UNIVERSITAS INDONESIA
Kemampuan PCR Gen psaA untuk Mendeteksi Inokulum Streptococcus pneumoniae dalam Media Cair
TESIS
dr. Yosepha Dwiyana 1006768572
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS PATOLOGI KLINIK
JAKARTA JANUARI 2015
Kemampuan PCR Gen psaA untuk Mendeteksi Inokulum Streptococcus pneumoniae dalam Media Cair
TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat
untuk memperoleh gelar Spesialis Patologi Klinik
dr. Yosepha Dwiyana 1006768572
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA
PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS PATOLOGI KLINIK JAKARTA
JANUARI 2015
Puji syukur saya panjatkan kepada Tuhan, Yesus Kristus, dan Bunda Maria karena atas berkat dan karunia-Nya, saya dapat menyelesaikan tesis ini. Penulisan tesis ini bertujuan untuk memenuhi salah satu syarat mencapai gelar Spesialis Patologi Klinik pada Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Selama menjalani pendidikan, khususnya saat menjalankan penelitian dan penyusunan tesis ini, banyak bimbingan dan dukungan yang telah saya terima. Tanpa itu semua, sangatlah sulit menyelesaikan Pendidikan Spesialis Patologi Klinik ini. Oleh karenanya, saya mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada:
1. dr. July Kumalawati, DMM, SpPK(K), selaku pembimbing utama penelitian, pembimbing akademik, serta guru dalam berbagai hal yang telah berkenan mencurahkan waktu dan pikirannya untuk membimbing saya hingga tesis ini selesai.
2. Bapak Dodi Safari, SSi, PhD, selaku pembimbing kedua penelitian, yang telah memberikan dukungan sangat berarti selama melaksanakan penelitian di Lembaga Biologi Molekular Eijkman, Jakarta;
memberikan arahan, pemikiran, dan berbagai saran praktis; serta memberikan kesempatan seluas-luasnya dalam menggunakan fasilitas laboratorium di Lembaga Eijkman.
3. Prof. dr. Suzanna Immanuel, SpPK(K); dr. Tonny Loho, DMM, SpPK(K); dan dr. Astuti Giantini, SpPK, selaku penguji, yang telah memberikan waktu dan pemikiran sepanjang menilai makalah ini, serta senantiasa memberikan masukan untuk memperbaiki penelitian ini.
4. Semua guru saya: Prof. dr. Marzuki Suryaatmadja, SpPK(K); Prof. dr.
Riadi Wirawan, SpPK(K); Prof. Dr. dr. Rustadi S., DMM, MS, SpPK(K); Prof. dr. Rahajuningsih D. Setiabudy, SpPK(K), DSc; dr.
Alida R. Harahap, SpPK(K), PhD; dr. Farida Oesman, SpPK(K); dr.
Dalima A.W. Astrawinata, SpPK(K), M.Epid; Dr. dr. Diana Aulia, SpPK(K); Dr. dr. Ina S. Timan, SpPK(K); dr. Ninik Sukartini, DMM, SpPK(K); dr. Fify Henrika, SpPK(K); dr. Yusra, SpPK, PhD; dr. Dewi
mengajar, mendidik, dan membantu saya selama masa pendidikan.
5. Rekan-rekan di Lembaga Biologi Molekular Eijkman: Ibu Lia, Majid, serta seluruh staf di Lembaga Eijkman yang telah membantu dan memudahkan saya selama penelitian.
6. Sdri. Farida Nurchaida dan karyawan-karyawan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Patologi Klinik FKUI/RSCM, serta seluruh analis dan karyawan di Laboratorium Patologi Klinik FKUI/RSCM yang telah membantu saya selama masa pendidikan dan penelitian ini.
7. Orangtua dan kakak saya yang selalu mendoakan dan mendukung saya dalam material dan moral untuk menyelesaikan pendidikan ini, terutama di saat-saat saya mengalami kesulitan, kebimbangan, dan kebuntuan.
8. Teman-teman di Patologi Klinik yang tidak dapat disebutkan satu- persatu, yang telah membantu dan mendukung saya selama masa pendidikan.
Akhir kata, saya berharap Tuhan berkenan membalas semua kebaikan kepada semua pihak yang telah membantu dan mohon maaf sebesar-besarnya bila ada yang kurang berkenan selama ini. Semoga tesis ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.
Jakarta, 8 Januari 2015 Penulis
Nama : Yosepha Dwiyana
Program Studi : Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Klinik
Judul : Kemampuan PCR Gen psaA untuk Mendeteksi Inokulum Streptococcus pneumoniae dalam Media Cair
Deteksi Streptococcus pneumoniae (pneumokokus) dilakukan dengan metode biakan dan PCR. Tujuan penelitian menentukan batas kemampuan tehnik PCR gen psaA mendeteksi inokulum pneumokokus dalam media cair sebelum inkubasi dan setelah inkubasi 24 jam.
Penelitian secara eksperimental menggunakan S.pneumoniae ATCC (American Type Culture Collection) 49619 yang ditumbuhkan pada media agar darah domba. Sepuluh mililiter suspensi bakteri dengan densitas 6x107/ml, 6x106/ml, 6x105/ml, 6x104/ml, 6x103/ml, 6x102/ml, 60/ml, 6/ml dimasukkan dalam media cair BD BACTEC™ Plus Aerobic/F Culture Vials. Masing-masing densitas diinokulasikan ke dalam 20 media cair tersebut. Selanjutnya, dari tiap media cair yang telah diinokulasi, sebelum inkubasi maupun setelah inkubasi 24 jam, dilakukan pewarnaan Gram, diinokulasikan pada media agar darah domba, serta uji PCR untuk mendeteksi gen psaA. Bila ditemukan pertumbuhan koloni pneumokokus pada media agar darah, dilanjutkan uji katalase dan sensitivitas optochin. Uji PCR psaA ”positif” bila ditemukan amplikon dengan berat molekul 838 pasang basa. Metode biakan dan PCR dinyatakan “mampu mendeteksi pneumokokus” bila > 60% dari 20 replicate memberikan hasil positif.
