelombang maksimum
trimetoprim ... 38 5. Nilai absorptivitas sulfametoksazol
dalam pelarut dapar fosfat pH 7 ... 41
6. Nilai absorptivitas trimetoprim dalam
pelarut dapar fosfat pH 7 ... 42 7. Nilai serapan larutan baku sulfametoksazol
dalam dapar fosfat pH 7 pada panjang gelombang
maksimum 256 nm ... 42
8 . Nilai serapan larutan baku trimetoprim
dalam dapar fosfat pH 7 pada panjang gelombang
maksimum 276 nm ... 44 9. Hasil penentuan kadar larutan uji sulfametoksazol
dalam larutan dapar fosfat pH 7 ... 46 10. Hasil penentuan kadar larutan uji trimetoprim
dalam larutan dapar fosfat pH 7 ... . 48 11. Hasil penentuan kadar larutan uji kotrimoksazol
TABEL halaman
vii
dalam larutan dapar fosfat pH 7 ... 51 12. Identifikasi Escherichia coll ... 54 13. Hasil penentuan aktivitas anti bakteri
larutan uji sulfametoksazol terhadap bakteri
Escherichia coll ATCC No. 10536 ... 54 14. Hasil penentuan aktivitas anti bakteri
larutan uji trimetoprim terhadap bakteri
Escherichia coll ATCC No. 10536 ... 56 15. Hasil penentuan aktivitas anti bakteri
larutan uji kotrimoksazol terhadap bakteri
Escherichia coll ATCC No. 10536 ... 58
DAFTAR GAMBAR
1. Struktur molekul sulfametoksazol ... 5 2. Struktur asam para amino benzoat dan
sulfonamida ... :... 6
3. Struktur molekul trimetoprim ... 9 4. Kurva serapan terhadap panjang gelombang dari zat x
dan zat y ... 16 5. Kurva serapan terhadap panjang gelombang
larutan sulfametoksazol dan trimetoprim dalam pelarut dapar fosfat pH 7 pada panjang gelombang 200-400 nm ... 36
6. Kurva nilai serapan terhadap kadar larutan baku sulfametoksazol dalam larutan
dapar fosfat pH 7 pada panjang gelombang
maksimum 256 nm ... 39 7. Kurva nilai serapan terhadap kadar larutan
baku trimetoprim dalam larutan dapar fosfat pH 7 pada panjang gelombang 200-400 n m ... 40
8. Kurva nilai serapan terhadap kadar larutan uji rata-rata sulfametoksazol dalam
larutan dapar fosfat pH 7 pada
panjang gelombang 200-400 nm... 43 9. Kurva nilai serapan terhadap kadar larutan uji
rata-rata trimetoprim dalam larutan
Gambar halaman
dapar fosfat pH 7 pada panjang gelombang maksimum 276 nm ... 45 10. Kurva persamaan regresi antara kadar larutan
uji sulfametoksazol (bpj) dengan diameter
daerah hambatan (mm) ... 63 11. Kurva persamaan regresi antara kadar larutan
uji trimetoprim (bpj) dengan diameter
daerah hambatan (mm) ... 64 12. Kurva persamaan regresi antara kadar larutan
uji kotrimoksazol (bpj) dengan diameter
daerah hambatan (mm) ... 65
DAFTAR LAMPIRAN
1. P erhitungan dalam menent u k a n p e r samaan garis regresi unt u k kur v a b aku larutan uji
s ulfametoksazol p a d a panjang gelombang 256 n m . .. 74
2. P erhitungan dal a m menent u k a n persamaan garis regresi unt u k kurva baku larutan uji
trimetoprim pada panjang g e l ombang 276 n m ... 75
3. Perhitungan dalam menentukan persamaan
garis regresi an t a r a larutan uji sulfametoksazol (x) dan diameter daerah h a m b a t a n ( y ) ... 76 4. Perh i t u n g a n dal a m m e n e n t u k a n persamaan
garis regresi antara larutan u j i t r i m e t o p r i m (x) dan diameter daerah h a m b a t a n ( y ) ... 77
5. Perhitungan dalam menentukan persamaan
garis regresi antara larutan uji kotrimoksazol(x) dan d iameter daerah h a m b a t a n ( y ) ... 78
6 . Perhi t u n g a n u n tuk m e ngevaluasi persamaan regresi 7 9
7. P erhi t u n g a n p e r k i r a a n k e s alahan s t a n d a r... q£.
8 . Perhitungan kadar sulfametoksazol dengan
cara persamaan simultan... 8 3
9. Perhitungan kadar trimetoprim dengan
cara p e r samaan s i m u l t a n ... 83
10. Tabel har g a k o e f i s i e n korelasi p ada b erbagai
derajat k e p e r c a y a a n ... 8 4
11. Tabel distribusi F pada derajat kepercayaan 0,05 85
12. Sertifikat analisis sulfametoksazol... 8 6
13. Sertifikat analisis trimetoprim.... *... 87
RINGKASAN
Telah dilakukan penelitian dengan tujuan untuk menjelaskan hubungan antara kadar sulfametoksazol, trimetoprim dan kotrimoksazol yang ditetapkan secara spektrofotometri dengan diameter daerah hambatan terhadap bakteri Escherichia coli ATCC No.10536.
Penelitian dilakukan pada berbagai kadar yang berbeda. Prosedur pembuatan larutan uji adalah dengan melarutkan sulfametoksazol dalam larutan dapar fosfat pH 7 dengan berbagai kadar. Kadar yang dibuat sejumlah 5 macam dan replikasi dilakukan sebanyak 4 kali. Hal tersebut di atas juga dilakukan terhadap trimetoprim dengan perbandingan kadar larutan uji dengan sulfametoksazol sebesar 1:5. Untuk kotrimoksazol dilakukan pencampuran terlebih dahulu dengan perbandingan sulfametoksazol dan trimetoprim sebesar 5:1.
Kadar larutan uji ditetapkan secara spektrofotometri.
Penentuan diameter daerah hambatan larutan uji pada bakteri Escherichia coli ATCC No. 10536 menggunakan metode difusi silinder. Media yang digunakan adalah agar Mueller Hinton.
Hasil penelitian dan analisis data menggunakan uji regresi pada deraj at kepercayaan 5% menunjukkan adanya hubungan linier yang bermakna antara kadar senyawa yang ditetapkan secara spektrofotometri dengan diameter daerah hambatan terhadap bakteri Escherichia coll ATCC No.10536
xii
Hubungan ini dapat dituliskan sebagai berikut :
-Sulfametoksazol,y=0,0162x+6,0635,r=0,9953TF hitung= 22,38, Sy.x -TrimetoprirQ,y=0,1494x+ 12,154,r= 0,9999,F hitung = 17728,00,Sy.x -Kotrimoksazol,y=0.0381x+13,00,r=0,9524, Fhitung=51403,00, Sy.x
= 0,07
= 0,06
= 1.12
xiii
BAB I PENDAHULUAN
1. Latar belakang masalah
Infeksi merupakan masalah terbanyak dihadapi oleh dunia kesehatan di negara-negar^ sedang berkembang, termasuk Indonesia. Jumlah korban yang meninggal karena penyakit-penyakit infeksi masih menduduki peringkat tertinggi (1).
Salah satu yang dilakukan dalam rangka penyembuhannya adalah dengan pemberian antimikroba. Sulfonamida sebagai golongan pertama antimikroba bermula dari zat warna azo yang diteliti oleh Gerhard Domagk tahun 1932. Penelitiannya terhadap prontoeil menunjukkan bahwa ada aktivitas anti bakteri pada mencit yang diinfeksi Stafilokokus, tetapi inaktif pada kultur bakteri. Kenyataan ini diselidiki oleh Treouel, Trefovel, Nitti dan Bovet pada tahun 1935 bahwa aktivitas prontosil secara in vivo disebabkan terjadi pemutusan ikatan azo pada metabolisme yang menghasilkan zat aktif sulfanilamide (2 ).
Penggunaan sulfonamida dalam klinik mengalami peningkatan hingga tahun 1940-an. Kemudian mengalami penurunan sehubungan dengan terjadinya resistensi pada beberapa galur bakteri.