Dari masing-masing 20 replicate dengan densitas bakteri dalam inokulum awal 6x107/ml, 6x106/ml, 6x105/ml, 6x104/ml, 6x103/ml, 6x102/ml, 60/ml, 6/ml sebelum inkubasi, jumlah replicate yang terdeteksi gen psaA berturut-turut adalah 9/20 replicate (45%), 9/20 (45%), 3/20 (15%), 1/20 (5%), 0/20 (0%), 0/20 (0%), 0/20 (0%), 0/20 (0%). Setelah inkubasi 24 jam berturut-turut adalah 20/20 replicate (100%), 18/20 (90%), 11/20 (55%), 8/20 (40%), 4/20 (20%), 2/20 (10%), 0/20 (0%), 0/20 (0%). Dari data kadar DNA ekstrak terlihat uji PCR psaA penelitian ini membutuhkan kadar DNA ≥ 84 ng/µL. Hasil penelitian menunjukkan diperlukan inkubasi 24 jam agar terdeteksi oleh uji PCR psaA dengan densitas pneumokokus dalam inokulum awal minimal 6x106/ml. Kelemahan penelitian adalah proses ekstraksi DNA tidak optimal sehingga kadar DNA ekstrak sangat bervariasi dan menyebabkan gen psaA tidak terdeteksi sebelum inkubasi.
Kata kunci:
ATCC, densitas inokulum awal, kadar DNA, sebelum inkubasi, setelah inkubasi 24 jam
Name : Yosepha Dwiyana Study Program : Clinical Pathology
Title : The Performance of psaA Gene PCR to Detect Streptococcus pneumoniae in Inoculated Liquid media
Streptococcus pneumoniae (pneumococcal) detection can be done by culture and PCR methods. The purpose of this study was to determine the limits of psaA gene PCR in detecting pneumococcal inoculum prior to incubation and after 24 hours of incubation of liquid media.
This experimental study used Streptococcus pneumoniae ATCC (American Type Culture Collection) 49619 which was grown on sheep blood agar. Ten mililiter of bacterial suspensions with initial density of 6x107/ml, 6x106/ml, 6x105/ml, 6x104/ml, 6x103/ml, 6x102/ml, 60/ml and 6/ml were inoculated into liquid media, BD BACTEC™ Plus Aerobic/F Culture Vials. Each bacterial density was inoculated into these 20 liquid medias. From each inoculated BD BACTEC™
Plus Aerobic/F Culture Vial, prior to incubation and after 24 hours of incubation, Gram staining, subculturing on sheep blood agar, and psaA gene PCR were done.
When pneumococcal colonies were found on sheep blood agar, the colonies were tested for catalase and optochin sensitivity. PsaA gene were determined as
“positive” when amplicons with molecular weight 838 pairs of bases were found.
Culture and PCR methods were determined as able to detect pneumococcus when
> 60% of 20 replicates yield positive results.
The psaA PCR positive result rate of initial bacterial density of 6x107/ml, 6x106/ml, 6x105/ml, 6x104/ml, 6x103/ml, 6x102/ml, 60/ml, and 6/ml prior to incubation were 9/20 replicate (45%), 9/20 (45%), 3/20 (15%), 1/20 (5%), 0/20 (0%), 0/20 (0%), 0/20 (0%), 0/20 (0%), respectively. After 24 hours of incubations were 20/20 replicate (100%), 18/20 (90%), 11/20 (55%), 8/20 (40%), 4/20 (20%), 2/20 (10%), 0/20 (0%), 0/20 (0%), respectively. From the DNA extract data, it could be determined that this PCR method required a DNA concentration of ≥ 84 ng/µL.
Results showed a 24-hours incubation was needed in order to detect psaA by PCR and with the initial bacteria density of 6x106 organisms/ml in the inoculum. The weakness of study was DNA extraction process not optimal, shown by the variability of DNA concentration in the extracts which affected the ability of PCR to detect psaA gene prior to incubation.
Keywords:
ATCC, initial bacterial density, DNA concentration, prior to incubation, after 24 hours of incubation
HALAMAN JUDUL...i
HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS………ii
LEMBAR PENGESAHAN………iii
KATA PENGANTAR………....iv
LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ……...………….. vi
ABSTRAK……….vii
DAFTAR ISI...ix
DAFTAR TABEL...xi
DAFTAR GAMBAR...xi
DAFTAR LAMPIRAN...xii
DAFTAR ISTILAH DAN SINGKATAN...xii
BAB I PENDAHULUAN...1
1.1 Latar belakang...1
1.2 Permasalahan penelitian...2
1.3 Tujuan penelitian...2
1.3.1 Tujuan umum...2
1.3.2 Tujuan khusus...2
1.4 Manfaat penelitian... 3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA...4
2.1 Streptococcus pneumoniae...4
2.1.1 Karakteristik biologis...4
2.1.2 Epidemiologi...4
2.1.3 Komponen permukaan pneumokokus...5
2.1.4 Faktor virulensi………6
2.1.5 Identifikasi Streptococcus pneumoniae………...7
2.1.5.1 Identifikasi morfologi………7
2.1.5.2 Identifikasi biokimia………..9
2.1.5.2.1 Uji katalase……….9
2.1.5.2.2 Uji sensitivitas terhadap optochin………..9
2.1.5.2.2 Uji kelarutan dalam garam empedu………….11
2.1.5.3 Identifikasi secara molekular dengan tehnik PCR……...11
2.2 Kerangka teori penelitian...14
2.3 Kerangka konsep penelitian...15
BAB 3. METODOLOGI PENELITIAN...16
3.1 Desain penelitian...16
3.2 Tempat dan waktu penelitian...16
3.3 Bahan penelitian...16
3.4 Batasan operasional...16
3.5 Pemeriksaaan laboratorium...17
3.5.1 Alat………..17
3.5.2 Bahan………..17
3.5.2.1 Bakteri kontrol………..17
3.5.2.2 Media………....17
3.5.2.4 Bahan lainnya………...19
3.5.3 Cara kerja………...19
3.5.3.1 Alur kerja penelitian……….22
3.5.4 Pembuatan media agar darah domba………..22
3.5.5 Persiapan suspensi Streptococccus pneumoniae dengan pengenceran serial………..23
3.5.6 Uji katalase………...23
3.5.7 Uji sensitivitas optochin………...24
3.5.8 Biakan pada media biakan (BD BACTEC™ Plus Aerobic/F Medium)………..25
3.5.8.1 Prinsip………....25
3.5.8.2 Alat………25
3.5.8.3 Bahan………...25
3.5.8.4 Cara kerja………...25
3.5.9 Validasi volume DNA template yang dipakai untuk uji PCR psaA……….26
3.5.9.1 Tujuan………..26
3.5.9.2 Alat……….…..26
3.5.9.3 Bahan………...26
3.5.9.4 Cara kerja……….27
3.5.10 Ekstraksi DNA………28
3.5.11 Amplifikasi DNA dengan tehnik PCR………....30
3.5.12 Elektroforesis gel………....31
3.6 Pengolahan data...32
BAB 4. HASIL PENELITIAN...33
4.1 Identifikasi Streptococcus pneumoniae secara mikrobiologik...33
4.1.1 Pewarnaan Gram……….33
4.1.2 Pengamatan makroskopis koloni Streptococcus pneumoniae…...33
4.1.3 Uji katalase……….….34
4.1.4 Uji sensitivitas optochin……….….34
4.2 Hasil validasi volume DNA template pada uji PCR psaA...35
4.3 Hasil biakan dan uji PCR psaA sebelum inkubasi dan setelah inkubasi 24 jam ………...………36
BAB 5. PEMBAHASAN...40
5.1 Identifikasi Streptococcus pneumoniae secara mikrobiologik...40
5.2 Hasil penelitian pada sampel sebelum inkubasi dan setelah inkubasi 24 jam...40
BAB 6. KESIMPULAN DAN SARAN...42
6.1 Kesimpulan...42
6.2 Saran...42
DAFTAR PUSTAKA...43
LAMPIRAN...45
Tabel 3.1. Pengenceran serial untuk membuat suspensi bakteri dengan densitas
bakteri tertentu…...………. 19
Tabel 3.2. Perlakuan yang diberikan pada botol BD BACTEC™ Plus Aerobic/F Culture Vials setelah pengenceran serial…...20
Tabel 3.3. Tahapan amplifikasi DNA dalam thermocycler……… 30
Tabel 4.1. Data mentah hasil penelitian ………..47
Tabel 4.2. Hasil biakan dan uji PCR psaA yang positif pada sampel sebelum inkubasi…...………..………...37
Tabel 4.3. Hasil biakan dan uji PCR psaA yang positif pada sampel setelah inkubasi 24 jam...………..….38
DAFTAR GAMBAR Gambar 2.1. Struktur permukaan pneumokokus………5
Gambar 2.2. Alur identifikasi Streptococcus pneumoniae……….7
Gambar 2.3. Pewarnaan Gram pada spesimen sputum………..8
Gambar 2.4. Streptococcus pneumoniae dengan bagian tengah yang cekung pada inkubasi 24-48 jam, sedangkan Streptococcus viridans dengan bagian tengah yang cembung………....8
Gambar 2.5. Koloni pneumokokus dengan zona kehijauan pada hemolisis α…...9
Gambar 2.6. “Draughtman colonies” pada pneumokokus di media agar darah…9 Gambar 2.7. Hasil uji katalase yang positif dan negatif...……….9
Gambar 2.8. Uji sensitivitas terhadap optochin………...10
Gambar 2.9. Tahapan dalam siklus PCR……….12
Gambar 2.10. Kerangka teori penelitian………14
Gambar 2.11. Kerangka konsep penelitian………15
Gambar 3 Alur kerja penelitian………22
Gambar 4.1 Hasil pewarnaan Gram………33
Gambar 4.2 Koloni Streptococcus pneumoniae yang tumbuh pada media agar darah domba………34
Gambar 4.3 Hasil uji sensitivitas terhadap optochin………...34
Gambar 4.4 Visualisasi dari validaasi volume DNA template pada uji PCR psaA.……….35
Gambar 4.5 Salah satu contoh visualisasi hasil elektroforesis produk PCR gen psaA sebelum inkubasi dan setelah inkubasi 24 jam………..39
Lampiran 1. Keterangan lolos kaji etik………..…46 Lampiran 2. Data mentah hasil penelitian………..…47 Lampiran 3. Komposisi reagen………..…55
DAFTAR ISTILAH DAN SINGKATAN
Singkatan/Istilah Kepanjangan
PCR Polymerase Chain Reaction
WHO World Health Organization
ply Pneumolysin
pspA pneumococcal surface protein A psaA pneumococcal surface adhesin A cbpA choline-binding protein A
lytA Autolysin
DNA deoxyribonucleic acid
dsDNA Double stranded DNA
dNTP deoxyribonucleotide triphosphates dTTP deoxytimine triphosphates
pb pasang basa
ATCC American Type Culture Collection
NCCLS National Committee For Clinical Laboratory Standards SPS Sodium Polyanethol Sulfonate
bufer TBE bufer tris base boric acid-EDTA
TSA tryptone soya agar
RSCM Rumah Sakit Cipto Mangunkusumo
PENDAHULUAN
1.1 Latar belakang
Streptococcus pneumoniae (pneumokokus) merupakan bakteri patogen pada manusia yang menyebabkan berbagai penyakit infeksi seperti pneumonia, meningitis, otitis media, dan bakteremia pada anak dan dewasa. Sebagian besar studi epidemiologis mengenai penyakit pneumokokus ini telah dilaporkan pada populasi anak, namun data pada orang dewasa (terutama di Asia) masih terbatas.