Sejak ditemukannya penisillin oleh Alexander Fleming tahun 1929 maka penggunaan antibiotika telah menggantikan
1
penggunaan sulfonamida. Seperti halnya sulfonamida ternyata pemakaian golongan antibiotika juga mengalami resistensi pada beberapa galur (2,3,4).
Kesistensi akan menjadi lebih cepat bila indikasi, dosis, waktu mula dan lama terapi tidak tepat (5).
Usaha pengatasan yang dapat dilakukan terhadap kondisi yang tidak menguntungkan tersebut adalah antara lain dengan menghentikan penggunaan antimikroba yang tidak efektif pada mikroba tertentu , mencari obat baru atau turunannya atau penggunaan obat kombinasi yang bekerja pada tahap yang berbeda pada jalur metabolisme mikroba (5).
Sulfametoksazol dan trimetoprim dengan perbandingan 5:1 dan biasa disebut kotrimoksazol merupakan salah satu contoh obat kombinasi yang efektif untuk infeksi saluran kemih. Pada awalnya secara sendiri-sendiri komponen aktif obat telah resistensi pada beberapa bakteri.
Sulfametoksazol sebagai golongan sulfonamida resisten pada bakteri galur Gonokokus, Neisseria, Shigella, Pasteurella tullarensis, N. pertusis, Lestospira, Borellia, Treponema, M. tuberculosa, M. lepra. Trimetoprim resisten pada galur bakteri yang hampir sama dengan sulfametoksazol. Tetapi dalam kombinasi ternyata tidak memperlihatkan resistensi terhadap Pseudomonas aeruginosa, Bacteriodes fragilis, Streptococcus pneumoniae,
C. diphteriae, N. meningitidis7 Staphylococcus aureus, Stap.
epidermldis, Strep, pyogenes, E. coll, Proteus mirabllls,
Pr. morganl, Pr. rettgerl, Enterobacter, Kleb3ellla, Bru
cella, Yersenia dan Nocardla (5).
Efek terapi maksimum tanpa terjadi resistensi memerlukan perbandingan dosis yang tepat antara sulfametoksazol dan trimetoprim. Hasil penelitian yang kini umum digunakan adalah sulfametoksazol dan trimetoprim dengan perbandingan 5:1.
Stabilitas sulfametoksazol dipengaruhi oleh pH, pada pH rendah berbentuk asam sulfanilat dan 5-metil-3- aminoisoxazol, sedangkan trimetoprim sangat stabil (6).
Dengan adanya penurunan kadar senyawa aktif yang dapat terjadi selama masa penyimpanan di pabrik obat hingga ditangan konsumen, maka dipandang perlu untuk dilakukan analisis secara kuantitatif dalam kaitannya dengan aktivitasnya terhadap senyawa sulfametoksazol dan trimetoprim karena keduanya terdapat dalam bentuk kombinasi yang dikenal dengan kotrimoksazol.
Memperhatikan struktur kimianya, maka penetapan kadar secara kimia pada sulfametoksazol dapat dilakukan dengan metode spektrofotometri, kolorimetri, fluorometri, titrimetri, sedangkan pada trimetoprim dengan metode spektrofotometri, spektrofluorometri, titrimetri dan polarografi (6). Pada penelitian ini metode terpilih ialah metode spektrofotometri, cara simultan (7). Sebagai dasar pertimbangan metode spektrofotometri adalah kerja yang relatif cepat, praktis dan ekonomis, serta hasil yang
didapat bisa dipercaya.
Untuk mengetahui aktivitas anti bakteri secara in vitro digunakan uji aktivitas pada bakteri Escherichia coli dengan mengukur diameter daerah hambatan. Uji in vitro dengan bakteri ini kepekaannya lebih tinggi karena hanya menentukan kadar senyawa aktif (7).'
Penentuan aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan metode difusi dan metode dilusi. Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah metode difusi yang dinyatakan dalam diameter daerah hambatan. Keuntungan metode difusi adalah relatif lebih ekonomis, rentang konsentrasi zat uji dapat lebih lebar dibanding metode dilusi, cukup teliti dan reliabilitas tehnik in vitro yang tinggi (8 ).
2. Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini untuk mengetahui apakah ada hubungan yang bermakna antara kadar sulfametoksazol, trimetoprim dan kotrimoksazol yang ditetapkan secara spektrofotometri dengan diameter daerah hambatan terhadap bakteri Escherichia coli.
3. Hipotesa
Ada hubungan bermakna antara kadar senyawa aktif yang ditetapkan secara spektrofotometri dengan diameter daerah hambatan terhadap bakteri Escherichia coli.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
1. Tlnjauan tentang sulfametoksazol
1.1. Sifat fisika kimia sulfametoksazol (7,9).
Sulfametoksazol adalah sulfonamida yang mempunyai struktur molekul :
H o
Gambar 1 : Struktur molekul sulfametoksazol Keterangan (A) cincin oksazol Nama kimia :
- N -(5-methyl-3-isoxazolyl) sulfanilamida - N -<5-methyl-isoxazol-3-yl) sulphanilamide - Benzenesulfonamide, 4-amino-N-(5-methyl
3-isoxazolyl) Rumus molekul :
Berat molekul : 253,28
Pemerian : Serbuk hablur, putih sampai hampir putih, praktis tidak berbau (0 ).
Kelarutan : praktis tidak larut dalam air, larut dalam 50 bagian etanol (95%) P, dalam 3 bagian aseton P, mudah larut dalam larutan NaOH
(8) .
1.2. Stabilitas sulfametoksazol ( 6 ) Berdasarkan penelitian larutan sulfametoksazol 10% dalam 0,4 NaOH dan air direfluk selama 1 Jam, tidak ada hasil dekomposisi yang dapat diamati oleh kromatografi lapis tipis. Apabila sulfametoksazol direfluk dengan 0,1 N HC1 terbentuk asam sulfanilat dan 5-metil-3-aminoisoxazol.
1.3. Mekanisme aksi sulfametoksazol
Prinsip kerja sulfametoksazol didasarkan pada hambatan kompetitif sintetase, yang membentuk asam dihidropteroat. Inhibisi kompetitif dapat terjadi, karena bangun geometrik golongan sulfonamida yang sangat mirip dengan aoam p-aminobenzoat yang diusirnya. Karena kebutuhan ruang dari atom belerang yang besar, maka Jarak karakteristik atom yang berperan pada fiksasi enzim agak lebih besar (3).
asam p-aminobenzoat sulfonamida
Gambar 2 : Struktur molekul asam p-aminobenzoat tdan sulfonamida.
Asam ini merupakan vitamin bagi bakteri yang dibutuhkan untuk sintesa asam folat. Asam tetrahidrofolat salah satu turunan asam folat, adalah kofaktor sintesa timidin, purin dan terakhir terbentuknya DNA. Pada pH fisiologis asam folat sebagai dianion yang tidak dapat melewati dinding sel bakteri dengan cara difusi pasif karena ada muatan negatif yang menolak pada dinding bakteri, sehingga membutuhkan energi untuk transport aktif. Untuk keadaan seperti itu bakteri harus membuat asam folat dari asam amino benzoat dan konsekuensinya dapat dihambat oleh sulfonamida yang menghasilkan efek bakteriostatik (2),
Sulfonamida hanya aktif pada fase pembelahan bakteri. Periode ini tergantung pada akumulasi PABA
(2).
Dua sistem enzim bakteri yang dapat m e m b e n t u k asam folat, y a n g p e r t a m a diBebut dihydropteroat sintetase m e n g k a t a l i s a a sam dihydropteroat p a d a asam glutamat, sintesa a sam folat terbentuk. Kata l i s a t o r yang ked u a ad a l a h asam folat sendiri den g a n kopling secara langsung a sam p-aminobenzoat glutamat dengan turunan pteridin. Ked u a jalur di atas dapat dihambat oleh s ulfonamida (2 ).
Substituen pada sulfonamida berkompetisi pada permukaan enzim dengan glutamat dari PABA-glutamat melalui satu dari dua jalan :
a. kompetisi langsung dengan ikatan PABA- glutamat dengan turunan pteridln
b. secara tak langsung mempengaruhi kopling glutamat dengan asam dihydropteroat (2).
Mekanisme kedua sulfonamida dapat terjadi pada bakteri. Efek bakteriostatik sulfonamida mungkin dihubungkan secara langsung dengan reaksi enzim dengan substrat pteridin menghasilkan bentuk tidak aktif
"folat like", dan konsekuensi hilangnya pteridin.