Populasi di Asia merupakan populasi dengan pertumbuhan tercepat di dunia, sehingga penanganan terhadap penyakit pneumokokus ini akan memberi pengaruh yang besar terhadap kesehatan masyarakat di seluruh dunia. Bakteri ini diperkirakan menyebabkan 1,6 juta kematian tiap tahun. Infeksi pneumokokus merupakan penyebab utama kematian pada anak balita dan juga penyebab penting tingginya morbiditas dan mortalitas pada orang tua.1,2
Streptococcus pneumoniae pertama kali diidentifikasi pada akhir tahun 1800 dan awalnya dikenal sebagai penyebab utama pneumonia. Bakteri ini merupakan positif Gram dengan morfologi diplokokus atau kokus berantai pendek, berbentuk “lancet”, memiliki kapsul, aktivitas hemolisis α pada media agar darah, bersifat anaerob fakultatif, dan tumbuh optimal pada lingkungan dengan kadar CO2
5 %. Identifikasi bakteri ini awalnya dilakukan secara konvensional dengan mengamati morfologi bakteri dan adanya 4 karakteristik utama seperti hemolisis α pada media agar darah, katalase negatif, sensitif terhadap optochin, dan larut dalam garam empedu.2,3
Diagnosis infeksi pneumokokus secara klinis sering menjadi masalah karena manifestasi klinis akibat infeksi pneumokokus tidak khas. Baku emas pemeriksaan laboratorium untuk diagnosis adalah metode biakan, namun sering memberikan hasil yang negatif, karena pneumokokus merupakan bakteri yang bersifat fastidious.2,4
Deteksi pneumokokus secara molekular dilakukan dengan menggunakan tehnik polymerase chain reaction (PCR). Keuntungan tehnik PCR dibandingkan dengan metode biakan darah adalah dapat mendeteksi asam nukleat dari bakteri
pada spesimen dalam jumlah sedikit, hasilnya tidak dipengaruhi oleh terapi antibiotika yang diberikan sebelum pemeriksaan, tidak hanya mendeteksi bakteri yang masih hidup, dan waktu yang dibutuhkan untuk pemeriksaan lebih singkat.2 Penelitian King5 menyatakan bahwa tehnik PCR mampu mendeteksi pneumokokus dari media biakan darah yang pada biakan darah menunjukkan hasil negatif.5 Identifikasi pneumokokus dengan tehnik ini dapat dilakukan dengan mendeteksi gen yang mengkode protein pneumokokus seperti gen pneumolysin (ply), pneumococcal surface protein A (pspA), choline-binding protein A (cbpA), autolysin (lytA), pneumococcal surface adhesin A (psaA). PsaA merupakan protein permukaan yang diekspresikan oleh pneumokokus dan diekspresikan pada semua serotipe (90 serotipe) pneumokokus.6,7 Penelitian Putri8 menyatakan bahwa tehnik PCR yang menggunakan gen psaA mampu mendeteksi 52 (71,2%) isolat Streptococcus pneumoniae dari 73 isolat, yang diperoleh dari swab nasofaring pada anak di Lombok.8
1.2 Permasalahan Penelitian
Permasalahan penelitian yang timbul adalah belum diketahuinya kemampuan tehnik PCR untuk gen psaA mendeteksi inokulum S.pneumoniae dalam media cair sebelum inkubasi dan setelah inkubasi 24 jam.
1.3 Tujuan Penelitian 1.3.1 Tujuan umum
Menilai kemampuan tehnik PCR untuk gen psaA mendeteksi inokulum S.pneumoniae dalam media cair sebelum inkubasi dan setelah inkubasi 24 jam.
1.3.2 Tujuan khusus
Menentukan batas kemampuan tehnik PCR untuk gen psaA mendeteksi S.pneumoniae yang dinyatakan dalam jumlah awal bakteri dalam inokulum yang dapat dideteksi sebelum inkubasi dan setelah inkubasi 24 jam, sebagai simulasi bila digunakan pada spesimen klinis seperti darah.
1.4 Manfaat Penelitian
Menambah pengetahuan mengenai kemampuan tehnik PCR untuk gen psaA mendeteksi inokulum Streptococcus pneumoniae dalam media cair sebelum inkubasi dan setelah inkubasi 24 jam, serta kemungkinan penerapannya dalam biakan darah.
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Streptococcus pneumoniae 2.1.1 Karakteristik biologis
Streptococcus pneumoniae merupakan bakteri kokus positif Gram yang pada pewarnaan Gram tampak berpasangan (diplokokus), terkadang soliter atau tersusun dalam rantai yang pendek, serta berbentuk “lancet”. Streptococcus pneumoniae pertama kali diidentifikasi pada akhir tahun 1800 dan awalnya dikenal sebagai penyebab utama pneumonia. Pada media agar darah bakteri ini memiliki aktivitas hemolisis α, koloninya umumnya berukuran kecil, berwarna keabu-abuan, mukoid, tepi koloni rata, dan bagian tengah koloni tampak cekung. Pneumokokus mempunyai karakteristik berupa katalase negatif, bersifat anaerob fakultatif, tumbuh optimal pada lingkungan atmosfer dengan kadar CO2 5%, sensitif terhadap optochin, dan larut dalam garam empedu. Bakteri ini bersifat fastidious sehingga membutuhkan darah untuk tumbuh.4,9,10 .
Pneumokokus memiliki sekitar 90 serotipe berdasarkan kapsul polisakaridanya. Kapsul polisakarida ini merupakan salah satu faktor virulensi pada pneumokokus yang penting. Sebagian besar pneumokokus memiliki kapsul dan biasanya bersifat patogenik pada manusia. Pneumokokus yang tidak memiliki kapsul biasanya bersifat non-patogenik.11,12
2.1.2 Epidemiologi
Data epidemiologik mengenai insidens penyakit yang disebabkan oleh pneumokokus di Indonesia saat ini tidak tersedia. World Health Organization (WHO, 2007) memperkirakan sekitar 1 juta anak balita meninggal tiap tahunnya akibat penyakit yang disebabkan pneumokokus dan dilaporkan terdapat 130-597 per 100.000 penduduk di negara berkembang.13 Penelitian Yuliarti dkk13 menemukan 1 isolat pneumokokus dari 205 spesimen darah pada kelompok penderita berusia 28 hari - 60 bulan yang dirawat dengan pneumonia, meningitis, sepsis, dan bakteremia di Rumah Sakit Cipto Mangunkusumo (RSCM) dan Rumah Sakit Fatmawati, Jakarta. Pada penelitian tersebut insidens penyakit pneumokokus
tersebut tidak dihitung karena rendahnya jumlah kasus yang ditemukan. Penelitian di Bandung dan Surabaya yang serupa juga menemukan 2 kasus yang positif penyakit pneumokokus dari 466 penderita dan 5 kasus yang positif dari 1040 penderita.13 Penelitian di Singapura melaporkan data insidens (1995-2004) sebanyak 4275 kasus pada kelompok penderita berusia < 1 - ≥ 75 tahun (64%
diantaranya berusia > 15 tahun) yang dirawat di seluruh rumah sakit di Singapura.1
2.1.3 Komponen permukaan pneumokokus
Komponen permukaan pada pneumokokus dibedakan menjadi 3 lapis yaitu membran plasma, dinding sel, dan kapsul (Gambar 2.1). Dinding sel tersusun dari 3 lapisan peptidoglikan yang menjadi tempat melekatnya polisakarida kapsul, polisakarida dinding sel, dan mungkin juga berbagai protein. Kapsul merupakan lapisan paling tebal yang menutupi seluruh struktur bagian dalam dari pneumokokus. Struktur kimia polisakarida pada kapsul bersifat spesifik pada tiap serotipe pneumokokus. Struktur lain yang penting adalah lipoteichoic acid (antigen Forssman) yang mirip dengan struktur polisakarida dinding sel dengan penambahan komponen lipid yang berikatan secara kovalen dengan membran sel. Antigen Forssman merupakan inhibitor yang poten terhadap autolysin. Pneumokokus melepaskan antigen Forssman selama fase stasioner pada pertumbuhan, sehingga menyebabkan terjadinya destruksi dinding sel dan akhirnya terjadi lisis pada bakteri.12
Gambar 2.1. Struktur permukaan pneumokokus.
(1) Membran plasma. (2) Lapisan peptidoglikan pada dinding sel. (3) Polisakarida dinding sel dan berbagai protein. (4) Polisakarida dari kapsul. Polisakarida dinding sel terletak pada permukaan
bagian luar dan dalam pada dinding sel.12
2.1.4 Faktor virulensi
Virulensi dari pneumokokus dihubungkan dengan ketahanannya (resistensi) terhadap proses opsonisasi, fagositosis, dan mekanisme sel fagositik membunuh secara intraselular. Resistensi pneumokokus ini dapat terjadi akibat adanya kapsul polisakarida yang berperan sebagai anti-fagositik. Pneumokokus memiliki sedikitnya 90 serotipe yang dibedakan berdasarkan komposisi polisakarida pada kapsul tersebut. Protein lain yang dihasilkan oleh pneumokokus seperti pneumolysin (ply), pneumococcal surface protein A (pspA), autolysin (lytA), pneumococcal surface adhesin A (psaA) juga turut berperan dalam menentukan virulensi pneumokokus.14
PspA merupakan protein permukaan dengan ukuran molekul yang bervariasi (67-99 kDa) yang terdapat pada dinding sel pneumokokus. PspA berperan sebagai antigen yang bersifat protektif untuk pneumokokus, karena mampu mencegah aktivasi sistem komplemen pada tubuh pejamu (host).6
Pneumolysin (ply) merupakan salah satu faktor virulensi pada pneumokokus yang tidak diekspresikan pada permukaan. Ply adalah enzim sitoplasmik yang dilepaskan akibat kerja dari autolysin pada permukaan pneumokokus. Faktor virulensi dari ply dipengaruhi secara langsung oleh kerja autolysin.6
Autolysin (lytA) merupakan salah satu enzim yang dapat mendegradasikan peptidoglikan dari dinding sel pneumokokus sehingga menyebabkan terjadinya lisis dan kematian sel.6
PsaA merupakan faktor virulensi pneumokokus yang memiliki berat molekul 37 kDa dan terdiri dari 309 residu. PsaA berfungsi dalam transport ion Mn2+ dan Zn2+ ke dalam sitoplasma pneumokokus. PsaA melekat pada membran sel dan komponen lipid pneumokokus melalui ikatan kovalen.6 Penelitian Morrison7 menyatakan bahwa psaA diekspresikan oleh semua serotipe (90 serotipe) pneumokokus dan gen psaA dapat dideteksi pada semua serotipe pneumokokus tersebut dengan menggunakan tehnik PCR. Penelitian Morrison ini dapat menunjukkan bahwa deteksi gen psaA penting dalam mengidentifikasikan pneumokokus secara molekular.6 Penelitian ini menggunakan gen psaA dengan primer berupa [5’CTTTCTGCAATCATTCTTG3’] sebagai forward primer dan
[3’GCCTTCTTTACCTTGTTCTGC5’] sebagai reverse primer dengan tehnik PCR.7
2.1.5 Identifikasi Streptococcus pneumoniae
2.1.5.1 Identifikasi morfologi
Streptococcus pneumoniae merupakan bakteri kokus positif Gram yang pada pewarnaan Gram (Gambar 2.3) tampak berpasangan (diplokokus), namun dapat juga soliter atau tersusun dalam rantai yang pendek. Adanya terapi antibiotika sebelum pemeriksaan dan juga waktu melakukan tahapan dekolorisasi yang terlalu lama dapat memberikan hasil negatif palsu sehingga tampak sebagai diplokokus negatif Gram.3,14,15
Bakteri ini bersifat fastidious sehingga membutuhkan darah untuk tumbuh.
Pneumokokus akan tumbuh optimal pada media agar darah yang diinkubasi pada lingkungan atmosfer dengan kadar CO2 5 % dan suhu 35-370C selama 24-48 jam.
Karakteristik koloni yang tumbuh pada media agar darah adalah koloni berukuran kecil, berwarna keabu-abuan, mukoid, tepi koloni rata, dan dikelilingi oleh zona
Gambar 2.2. Alur identifikasi Streptococcus pneumoniae.15
kehijauan akibat adanya lisis eritrosit yang parsial (aktivitas hemolisis α, Gambar 2.5). Aktivitas hemolisis α dapat membedakan pneumokokus dengan organisme dari spesies lain, namun sulit dibedakan dengan Streptococcus viridans yang juga mempunyai aktivitas hemolisis α. Bentuk koloni pneumokokus pada media agar darah dengan usia biakan < 24 jam mirip sulit dibedakan dengan dengan Streptococcus viridans karena koloninya memiliki permukaan yang cembung.