PABA merupakan antagonis kompetitif sulfa yang paling kuat, juga merupakan anestesi lokal yang mengandung PABA misalnya prokain, menghambat kerja sulfa secara in vitro maupun in vivo. Efek antibakteri sulfonamida juga dihambat oleh adanya darah, nanah, dan jaringan nekrotik, karena kebutuhan mikroba akan asam folat berkurang dalam media yang mengandung basa purin dan timidin (5).
2. Tinjauan tentang trimetoprim 2.1. SIfat fisika kimla (9)
Trimetoprim dikenal sebagai trimetoprimum, mempunyai struktur molekul sebagai berikut :
OCM.
Gambar 3 : Struktur molekul trimetoprim Keterangan (A) cincin pirimidin
Nama kimia :
2.4-diamino-5-(3,4,5-trimetoksi benzil) pirimidina
2 .4-Pyrimidinamine,5-((3,4,5~trimethoxyphenyl) methyl)
C14H 18N4°3 290,32
serbuk putih, tidak berbau, sangat pahit.
sangat sukar larut dalam air, larut dalam 300 bagian etanol(95%) P, dalam 55 bagian CHCI3 P dan dalam 80 bagian metanol P, praktis tidak larut dalam eter P.
Suhu lebur antara 1990-203°
Rumus molekul Berat molekul Pemerian
Kelarutan
2.2. Stabilitas (9)
Trimetoprim dalam bentuk tablet sangat stabil dalam botol coklat yang disimpan pada suhu kamar selama 58 bulan.
2.3. Mekanisme aksi trimetoprim (10)
Trimetoprim sebagai antimikroba sintetis digunakan untuk pengobatan saluran kemih yang tidak komplek, terutama yang disebabkan Escherechla. coll, P. mlrabllls, K. pneumoniae dan Enterobacter.
Trimetoprim merupakan penghambat reduktase folat yang diperlukan untuk mengubah asam dihidrofolat menjadi tetrahidrofolat dalam bakteri.
3. Tinjauan tentang kotrimoksazol (5) 3.1. Mekanisme aksi
Pemblokan biosintesis koenzim pada lebih dari satu tempat pada lintasan biosintesa bakteri menghasilkan efek sinergisme antimikroba. Keuntungan tambahannya adalah mikroba tidak mampu mengembangkan resistensi secepat yang ditimbulkan oleh pemblok lintasan tunggal.
Spektrum antibakteri trimetoprim sama dengan sulfametoksazol, meskipun daya antibakterinya 2 0 - 1 0 0
kali lebih kuat dari pada sulfametoksazol.
Mikroba yang peka terhadap kombinasi trimetoprim sulfametoksazol ialah: Str. pneumoniae, C. diphteriae, N. meningitidis, S. aureus, S. epidermidis, Str.
pyogenes, Str. viridans, Str faecalls, E. coli, Pr.
mirabilis, Pr. morgani, Pr. rettgeri, Enterobacter, Aerobacter, Salmonella, Shigella, Ps. paeudomallei, Serratia, Alcaliagenes, Klebseilla, Pasteurela hemolytica, Yersinia pseudotuberculosis dan Nocardla asteroides. Juga beberapa strain Stafilokokus yang resisten terhadap metisillin, trimetoprim dan sulfametoksazol sendiri, peka terhadap kombinasi itu.
Sinergis maksimum terjadi jika bakteri peka pada dua
komponen.
Aktivitas antibakteri kotrimoksazol berdasarkan atas kerjanya pada dua tahap yang berurutan dalam reaksi enzimatik untuk membentuk asam tetrahidrofolat.
Sulfametoksazol menghambat masuknya molekul PABA ke dalam molekul asam folat dan trimetoprim menghambat terjadinya reaksi reduksi dari dihidrofolat menjadi tetrahidrofolat. Tetrahidrofolat penting untuk reaksi- reaksi pemindahan satu atom C, seperti pembentukan basa purin (adenin, guanin, dan timidin ) dan beberapa asam amino. Trimetoprim menghambat enzim dihidrofolat reduktase mikroba secara sangat selektif.
Untuk mendapat efek sinergi diperlukan perbandingan kadar yang optimal sesuai KHM (kadar hambat minimal) dari masing-masing obat in vitro.
Preparat kombinasi diformulasikan untuk mendapat kadar sulfametoksazol in vivo 2 0 kali lebih besar daripada trimetoprim. KHM sulfametoksazol adalah 3 mcg/ml, sedangkan trimetoprim 0,3 mcg/ml. Bila kotrimoksazol diuji dengan perbandingan 2 0 : 1 ditemukan kadar hambat sulfametoksazol 1 mcg/ml dan trimetoprim 0,05 mcg/ml dan kombinasi ini bereifat bakterisid untuk beberapa bakteri (5).
4. Penentuan kadar senyawa aktif secara kimia pada sulfametoksazol (6)
Macam-macam cara penetapan kadar sulfametoksazol;
4.1. Metode kolorimetri
Kolorimetri dilakukan dengan melakukan diazotasi dan kopling dengan N-(1-naphtylethylenediamin dihidroklorida) (Bratton Marshal Reagen). Hasilnya berupa warna merah yang diukur pada panjang gelombang 540 nm.
4.2. Metode fluorometri
Metode ini biasa digunakan pada penentuan kadar sulfametoksazol dalam darah. Untuk pengamatan perlu direaksikan dengan pereaksi dansyl agar terbentuk dansyl sulfonamida dan diamati pada 485 nm.
4.3. Metode titrimetri
Titrasi potensiometri dengan natrium nitrit.
Titik akhir titrasi ditunjukkan secara potensiometri menggunakan elektrode kalomel dan platina .
Sulfametoksazol dapat juga dititrasi dengan dimetilformamida dengan LiOCHg. Proton sulfonamida berfungsi mengganti ion litium .
4. Metode spektrofotometri
Pelarut yang digunakan 0,1 N NaOH, dengan kadar antara 0,26 ug/ml-26 ug/ml agar hukum Lambert Beer tetap terpenuhi. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang maksimum 256-257 nm.
Penentuan kadar senyawa aktif secara kimia pada trimetoprim
Macam-macam cara penetapan kadar trimetoprim : 1. Metode spektrofluorometri
Metode ini digunakan untuk analisa pada cairan biologis dan jaringan. Kalium permanganat ditambahkan agar terbentuk oksidasi yaitu asam trimetoksibenzoat.
2. Metode titrimetri
Trimetoprim dapat dianalisa secara potensiometri dengan menitrasi dalam 9:1 asetat anhidrat dan asam asetat glasial dengan asam perklorat dalam asetat glasial.
3. Metode polarografi
Trimetoprim direduksi oleh elektron Hg dan puncak yang terjadi dapat digunakan untuk analisa kualitatif dan kuantitatif. Ketinggian puncak polarogram sebanding dengan kadar.
5.4. Metode spektrofotometri
Pengamatan dilakukan dalam larutan yang dibuat dari 100 mg trimetoprim dalam 25 ml etanol USP dan ditambahkan 0,4 % NaOH hingga volume 100 ml. Sebagai pembanding adalah larutan 4% NaOH.
6. Penentuan kadar senyawa aktif pada kotrimoksazol secara kimia (1 1, 18)
Metode spektrofotometri merupakan metode analisiB kuantitatif yang penggunaannya sangat luas. Cara spektrofotometri yang dapat digunakan untuk penetapan kadar obat dalam campuran, dapat dilakukan dengan tehnik pelaksanaan sebagai berikut:
1. cara serapan individual
2 . cara persamaan simultan 3. cara diferensial
4. cara grafik
5. cara turunan pertama
6. cara perbandingan serapan 7. cara panjang gelombang ganda
8. cara tiga panjang gelombang
Metode terpilih pada penelitian ini adalah metode spektrofotometri dengan cara simultan. Dasar cara ini ialah hukum Lambert-Beer, dimana serapan suatu campuran merupakan jumlah total masing-masing komponen penyusunnya (ditandai dengan i)
ci • b i
Dengan cara mengetahui harga absorptivitas (a^) dari masing-masing komponen campuran, maka dengan menggunakan rumus di atas dapat ditentukan kadar dari masing-masing komponen tersebut.
Suatu misal campuran terdiri dari zat x da.n y dengan absorptivitas ax dan ay pada panjang gelombang
A
, a'x dan a'y padaA*
, (seperti pada gambar 4) dengan medium setebal b, dan mempunyai harga serapan pada panjang gelombangA
(A)dan pada panjang gelombang \ (A'). Sedangkan kadar x dan y yang belum diketahui dinyatakan sebagai cx dan cy ' maka sesuai dengan hukum Lambert-Beer dihasilkan persamaan sebagai berikut:
A = ax . cx . b + ay . cy . b A' = a'x . cx . b + a'y . cy . b
Dengan menggabungkan kedua persamaan ini pada harga b = 1, maka akan didapatkan harga :
A . a ' y - A' . ay cx = --- a x . a'y - a ' x . a y A' . ax - A . a'x cy = ---
ax . a'y - a'x . ay cx = kadar zat x dalam campuran cy = kadar zat y dalam campuran
A' = serapan campuran zat x dan zat y pada panjang gelombang maksimum zat x
A = serapan campuran zat x dan y pada panjang gelombang maksimum y
gelombang maksimum y ax = absorbtivitas zat x
maksimum x
ay = absorbtivitas zat y maksimum y
a'x= absorbtivitas zat x maksimum y
a'y= absorbtivitas zat y maksimum x
pada panjang gelombang pada panjang gelombang pada panjang gelombang pada panjang gelombang
P a n
Gambar 4 : Kurva serapan terhadap panjang gelombang dari zat x ( ---- ) dan zat y ( --- )
7. Uji aktivitas secara mikrobiologis
Uji aktivitas antimikroba ini dilakukan berdasarkan kemampuan membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme hidup. Keberhasilan uji aktivitas antimikroba tidak hanya ditentukan oleh macam antimikroba tetapi spesifikasi kuman Juga sangat menentukan. Bakteri yang resisten terhadap antimikroba akan menimbulkan kesalahan hasil penentuan aktivitas antibiotik (13).
Berbagai metode penentuan aktivitas mikrobiologis adalah sebagai berikut :
7.1. Metode dilusi
Prinsip metode dilusi adalah suatu seri pengenceran larutan antimikroba dalam media pertumbuhan yang dimulai dari konsentrasi tinggi sampai rendah. Bakteri dalam jumlah tertentu ditanam dalam media. Setelah inkubasi akan tampak hambatan pertumbuhan.
Metode dilusi dapat menentukan konsentrasi hambat minimum dan konsentrasi bakterisidal minimum (14).
Berdasarkan media yang digunakan metode dilusi dapat dibedakan menjadi :
- metode dilusi cair
Suatu seri tabung berisi media cair masing- masing mengandung antibiotlka dengan konsentrasi berbeda-beda. Isolat bakteri diinokulasi ke dalam setiap tabung dan dikontrol dengan tepat. Setelah inkubasi, hambatan pertumbuhan dapat ditentukan dengan
melihat kekeruhan masing-masing tabung.
Konsetrasi hambat minimal secara makroskopis adalah konsentrasi dengan pengenceran tertinggi yang tetap jernih.
- metode dilusi padat
Suatu seri lempeng berisi agar, masing-masing mengandung antimikroba dengan konsentrasi berbeda. Isolat kuman kemudian ditanam di lempeng agar. Setelah inkubasi akan didapat kadar hambat minimal (14).
7.2. Metode difusi
Metode difusi berdasarkan difusi antimikroba dari pencadang ke dalam media yang telah ditanam bakteri uji. Setelah inkubasi akan nampak daerah jernih di sekeliling pencadang dan daerah keruh mengelilingi daerah jernih itu. Daerah jernih menunjukkan daerah dimana terjadi hambatan pertumbuhan bakteri. Diameter daerah Jernih di sekeliling pencadang dikenal dengan sebutan diameter daerah hambatan akan sebanding dengan konsentrasi antimikroba dalam pencadang.
Beberapa faktor yang mempengaruhi diameter daerah hambatan adalah (15):
- komposisi dan kandungan media - ketebalan media dalam lempeng - temperatur dan waktu inkubasi - ukuran inokulum
- laju difusi antimikroba melawan laju
pertumbuhan bakteri.
Berdasarkan pencadang yang digunakan metode difusi dapat dibedakan menjadi :
- metode. difusi cakram
Metode difusi cakram menggunakan kertas sebagai pencadang. Kertas dijenuhkan dengan larutan antimikroba dan diletakkan pada permukaan agar.
Karena variabilitas produk kertas maka kandungan antimikroba tidak dapat diprediksi secara tepat.
- metode difusi silinder
Silinder logam atau gelas dapat dipakai sebagai pencadang yang berisi larutan antimikroba dengan kadar tertentu. Dengan metode silinder logam atau gelas, jumlah larutan antimikroba dalam pencadang selama waktu inkubasi dapat diketahui secara pasti.
metode difusi cetak lubang
Pencadang dalam metode difusi cetak lubang adalah lubang dengan diameter 4-6 mm. Lubang yang terbentuk diisi dengan larutan antimikroba dengan kadar tertentu.
Sebagai metode terpilih untuk menentukan aktivitas mikrobiologis trimetoprim, sulfametoksazol dan kotrimoksazol adalah metode difusi silinder logam.
Keuntungan 'metode difusi silinder logam adalah penggunaan relatif lebih luas dibanding metode dilusi, cukup teliti dan reliabilitas tinggi untuk tehnik in
vitro.
Penentuan aktivitas antimikroba trimetoprim, sulfametoksazol dan kotrimoksazol dilakukan pada bakteri uji Escherichia coli (16, 17).
Macam-macam media untuk penanaman Escherichia 2coli : agar Mueller Hinton, agar Mac Conkey, agar Deoxycholat, agar nutrient, agar Tripton Soya. Media yang umum digunakan untuk uji aktivitas antibiotika adalah agar Mueller Hinton (7).
8. Tinjauan tentang Escherichia coli
Bakteri Escherichia coli termasuk dalam familia Enterobacteriaceae yang merupakan flora normal dalam saluran pencernaan manusia dan hewan. Meskipun diduga non patogen, dari beberapa penelitian diduga Escherichia coli bertanggung jawab terhadap terjadinya beberapa kasus diare berat sampai ringan dan infeksi saluran kemih (2 0).
Pada penggolongan dengan pewarnaan, bakteri Escherichia coli termasuk gram negatif.
8.1. Morfologi (20,21)
Escherichia coll berbentuk batang dengan lebar 0,4-0,7 um dan panjang 1-4 um, dapat membentuk rantai, tidak membentuk spora , tetapi hanya sebagian kecil yang membentuk kapsul. Bakteri ini termasuk gram negatif yang bersifat aerob.
8.2. Biakan (20)
Bakteri ini dapat tumbuh dengan cepat selama 24 jam dan pada suhu 20°-40 °C. Escherichia coll dapat tumbuh pada garam-garam organik, garam-garam amonium dan glukosa. Pada media agar plate, selama 12 - 24 jam sudah memperlihatkan permukaan 'koloni dengan diameter 2-3 mm, berbentuk bulat konveks halus dengan tepi yang nyata. Bakteri ini mati pada suhu 60°C dengan pemanasan selama 30 menit, namun ada beberapa galur yang memerlukan suhu yang lebih tinggi.
8.3. Sifat pertumbuhan (14, 20)
Escherichia coll memecah banyak karbohidrat, dengan membentuk asam dan gas. Asam yang terutama adalah asam laktat dan sedikit asam formiat, asam asetat dan etanol. Menghasilkan indol, tidak menggunakan sitrat, tumbuh pada KCN, memecah urea dan mencairkan gelatin.
BAB III METODE PENELITIAN
1. Bahan-bahan
- Trimetoprim (Bernofarm) - Sulfametoksazol (Bernofarm)
- Bakteri Escherichia coll ATCC No. 10536 (Balai POM)
- Mueller Hinton Agar (Oxoid)
- Natrium hidroksida p.a (E. Merck)
- Kalium dihidrogen phospat p.a (E. Merck) - Larutan NaCl isotonis steril (Otsuka)
2. Alat-alat
- Spektrofotometer “Hitachi Dual wavelenght Double beam type 557"
- Otoklaf "All American"
- Perangkat alat uji aktifitas mikrobiologis - Laminar air flow "Kottermann 8580"
- Mikropipet
- Inkubator "Memmert 8540"
- Jangka sorong
- Melting point apparatus "Fisher"
- pH meter "Fisher Accument 230 A"
- Spectrofotometer spectronic 20 "Bausch and Lomb".