Koloni pneumokokus yang tumbuh pada agar darah pada usia biakan 24-48 jam akan terlihat permukaannya mendatar dan pada bagian tengah koloni akan terlihat cekung (“draughtsman” colonies, Gambar 2.4 dan 2.6). Identifikasi pneumokokus (Gambar 2.2) dapat dilakukan dengan pewarnaan Gram, uji katalase, dan uji sensitivitas terhadap optochin yang dilaksanakan secara simultan, dengan uji kelarutan dalam garam empedu (bile solubility test) sebagai uji konfirmasi. Uji kepekaan terhadap optochin dan bile solubility test digunakan juga untuk membedakan pneumokokus dengan Streptococcus viridans. Streptococcus viridans menunjukkan resistensi terhadap optochin dan tidak larut dalam garam empedu.4,10,15
Gambar 2.3. Pewarnaan Gram pada spesimen Gambar 2.4. Streptococcus pneumoniae dengan sputum menunjukkan pneumokokus sebagai bagian tengah yang cekung (panah kuning) diplokokus Gram positif.15 pada inkubasi 24-48 jam, sedangkan
Streptococcus viridans dengan bagian tengah yang cembung (panah hijau).10
S.pneumoniae
S.viridans
2.1.5.2 Identifikasi biokimia 2.1.5.2.1 Uji katalase
Katalase adalah enzim yang memecah hidrogen peroksida (H2O2) menjadi H2O dan O2. Uji katalase positif ditunjukkan dengan terbentuknya gelembung- gelembung gas yang menandakan adanya O2 (Gambar 2.7). Uji katalase dapat digunakan untuk membedakan genus Streptococcus dengan Staphylococcus.
Organisme dengan spesies yang termasuk dalam genus Staphylococcus merupakan katalase positif, sedangkan genus Streptococcus merupakan katalase negatif.15
2.1.5.2.2 Uji sensitivitas terhadap optochin
Pneumokokus sensitif terhadap optochin (ethylhydrocupreine hydrochloride) yang merupakan substansi antimikroba yang digunakan hanya untuk kepentingan identifikasi pneumokokus secara laboratorik, tidak untuk
Gambar 2.5. Koloni pneumokokus dengan zona kehijauan pada hemolisis α (panah
hitam) pada media agar darah.15
Gambar 2.7. Hasil uji katalase yang positif dan negatif. Tidak terbentuknya gelembung-gelembung
gas menandakan uji katalase negatif. Semua genus Streptococcus merupakan katalase negatif.15
Gambar 2.6. “Draughtman colonies”
pada pneumokokus di media agar darah.16
kepentingan terapeutik. Cakram optochin sering disebut dengan “P disks”.
Walaupun pada umumnya pneumokokus sensitif terhadap optochin, dapat ditemukan pula strain pneumokokus yang resisten terhadap optochin. Uji kelarutan dalam garam empedu (bile solubility test) dapat digunakan sebagai pemeriksaan konfirmasi pada isolat pneumokokus yang resisten terhadap optochin. Pemeriksaan ini umumnya menggunakan cakram optochin dengan diameter 6 mm yang berisi 5 µg optochin dan dinilai dengan melihat diameter zona hambatan yang terbentuk di sekeliling cakram optochin pada media agar darah yang diinkubasi pada lingkungan atmosfer dengan kadar CO2 5% dan suhu 35-370C selama 24 jam. Zona inhibisi yang terbentuk (Gambar 2.8) dengan diameter ≥ 14 mm dikatakan sebagai sensitif terhadap optochin dan dapat diidentifikasikan sebagai pneumokokus. Bila zona inhibisi terbentuk dengan diameter < 14 mm ataupun tidak terbentuknya zona hambatan, maka pemeriksaan harus dilanjutkan dengan uji kelarutan dalam garam empedu (bile solubility test) sebagai pemeriksaan konfirmasi. Pada pemeriksaan yang menggunakan cakram optochin dengan diameter 10 mm yang berisi 5 µg optochin, zona inhibisi yang terbentuk dengan diameter ≥ 16 mm dikatakan sebagai sensitif terhadap optochin.2,10,15,16
Gambar 2.8. Uji sensitivitas terhadap optochin. Strain di sebelah
kiri resisten terhadap optochin (tidak terbentuk zona inhibisi). Strain di
sebelah kanan sensitif terhadap optochin.15
2.1.5.2.3 Uji kelarutan dalam garam empedu (bile solubility test)
Pemeriksaan ini akan menguji terjadinya autolisis dari dinding sel bakteri bila berada dalam larutan garam empedu. Tujuan dari pemeriksaan ini adalah membedakan pneumokokus yang bersifat larut dalam garam empedu dengan spesies Streptococcus hemolitik α lainnya (misalnya: Streptococcus viridans) yang tidak larut dalam garam empedu. Pneumokokus memproduksi amidase (autolysin) yang merupakan enzim intraselular yang bersifat autolitik. Penambahan garam empedu (misalnya: sodium deoksikolat) ke dalam suatu media artifisial akan menyebabkan perubahan pada permukaan dari dinding sel pneumokokus sehingga akan mengaktifkan amidase yang akan memecah ikatan antara muramic acid dengan alanin yang terdapat pada komponen peptidoglikan dinding sel pneumokokus.17
2.1.5.3 Identifikasi secara molekular dengan tehnik PCR
Tehnik PCR pertama kali ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan merupakan tehnik untuk melakukan sintesis dan amplifikasi (memperbanyak) daerah/segmen tertentu dari cetakan (template) DNA dengan bantuan enzim DNA polimerase secara in vitro. Tehnik PCR mampu mendeteksi asam nukleat dari organisme pada spesimen dalam jumlah sedikit, tidak dipengaruhi oleh pemberian antimikroba sebelumnya, tidak bergantung pada viabilitas mikroba target, dan membutuhkan waktu pemeriksaan yang singkat.2,18
Komponen/bahan yang dibutuhkan pada tehnik PCR adalah template DNA, sepasang primer oligonukleotida, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), enzim DNA polimerase yang thermostable, ion magnesium (MgCl2), dan bufer. Template DNA berperan sebagai cetakan sekuens target DNA spesifik yang akan diperbanyak. Sekuens target DNA yang digunakan mempunyai panjang 100-1000 pasang basa (base pairs, bp). Primer adalah untai oligonukleotida pendek yang mempunyai panjang 16-20 bp dan akan melekat dengan sekuens template DNA yang komplementer. DNA polimerase adalah enzim yang mengkatalisis sintesis untai DNA. Taq DNA polymerase merupakan enzim DNA polimerase yang sering digunakan. Ion magnesium berfungsi sebagai kofaktor bagi enzim DNA polimerase, karena enzim ini tidak dapat bekerja tanpa ion magnesium. Ion