22
3. Cara pelaksanaan
3.1. Pemeriksaan kualltatif terhadap sulfametoksazol 3.1.1. Pemeriksaan titik lebur
Bahan berbentuk serbuk sekitar 1 mg dimasukkan ke dalam pipa kapiler gelas dengan diameter kurang lebih 1 mm, tinggi 8 cm dan tertutup ujung lainnya.
Sampel diusahakan mencapai ujung pipa. Pipa kapiler dipasang pada tempatnya. Penangas dipanaskan perlahan-lahan. Pada temperatur sekitar 15° C di bawah titik lebur, nyala api diatur sehingga laju kenaikan temperatur 21° C permenit. Titik lebur sulfametoksazol sekitar 170°-173° C (6).
3.1.2. Reaksi warna (9)
a. Reaksi amina aromatik
Larutkan 100 mg dalam 2 ml HC1 encer P, jika perlu dipanaskan , dinginkan dalam es, tambahkan 4 ml larutan natrium nitrit P, 1% b/v tuangkan pada 2 ml larutan naftol p yang mengandung 1 g natrium asetat P, terbentuk endapan kuning jingga tua hingga merah tua tergantung zat uji.
b. Larutkan 5 mg dalam 0,5 ml natrium hidroksida 2 N , tambahkan 5 ml air. Tambahkan 1 g fenol P didihkan, dinginkan, tambahkan 1 ml larutan natrium hipoklorit encer P; segera terjadi warna kuning emas.
3.2. Pemeriksaan kualitatif terhadap trimetoprim 3.2.1. Pemeriksaan titik lebur
Titik lebur trimetoprim 199°-203® C.
3.2.2. Pemeriksaaan warna (8)
a. Pada 1 mg tambahkan 0,1 ml larutan tembaga (II) sulfat P, terjadi warna biru tua. Tambahkan 5 ml larutan natrium hidroksida encer P dididihkan hingga sisa 1/3 volume semula, warna biru tetap.
b. Pada 1 mg tambahkan 0,3 ml larutan kobalt (II) klorida P ter^adi warna merah karmin.
3.3. Penetapan kadar sulfametoksazol, trimetoprim dan kotrimoksazol (11)
3.3.1. Pembuatan dapar fosfat pH 7 (7)
KH2PO4 sebanyak 27,22 g dilarutkan dalam 1000 ml air, diambil 500 ml ditambah 291 ml 0,2 M NaOH untuk memperoleh pH 7.
3.3.2. Penyediaan larutan percobaan
3.3.2.1. Penyediaan larutan baku sulfametoksazol
Ditimbang teliti 50 mg sulfametoksazol dilarutkan dengan pelarut dapar fosfat pH 7 dalam labu ukur
1 0 0 ml hingga garis tanda. 1 ml diambil dengan pipet volume, masukkan dalam labu ukur 50 ml tambahkan larutan dapar fosfat hingga garis tanda,
sehingga didapatkan larutan dengan kadar 1 0 b p j.
3.3.2.2. Penyediaan larutan baku trimetoprim
Ditimbang teliti 50 mg trimetoprim dilarutkan dengan pelarut dapar fosfat pH 7 dalam labu ukur 100 ml hingga garis tanda. Dipipet 1 ml dimasukkan labu ukur 50 ml, kemudian ditambahkan larutan dapar fosfat pH 7 hingga garis tanda, sehingga didapatkan larutan yang kadarnya 1 0 bpj.
3.3.3. Penyediaan larutan campuran sulfametoksazol dan trimetoprim
Dibuat campuran sulfametoksazol dan trimetoprim dengan perbandingan 5:1. Ditimbang 50 mg dan dilarutkan dalam larutan dapar fosfat pH 7 di dalam labu ukur 100 ml hingga garis tanda. Dipipet 1 ml dimasukan labu ukur 50 ml , diencerkan dengan larutan dapar fosfat pH 7 hingga garis tanda, sehingga didapatkan larutan yang kadarnya 1 0 bpj.
3.4. Penetapan kadar sulfametoksazol dan trimetoprim dalam campuran dengan cara simultan
3.4.1. Pembuatan kurva serapan terhadap panjang gelombang Dibuat kurva serapan sulfametoksazol dengan kadar 10 bpj dan trimetoprim 10 bpj. Dari pengamatan kurva serapan panjang gelombang 200 nm-400 nm dapat ditentukan panjang gelombang maksimum
sulfametoksazol dan trimetoprim.
3.4.2. Penetapan absorptivitas sulfametoksazol dan trimetoprim
3.4.2.1. Penetapan absorptivitas sulfametoksazol
Dibuat larutan sulfametoksazol dengan kadar 2 bpj, 4 bpj, 6 bpj, 8 bpj dan 10 bpj dari larutan baku induk sulfametoksazol . Larutan tersebut masing masing diamati serapannya pada gelombang maksimum sulfametoksazol dan panjang gelombang maksimum trimetoprim . Dari data sulfametoksazol yang diperoleh dicari harga absorptivitas tiap-tiap kadar, kemudian dihitung harga absorptivitas rata- ratanya pada panjang gelombang maksimum sulfametoksazol dan trimetoprim.
3.4.2.2. Penetapan absorptivitas trimetoprim
Dibuat larutan trimetoprim dengan kadar 0,4 bpj,
0 , 8 bpj, 1 , 2 bpj, 1 , 6 bpj dan 2 bpj dari larutan baku induk trimetoprim. Larutan tersebut masing- masing diamati serapannya pada panjang gelombang maksimum sulfametoksazol dan panjang gelombang maksimum trimetoprim . Dari data serapan yang diperoleh dicari harga absorptivitas tiap-tiap kadar, kemudian dihitung harga absorptivitas rata- ratanya pada panjang gelombang maksimum sulfametoksazol dan panjang gelombang maksimum
trimetoprim.
3.4.3. Penetapan kadar sulfametoksazol dan trimetoprim dalam campuran
Ditimbang teliti campuran sulfametoksazol dan trimetoprim dengan perbandingan 5:1 sebanyak 50 mg, dilarutkan dalam 100 ml larutan dapar fosfat pH 7 dalam labu ukur hingga garis tanda. Dari larutan tersebut dipipet 1 ml dimasukkan dalam labu ukur 50 ml dilarutkan dengan larutan dapar fosfat pH 7 hingga garis tanda, sehingga didapatkan larutan yang kadarnya 10 bpj. Diamati serapannya pada panJang gelombang maksimum sulfametoksazol dan panjang gelomang maksimum trimetoprim dengan larutan dapar fosfat pH 7 sebagai blangko. Percobaan dilakukan 4 kali replikasi.
Kadar sulfametoksazol dalam campuran dapat dihitung dengan menggunakan cara simultan sebagai berikut:
A C s .aBt - ACt.aBs Cs = --- a As.aBt - aAt.aBs
sedangkan kadar trimetoprim dalam campuran dapat dihitung dengan menggunakan cara simultan sebagai berikut:
ACt.aAs - ACs.aAt
Qt = ---
aAs.aBt - aAt.aBs
Keterangan :
Cs = kadar sulfametoksazol dalam campuran Ct = kadar trimetoprim dalam campuran
ACs= serapan campuran sulfametoksazol dan trimetoprim pada panjang gelombang maksimum sulfametoksazol
ACt= serapan campuran sulfametoksazol dan trimetoprim pada panjang gelombang maksimum trimetoprim
aAs= absorptivitas sulfametoksazol pada panjang gelombang maksimum sulfmetoksazol
aAt= absorptivitas sulfametoksazol pada panjang gelombang maksimum trimetoprim
aBs= absorptivitas trimetoprim pada panjang gelombang maksimum sulfametoksazol
aBt= absorptivitas trimetoprim pada panjang gelombang maksimum trimetoprim
3.5. Pemsriksaan Escherichia coli 3.5.1. Pewarnaan bakteri (21)
Suspensi bakteri dalam air suling steril pada gelas obyek dikeringkan di udara dan difiksir dengan cara melewatkan gelas obyek di atas lampu spiritus beberapa kali. Kristal violet dituang pada gelas obyek dan dibiarkan selama 1 menit. Sisa kristal violet dibuang dan diganti larutan lugol, biarkan selama 1 menit lalu dicuci dengan air suling. Warna
yang terbentuk dihilangkan dengan alkohol 95 % selam 10-20 detik, segera dibilas dengan air suling. Lalu safranin dituangkan selama 10-30 detik. Sisa safranin dibuang dan dibilas dengan air suling.
Bakteri gram negatif akan berwarna merah.
3.5.2. Pembiakan pada Triple Sugar Iron (TSI) Agar
Ambil koloni bakteri dengan sengkelit lurus steril, kemudian ditanam pada media Triple Sugar Iron Agar yang berwarna kuning kecoklatan dengan cara memasukkannya kira-kira 0,5 cm dari dasar tabung,
lalu menggoreBkannya pada bagian "slant". Kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 Jam. Terlihat adanya pembentukan asam pada permukaan miring media dan pada dasar media, tapi tidak membentuk gas H2S.
3.5.3. Tes Indol (21)
Beberapa koloni dari biakan diambil dengan sengkelit lurus steril dan ditanam pada kaldu yang mengandung triptofan. Inkubasi dilakukan pada suhu 37*C selama 24 Jam. Pembacaan hasil dilakukan dengan penambahan pereaksi Kovack 2-3 tetes melalui dinding tabung.
Pada permukaan biakan akan terbentuk cincin merah.
3.6. Penentuan diameter daerah hambatan larutan u3i sulfametoksazol, larutan uji trimetoprim dan larutan uji kotrimokeazol
3.6.1. Pembuatan media Mueller Hinton agar (21)
Media Mueller Hinton agar ditimbang 35 gram dilarutkan dalam 1 liter air suling mendidih. Media disterilkan dengan otoklaf pada suhu 115°C selama 15 menit.
3.6.2. Pembuatan inokulum bakteri Escherichia coll
Biakan Escherichia coll ditanam pada media Mueller Hinton agar secara merata. Kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 Jam. Dari persediaan bakteri pindahkan sejumlah tertentu biakan ke dalam tabung reaksi kemudian disuspensikan dalam larutan NaCl isotonis steril. Suspensi bakteri diukur pada spektrofotometer pada panjang gelombang 580 nm sedemikian rupa sehingga diperoleh transmisi 25 %.
Sebagai blangko adalah larutan NaCl isotonis steril.
3.6.3. Penentuan aktifitas antibakteri(21)
Ke dalam cawan petri dengan diameter 9 cm dimasukkan secara aseptis inokulum bakteri (dilakukan orientasi sehingga didapat sejumlah inokulum bakteri yang dapat memberikan diameter daerah hambatan yang Jelas terlihat). Media Mueller Hinton agar steril sebanyak 18 ml pada suhu 45°-50® C dituang ke dalam cawan
petri yang berisi inokulum bakteri. Campuran media agar dan inokulum bakteri dibuat homogen dengan menggerakkan cawan petri beberapa kali secara teratur dan selanjutnya dibiarkan menjadi padat.
Larutan uji diteteskan ke dalam silinder logam sebanyak 150 ul. Kemudian didiamkan pada suhu kamar, selama 2 Jam. Cawan petri diinkubasi pada suhu 37°C selama 2 kali 24 Jam. Diameter daerah hambatan diukur dengan menggunakan Jangka sorong pada daerah yang Jernih.
3.6.4. Replikasi
Pada tiap larutan uji dilakukan 4 kali pada tiap kadar.
3.7. Analisa data (24)
Dari data hasil pengamatan percobaan didapatkan :
- variabel x : kadar rata-rata larutan uji yang dinyatakan dalam berat perjuta (bpj)*
- variabel y : diameter daerah hambatan rata-rata larutan uji yang dinyatakan dalam milimeter.
Untuk mengetahui ada tidaknya korelasi
linier antara variabel x dan variabel y, dilakukan perhitungan koefisien dengan rumus sebagai berikut:
n.Zxy - (2x ) .(2y)
r = ---
V [ n . Z x 2 - ( 2 x ) 2 ] . [ n . Z y 2 - ( 2 y ) 2 ]
r= koefisien korelasi n= jumlah sampel
Jika harga r hitung > r tabel maka dapat diambil kesimpulan terdapat korelasi linier antara variabel x dan y, maka untuk selanjutnya dapat dibuat persamaan garis dengan menggunakan persamaan garis regresi :
y = bx + a
n. 2xy - (2x ) . (Sy) n. 2x2 - (Zx)2
a = y - b x
Untuk mengevaluasi persamaan garis regresi, digunakan uji F pada a = 0,05 dengan,
Ho : tidak ada korelasi linier antara x dan y Ha : ada korelasi linier antara x dan y
Sumber varias
derajat bebas
SS MS F hitung
Regresi 1 2(yc-y)2 2(yc-y)2
U
yc-y)2linier S(y-yc )2/n-2
residual n~2 £(y-yc )2 £(y-yc)2/n-2
total n-1 2(y-y)2
keterangan :
yc : nilai y yang didapat dari persamaan garis regresi y : nilai y rata-rata
n : jumlah sampel
Apabila harga F hitung lebih besar dari F tabel maka Ho ditolak atau persamaan garis regresi yang didapat cukup representatif untuk menggambarkan korelasi linier antara variabel x dan y.
Untuk mendapat perkiraan kesalahan standar harga variabel y terhadap variabel x (sy.x), maka dilakukan perhitungan sebagai berikut :
BAB IV HASIL PENELITIAN
4.1. Identlflkasi sulfametoksazol
H a s 11 identifikasi dan d a t a p u s t a k a sulfametoksazol t e r o antum dal a m tabel 1.
Tabel 1
Hasil identifikasi dan data pustaka sulfametoksazol
No. U J I Pustaka
(6, 7, 8)
Hasil Pengamatan
1. Organoleptis : a. rasa
b. bentuk c. bau d. warna
pahit serbuk tak berbau putih
pahit serbuk tak berbau putih
2. Kelarutan : dalam air
dalam etanol 95 %
sukar larut 1 : 50
sukar larut 1 : 50
3. Identifikasi :
- dengan larutan NaNOo,
1%, larutan naftol P, larutan Naacetat
- larutan NaOH 2 N, fenol, larutan Nahipo- klorit
kuning Jingga kuning emas
kuning Jingga kuning emas 4. Titik lebur 170°-173<,C 170°-173° C
4.2. Identifikasi trimetoprim
Hasil identifikasi dan d ata pustaka t r i m e t o p r i m t e r o a n t u m dalam tabel 2 .
34
Tabel 2
Hasil identifikasi dan data pustaka trlmetoprlm
No. U J I Pustaka
(6, 7, 9)
Hasil Pengamatan 1
.
Organoleptis :a. rasa b. bentuk c. bau d. warna
pahit serbuk tak berbau putih
pahit serbuk tak berbau putih
2. Kelarutan : dalam air
dalam etanol 95%
sukar larut 1 : 300
sukar larut 1 : 300 3. Identifikaai :
- larutan CUSO4
larutan NaOH encer - larutan C0CI2
biru tua warna tetap merah karmin
biru tua warna tetap merah karmin 4. Titik lebur 199*-203*C 199°-203SC
4.3. Hasil penetapan kadar sulfametoksazol, trlmetoprlm dan ko trImoksazo1 dengan metode spektrofotometri cara slum It an
4.3.1. Pembuatan kurva serapan terhadap panjang gelombang Hasil pembuatan kurva serapan sulfametoksazol dan
trimetoprim terhadap panjang gelombang dapat dilihat pada gambar 5 di bawah ini.
Gambar 5 : Kurva serapan terhadap panjang gelombang dari larutan sulfametoksazol 1 0 bpj dan larutan trimetoprim 12 bpj dalam pelarut dapar fosfat pH
4.3.2. Penentuan panjang gelombang maksimum
Hubungan antara panjang gelombang dengan serapan larutan baku sulfametoksazol dapat dilihat pada tabel 3 dan larutan baku trimetoprim pada tabel 4.