magnesium ini akan menstimulasi aktivitas enzim DNA polimerase. Kadar magnesium sangat mempengaruhi efisiensi dan spesifisitas dari reaksi PCR. Kadar magnesium yang terlalu rendah akan menghasilkan sedikit atau tidak dihasilkan sama sekali produk PCR, sedangkan kadar magnesium yang terlalu tinggi akan menyebabkan akumulasi produk yang non-spesifik. Bufer merupakan larutan yang mencegah terjadinya perubahan pH sehingga aktivitas enzim DNA polimerase dapat optimal. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) berperan sebagai building blocks atau “batu bata” penyusun DNA yang baru dan terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP. Komponen dNTP ini akan melekat pada ujung 3’ dari primer saat terjadi proses elongasi.18-20
Gambar 2.9. Tahapan dalam siklus PCR.18
Target DNA diperbanyak dengan tehnik PCR melalui 3 tahapan (Gambar 2.9), yaitu denaturasi template DNA, annealing (penempelan pasangan primer), dan ekstensi/elongasi/pemanjangan primer. Ketiga tahapan ini sangat dipengaruhi oleh suhu. Satu siklus PCR terdiri dari 3 tahapan ini. Pada tahap awal dilakukan proses denaturasi, yaitu pemisahan dari template DNA untai ganda (double stranded) menjadi untai tunggal (single stranded) pada suhu 92-960C selama 30 detik hingga 5 menit. Tahap selanjutnya dilakukan annealing berupa penempelan primer dengan ujung-ujung segmen target DNA untai tunggal. Pada tahap kedua ini dilakukan proses pendinginan pada suhu 45-720C selama 20-40 detik untuk memberi kesempatan pada primer untuk menempel pada cetakan (template) DNA di tempat yang komplemen dengan sekuen primer. Tahap kedua ini akan menentukan spesifisitas dari PCR. Pada tahap ekstensi/elongasi, enzim DNA polimerase akan teraktivasi dan mulai memperpanjang primer yang sudah bergabung dengan segmen target DNA dengan menambahkan deoksinukleotida trifosfat (dNTP) yang komplemen dengan urutan nukleotida pada template DNA (adenin berpasangan dengan timin, sitosin berpasangan dengan guanin) hingga ke ujung segmen sehingga terbentuk DNA untai ganda kembali. Pada tahap ekstensi dilakukan pemanasan kembali pada suhu 720C, yang merupakan suhu optimal untuk enzim DNA polimerase yang thermostable. Waktu yang dibutuhkan pada tahap ketiga ini bergantung pada panjang DNA yang diamplifikasi, yaitu 1 menit untuk target DNA dengan panjang < 500 bp dan 2-3 menit untuk target DNA dengan panjang ≥ 500 bp. Produk PCR pada tiap akhir siklus dapat berperan sebagai bahan cetakan (template) untuk siklus berikutnya, sehingga fragmen DNA akan diperbanyak secara eksponensial. Pada tiap akhir siklus PCR akan dihasilkan peningkatan jumlah fragmen DNA (amplikon) sebanyak 2 kali lipat. Fragmen DNA dapat diperbanyak 2n kali setelah “n” siklus PCR. Pengulangan ketiga tahapan PCR tersebut umumnya terjadi dalam 25-35 siklus.18,21,22
Produk amplifikasi (amplikon) dari PCR umumnya dianalisis dengan menggunakan elektroforesis gel yang akan memberikan visualisasi dari segmen DNA yang diamplifikasi dan menentukan spesifisitasnya. Elektroforesis adalah teknik untuk memisahkan dan memurnikan ion, protein, dan molekul lain berdasarkan migrasi/pergerakan molekul bermuatan atau ion-ion dalam medan
listrik. Pada proses ini diberi arus listrik yang akan membuat migrasi fragmen DNA/asam nukleat yang bermuatan negatif (katoda) menuju ke kutub bermuatan positif (anoda) melalui media gel. Media gel yang sering digunakan saat ini adalah agarosa dan poliakrilamid yang mempunyai ukuran pori menyerupai ukuran protein dan asam nukleat, sehingga berfungsi sebagai saringan yang dapat memisahkan molekul DNA berdasarkan ukurannya. Gel agarosa memiliki ukuran pori yang yang besar, sehingga dapat digunakan untuk memisahlan asam nukleat dengan ukuran 50-30.000 pb (pasang basa). Gel poliakrilamid memiliki pori yang kecil, sehingga digunakan untuk memisahkan polinukleotida dengan ukuran < 5 basa hingga 2000 pb. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan ukuran/panjang fragmen DNA. Fragmen DNA yang lebih pendek akan bergerak lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang lebih panjang.20,22
2.2 Kerangka Teori Penelitian
Gambar 2.10. Kerangka teori penelitian.
Keterangan: PCR= polymerase chain reaction
2.3 Kerangka Konsep Penelitian
Gambar 2.11. Kerangka konsep penelitian.
Keterangan:
*) Karakterisitik koloni bakteri: kecil, keabu-abuan, mukoid, tepi rata, bagian tengah cekung, aktivitas hemolisis α PCR: polymerase chain reaction
: lingkup penelitian
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Desain penelitian
Penelitian dilakukan secara eksperimental.
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Lembaga Biologi Molekular Eijkman, Jakarta.
Waktu penelitian adalah bulan November-Desember 2014.
3.3 Bahan Penelitian
Bahan penelitian adalah bakteri kontrol Streptococcus pneumoniae ATCC (American Type Culture Collection) 49619 yang direkomendasikan oleh NCCLS (National Committee For Clinical Laboratory Standards).
3.4 Batasan Operasional
Identifikasi Streptococcus pneumoniae ditegakkan berdasarkan:
• Pada media agar darah domba yang diinkubasi pada suhu 35-370C dengan kadar CO2 5% selama 24 jam, tumbuh koloni bakteri dengan karakteristik koloni berukuran kecil, berwarna keabu-abuan, mukoid, tepi rata, bagian tengah cekung, dan memiliki aktivitas hemolisis α.
• Pada pewarnaan Gram tampak sebagai bakteri positif Gram dengan morfologi diplokokus atau kokus berantai pendek.
• Uji katalase memberikan hasil negatif.
• Uji sensitivitas terhadap optochin memberikan hasil yang sensitif terhadap optochin, yaitu terbentuk zona inhibisi berdiameter ≥ 14 mm dengan menggunakan cakram optochin berdiameter 6 mm.
Uji PCR untuk gen psaA Streptococcus pneumoniae dinyatakan “positif”
bila pada elektroforesis ditemukan amplikon dengan berat molekul 838 pasang basa.8
Metode biakan dan PCR dinyatakan “mampu mendeteksi Streptococcus pneumoniae” bila didapatkan > 60% dari 20 replicate yang memberikan hasil positif.