Tabel 3
Nilai serapan larutan sulfametoksazbl pada kadar 4,376 bpj dan 8,28 bpj dalam larutan dapar fosfat pH 7
pada panjang gelombang 240-260 nm
No.
PanJang Gelombang
(nm)
Nilai serapan pada kadar 4,37 bpj 8,28 bpj
1. 240 0 , 2 0 0 0,380
2. 250 0,260 0,490
3. 251 0,264 0,496
4. 252 0,270 0,500
5. 253 0,276 0,511
6. 254 0,280 0,520
7. 255 0,288 0,544
8. 256 0,290 0,548
9. 257 0,289 0,547
1 0. 258 0,286 0,546
1 1. 259 0,284 0,544
1 2. 260 0,280 0,540
Tabel 4
Nilai serapan larutan trimetoprim pada kadar 6,84 bpj dan 31,71 bpj dalam larutan dapar fosfat pH 7
pada panjang gelombang 260-280 nm
No.
Panjang Gelombang
(nm)
Nilai serapan pada kadar 6,84 bpj 31,71 bpj
1. 260 0,125 ' 0,548
2. 270 0,155 0,700
3. 271 0,160 0,712
4. 272 0,161 0,721
5. 273 0,161 0,732
6. 274 0,162 0,747
7. 275 0,163 0,760
8. 276 0,165 0,765
9. 277 0,164 0,758
1 0. 278 0,164 0,751
1 1. 279 0,162 0,746
1 2. 280 0,160 0,740
Gambar 6
Kurva nilai serapan terhadap kadar larutan sulfametoksazol 4,37 bpj dan 8,23 bpj dalam dapar fosfat pH 7 pada panjang gelombang 20Cj - 400 nm.
Gambar 7
40
: Kurva . nilai serapan terhadap kadar larutan . trimetoprim 6,84 bpj dan 31,71 bpj dalam dapar foefat pH 7 pada panjang gelombang 200-400 nnu
Dari kurva dan tabel serapan tersebut diperoleh data panjang gelombang maksimum sulfametoksazol 256 nm ^ A) sedangkan panjang gelombang maksimum trimetoprim adalah 276 nm (A B).
4.3.3. Penentuan nilai absorbtivitad
Hasil perhitungan nilai absorbtivitas sulfametoksazol pada berbagai kadar pada panjang gelombang 256 nm dan 276 nm seperti teroantum dalam tabel 5 di bawah ini :
Tabel 5
Nilai absorbtivitas sulfametoksazol dalam pelarut dapar fosfat pH 7
No. Kadar (bpj )
serapan (A) pada absorbtivitas 256 nm 276 nm aAs aAt
1. 2,08 0,138 0,061 66,39 29,40
2 . 4,16 0,275 0,123 66,15 29,59
3. 6,24 0,415 0,184 66,55 29,51
4. 8,13 0,552 0,245 67,86 30,12
5. 10,39 0,690 0,307 66,39 29,54
x=66,67 x-29,63
± 0,682 ± 0,282
Hasil perhitungan nilai absorbtivitas trimetoprim pada berbagai kadar pada panjang gelombang 256 nm dan 276 nm seperti teroantum pada tabel 6 di bawah ini :
Gambar 8 : Kurva serapan larutan baku sulfametokzatol dalam dapar fosfat pH 7 pada panjang gelombang maksimum 256 nm.
Nllal absorbtivitas trimetoprim dalam pelarut dapar fosfat pH 7
Tabel 6
No. Kadar (bpj)
serapan (A) pada absorbtivitas
256 nm 276 nm aAs aAt
1. 0,44
*
0 , 0 1 1 0,009 24,90 20,38
2. 0,80 0 , 0 2 1 0,019 23,78 21,51
3. 1,33 0,032 0,028 24,16 21,14
4. 1,77 0,042 0,037 23,78 20,95
5. 2 , 2 1 0,053 0,046 24,00 20,82
x=24,13 x=20,96
± 0,467 ± 0,416
4.3.4. Pembuatan kurva baku
Hasil pengamatan nilai serapan sulfametoksazol dalam larutan dapar fosfat pH 7 pada berbagai kadar dapat dilihat pada tabel 7.
Tabel 7
Nilai serapan berbagai kadar larutan baku sulfametoksazol dalam dapar fosfat pH 7 pada panjong
gelombang irmkotmum 256 nm
No. Kadar
(bPJ)
Nilai serapan
1. 2,08 0,138
2 . 4,16 0,290
3. 6,24 • 0,405
4. 8,13 0,550
5. 10,39 0,670
i
Dari data tersebut dapat dihitung koefisien korelasi antara x dan y dengan menggunakan rumus regresi.
Dari hasil perhitungan pada lampiran A diperoleh harga r = 0.9971, pada a = 0,05 dan DB = 3. Harga r tabel pada a = 0,05 dan DB = 3 adalah 0,8783, maka r hitung > r tabel.
Berdasarkan hasil tersebut dapat dinyatakan bahwa ada korelasi linier antara kadar sulfametoksazol dengan nilai serapan pada spektrofotometer.
Persamaan kurva baku adalah : y = 0,0642 x 0,0130.
Hasil pengamatan nilai serapan trimetoprim dalam larutan dapar fosfat pH 7 pada berbagai kadar dapat dilihat pada tabel 8.
Tabel 8
Nilai serapan larutan baku trimetoprim dalam dapar fosfat pH 7 pada panjang
gelombang maksimum 276 nm
No. Kadar
(bpj )
Nilai serapan
1. 0,43 0 , 0 1 0
2 . 0 , 8 6 0 , 0 2 1
3. 1,29 0,031
4. 1,72 0,041
5. 2,16 0,052
Dari data tersebut dapat dihitung koefisien korelasi antara x dan y dengan menggunakan rumus regresi.
Dari hasil perhitungan diperoleh harga r = 0.9872, pada a = 0 , 0 5 dan DB = 3. Harga r tabel pada a =
ADSORSANSX
0,05 dan DB = 3 adalah 0,8783, maka r hitung > r tabel.
Berdasarkan hasil tersebut dapat dinyatakan bahwa ada korelasi linier antara kadar trimetoprim dengan nilai serapan pada spektrofotometer. Persamaan 'kurva baku adalah : y = 0,0249 x - 0,0012.
Gambar 9 : Kurva serapan larutan baku trimetoprim dalam dapar fosfat pH 7 pada panjang gelombang makjsi- mum 276 nm.
4.3.5. Penentuan kadar larutan ujl
Hasil penentuan kadar sulfametoksazol pada larutan dapar fosfat pH 7 pada kadar 2 bpj, 4 bpj, 6
bpj, 8 bpj dan 10 bpj, teroantum pada tabel 9 berikut ini :
Tabel 9 a
Hasil penentuan kadar larutan ujl sulfametoksazol sampel 1 dalam larutan dapar fosfat pH 7
Kadar Nilai Kadar ha Kadar Persen No. dibuat serapan sil per per Kadar
(bpj) hitungan 2 bpj ± SD (bpj)
1. 2,03 0,135 1,985 1,956 97,80
2. 2 , 0 2 0,134 1,970 1,950 97,50
3. 2,04 0,136 2 , 0 0 0 1,961 98,05 4. 2,05 0,137 2,016 1,967 98,35
x=97,95±0,132 Tabel 9 b
Hasil penentuan kadar larutan uji sulfametoksazol sampel 2 dalam larutan dapar fosfat pH 7
Kadar Nilai Kadar ha Kadar Persen No. dibuat serapan sil per per Kadar
(bpj) hitungan 4 bpj ± SD
(bpj)
1. 4,06 0,270 4,043 3,983 99,58
2. 4,05 0,269 4,028 3,980 99,50 3. 4,09 0,271 4,058 3,971 99,28 4. 4,11 0,273 4,089 3,978 99,45
x=99,45±0,015
Tabel 9 c
Hasil penentuan kadar larutan uji sulfametoksazol sampel 3 dalam larutan dapar fosfat pH 7
Kadar Nilai Kadar ha Kadar Persen No. dibuat serapan sil per per Kadar
(bpj) il itungan 6 bpj ± SD (bpj)
1. 6,09 0,404 6,142 6,051 100,90
2. 6,07 0,403 6,070 5,876 99,97
3. 6,13 0,407 6,131 5,999 99,98
4. 6,18 0,410 6,177 6,009 1 0 0,20
x=100,3010,438 Tabel 9 d
Hasil penentuan kadar larutan uji sulfametoksazol sampel 4 dalam larutan dapar fosfat pH 7
Kadar Nilai Kadar ha Kadar Persen No. dibuat serapan sil per- per Kadar
(bpj) hitungan 8 bpj ± SD (bpj)
1. 8,13 0,542 8,189 8,058 100,70
2. 8 , 1 0 0,538 8,128 8,032 100,40
3. 8,18 0,543 8,205 8,028 100,35
4. 8 , 2 2 0,546 8,250 8,025 100,31
x=100,45±0,030
Tabel 9 e
Hasil penentuan kadar larutan uji sulfametoksazol sampel 5 dalam larutan dapar fosfat pH 7
Kadar Nilai Kadar ha Kadar Persen No. dibuat serapan sil per per Kadar
(bpj) hitungan 10 bpj ± SD (bpj)
1. 10,16 0,670 10,140 9,980 99,80
2. 10,12 0,672 10,171 10,050 100,50
3. 10,22 0,679 10,278 10,060 100,60
4. 10,28 0,683 10,339 10,060 100,60
x=100,42±0,386
Hasil penentuan kadar trimetoprim pada larutan dapar fosfat pH 7 pada kadar 0,4 bpj, 0,8 bpj, 1,2 bpj,
1 , 6 bpj dan 2 , 0 bpj, teroantum pada tabel 1 0
berikut ini :
Tabel 10 a
Hasil penentuan kadar larutan uj1 trimetoprim sampel 1 dalam larutan dapar fosfat pH 7
No.
Kadar dibuat
(bpj)
Nilai serapan
Kadar ha
sil per
hitungan (bpj)
Kadar per 0,4 bpj
Persen Kadar
± SD
1. 0,42 0 , 0 1 0 0,425 0,402 99,80
2. 0,42 0 , 0 1 0 0,425 0,401 99,85
3. 0,43 0 , 0 1 0 0,425 0,400 99,93
4. 0,47 0 , 0 1 1 0,467 0,400 99,95
x=99,88±0,070
Tabel 10 b
Hasil penentuan kadar larutan uji trimetoprim sampel 2 dalam larutan dapar fosfat pH 7
Kadar Nilai Kadar ha Kadar Persen No. dibuat serapan sil per per Kadar
(bpj) il itungan 0 , 8 bpj ± SD (bpj)
1. 0,85 0 , 0 2 0 0,842 0,794 100,79
2. 0,85 0 , 0 2 0 0,842 0,793 100,84
3. 0,85 0 , 0 2 0 0,842 0,793 100,91
4. 0,93 0 , 0 2 2 0,925 0,793 100,87
x=100,90±0,0506 Tabel 10 c
Hasil penentuan kadar larutan uji trimetoprim sampel 3 dalam larutan dapar fosfat pH 7
Kadar Nilai Kadar ha Kadar Persen No. dibuat serapan sil per- per Kadar
(bpj) hitungan 1,2 bpj ± SD (bpj)
1. 1,27 0,031 1,258 1,187 101,14
2. 1,27 0,031 1,258 1,186 101,65 3. 1,27 0,031 1,250 1,185 101,26 4. 1,34 0,033 1,383 1,186 101,17
x= 101,30±0,2350
Tabel 10 d
Hasil penentuan kadar larutan uji trimetoprim sampel 4 dalam larutan dapar fosfat pH 7
Kadar Nilai Kadar ha Kadar Persen No. dibuat serapan sil per per Kadar
(bpj) hitungan 1,6 bpj ± SD (bpj)
1. 2 ,12 0,051 2,133 2 , 0 1 2 99,42
2. 2 , 1 2 0,051 2,133 2 , 0 1 1 99,47
3. 2,12 0,051 2,133 2,009 99,55 4. 2,33 0,056 2,342 2,008 99,60
x=99,5110,007 Tabel 10 e
Hasil penentuan kadar larutan uji trimetoprim sampel 5 dalam larutan dapar fosfat pH
Kadar Nilai Kadar ha Kadar Persen No. dibuat serapan sil per per Kadar
(bpj) hitungan 2 bpj ± SD (bpj)
1. 1,70 0,040 1,675 1,579 101,33
2. 1,70 0,040 1,675 1,579 101,36 3. 1,70 0,040 1,675 1,577 101,43 4. 1,87 0,044 1,842 1,579 101,36
x=101,37±0,002
Hasil penentuan kadar kotrimoksazol pada larutan dalam fosfat pH 7 pada kadar 2 bpj, 4bpJ, 6 bpj, 8
bpj dan 1 0 bpj tercantum pada tabel 1 1 berikut ini :
Tabel 11a
Hasil penentuan kadar larutan uji kotrimoksazol sampel 1 dalam larutan dapar fosfat pH 7
No. Kadar Nilai Kadar ha Persen Kadar Kadar ha Persen SMT serapan sil perhi- Kadar TMP sil perhi- Kadar
dibuat tungan ± SD dibuat tungan ± SD
256 nm 276 nm
'
1. 1,71 0 , 1 2 0 0,057 1,67 97,66 0,34 0,36 100,60
2. 1,70 0,119 0,057 1,64 96,47 0,34 0,40 117,70 3. 1,69 0,119 0,057 1,64 96,04 0,34 0,40 117,70 4. 1,68 0,118 0,056 1,64 97,62 0,34 0,35 102,90
x =1,65 x=96,95 x = 0,38 x=109,73
± 0,015 ± 0,819 ± 0,026 ± 9,256
Tabel lib
Hasil penentuan kadar larutan uji kotrimoksazol sampel 2 dalam larutan dapar fosfat pH 7
No. Kadar Nilai Kadar ha Persen Kadar Kadar ha Persen SMT serapan sil perhi- Kadar TMP sil perhi- Kadar
dibuat tungan ± SD dibuat tungan ± SD
256 nm 276 nm
1. 3,42 0,240 0,113 3,38 98,83 0,68 0,62 91,18
2. 3,40 0,239 0,113 3,35 98,53 0,68 0 , 6 6 97,06 3. 3,38 0,237 0 , 1 1 2 3,32 98,22 0 ,68 0,65 95,59 4. 3,36 0,237 0 , 1 1 2 3,32 98,88 0,67 0,65 97,02
x =3,34 x=98,65 x = 0,65 X- 95,21
± 0,029 ± 0,347 ± 0,015 ± 2,774
Tabel 11c
Hasil penentuan kadar larutan uji kotrimoksazol sampel 3 dalam larutan dapar fosfat pH 7
No. Kadar SMT dibuat
Nilai serapan
Kadar ha
sil perhi
tungan
Persen Kadar
± SD
Kadar TMP dibuat
Kadar ha
sil perhi
tungan
Persen Kadar
± SD 256 run 276 nm
1. 5,13 0,360 0,171 5,01 97,66 1,03 1,08 104,90
2. 5,10 0,358 0,170 4,99 97,84 1,02 1,06 103,90 3. 5,07 0,356 0,169 4,96 97,83 1,01 1,05 104,00 4. 5,04 0,354 0,169 4,96 97,22 1,01 1,14 112,90
x =4,97 x=97,64 x = 1,06 x=106,43
± 0,048 ± 0,290 ± 0,015 ± 4,340
Tabel lid
Hasil penentuan kadar larutan udi kotrimoksazol sampel 4 dalam larutan dapar fosfat pH 7
No. Kadar SMT dibuat
Nilai serapan
Kadar ha
sil perhi
tungan
Persen Kadar
± SD
Kadar TMP dibuat
Kadar ha
sil perhi
tungan
Persen Kadar
± SD 256 nm 276 nm
1. 6,84 0,479 0,228 6,65 97,22 1,37 1,48 108,00
2. 6,80 0,477 0,226 6,62 97,35 1,37 1,38 100,70 3. 6,76 0,475 0,226 6.60 97,63 1,35 1,46 108,20 4. 6,72 0,472 0,225 6,51 96,88 1,34 1,49 1 1 1,20
x =6,59 x=97,27 x = 1,45 x=107,03
± 0,065 ± 0,311 ± 0,055 ± 4,463