3.5 Pemeriksaan Laboratorium 3.5.1 Alat
Alat yang digunakan adalah kaca sediaan, sengkelit steril, bunsen, spuit disposable (ukuran 3 ml dan 10 ml), mikroskop, cawan petri disposable (ukuran 90 x 15 mm), inkubator, candle jar, pinset steril, tabung reaksi (ukuran 12 ml), alat densicheck yang dikalibrasi dengan densicheckTM calibration standard dari BioMerieux, alat BD BACTECTM 9050, tabung mikrosentrifus (ukuran 1,5 ml), sentrifus, freezer (suhu -200C dan -800C), pipet semiotomatik (ukuran 0,5-10 µL, 2-20 µL, 10-100 µL, 100-1000 µL) dengan tip pipet (steril) yang sesuai, jangka sorong, rak tabung, water bath, vortex mixer, thermoblock (suhu 40C), safety cabinet (NuAire® biological safety cabinet), laminar flow cabinet (ESCO® laminar flow cabinet), Applied Biosystems PCR GeneAmp® PCR Systems 9700 thermocycler, cetakan gel agarosa, labu Erlenmeyer (ukuran 250 ml), microwave, Thermo Scientific NanoDrop™ ND-1000 Spectrophotometer, tangki elektroforesis (Bio Rad® Wide Mini Sub (R) Cell GT), power supply, imaging gel documentation (Bio Rad® Gel Doc XR System), dan tabung PCR (ukuran 0,2 ml).
3.5.2 Bahan
3.5.2.1 Bakteri kontrol
Penelitian ini menggunakan bakteri kontrol Streptococcus pneumoniae ATCC (American Type Culture Collection) 49619 yang direkomendasikan oleh NCCLS (National Committee For Clinical Laboratory Standards).
3.5.2.2 Media
• Tryptone soya agar (TSA, Oxoid®, katalog nomor CM0131, masa kadaluarsa: Mei 2019) yang ditambahkan dengan 5% darah domba.
• BD BACTECTM Plus Aerobic/F Culture Vials (katalog nomor 442192, masa kadaluarsa: April 2015), berisi 30 ml larutan yang mengandung
soybean-casein digest broth 3%, yeast extract 0,25%, animal tissue digest, amino acids 0,05%, sugar, sodium citrate, sodium polyanetholsulfonate (SPS) 0,05%, vitamins 0,025%, antioxidants/reductants 0,005%, nonionic adsorbing resin 16%, dan cationic exchange resin 1%.
3.5.2.3 Reagen
• NaCl 0,9% steril
• Gram-color staining kit (Merck®, terdiri dari: larutan kristal violet, lugol, alkohol 70%, dan safranin)
• Larutan H2O2 30% (Merck®)
• Cakram optochin (Oxoid®, katalog nomor DD0001, masa kadaluarsa: April 2015) dengan diameter 6 mm, yang berisi 5 µg optochin
• Phosphate buffered saline (PBS) 1x
• Lysozyme (10 mg/ml dalam 10 mM Tris-HCl, pH 8)
• Isopropanol absolut
• Etanol absolut
• High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche®, katalog nomor 11 796 828 001, masa kadaluarsa: Oktober 2015)
• GoTaq® Green Master Mix (Promega®, katalog nomor M7122, masa kadaluarsa: 29 April 2017)
• Primer (konsentrasi 40 µM) untuk deteksi gen psaA, yang terdiri dari primer psaA forward [5’CTTTCTGCAATCATTCTTG3’] dan primer psaA reverse [3’GCCTTCTTTACCTTGTTCTGC5’] serta kontrol positif berupa DNA bakteri yang terbukti memiliki gen psaA melalui tehnik PCR.
• Nuclease-free water (ddH2O)
• Bubuk agarosa (Vivantis®, katalog nomor PC0701-100G, masa kadaluarsa:
Februari 2016)
• 1x TBE (Tris-borate-EDTA) buffer
• GelRed™ Nucleic Acid Gel Stain 0,5 ml (Biotium™)
• VC 100 bp Plus DNA ladder 50 µg (Vivantis®, katalog nomor NL1407)
3.5.2.4 Bahan lainnya
Bahan lain yang dipakai adalah sarung tangan nitril, masker, alcohol swab, paper towel, parafilm, spiritus, dan minyak imersi.
3.5.3 Cara kerja
Bakteri kontrol Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 ditumbuhkan media agar darah domba yang diinkubasi pada suhu 35-370C dengan kadar CO2 5%
selama 24 jam. Karakteristik koloni yang tumbuh pada media tersebut adalah kecil, berwarna keabu-abuan, mukoid, tepi rata, bagian tengah cekung, dan memiliki aktivitas hemolisis α.
Langkah selanjutnya adalah membuat suspensi bakteri dengan mencampurkan 10 ml NaCl 0,9% steril dengan koloni bakteri Streptococcus pneumoniae yang diambil dengan sengkelit steril pada bagian puncak koloni kuman. Kekeruhan suspensi bakteri ini diatur hingga sesuai dengan standar kekeruhan 4 McFarland yang ekuivalen dengan densitas bakteri sebanyak 12 x 108 organisme/ml. Kekeruhan suspensi bakteri 4 McFarland ini diukur dengan menggunakan alat densicheck yang dikalibrasi dengan densicheckTM calibration standard dari BioMerieux. Alat ini mampu mengukur kekeruhan suspensi bakteri 0-4 McFarland. Tabung yang berisi suspensi bakteri 4 McFarland dinamakan tabung 1. Selanjutnya dari suspensi bakteri 4 McFarland ini dilakukan pengenceran serial dengan ketentuan yang dapat dilihat pada Tabel 3.1.
Tabel 3.1. Pengenceran serial untuk membuat suspensi bakteri dengan densitas bakteri tertentu.
Nomor Tabung
Densitas Bakteri (organisme/ml)
Pengenceran
(suspensi bakteri / NaCl 0,9%) 1
2
12 x 108
12 x 107 1 ml (tabung 1) / 9 ml
3 12 x 106 1 ml (tabung 2) / 9 ml
4 12 x 105 1 ml (tabung 3) / 9 ml
5 12 x 104 1 ml (tabung 4) / 9 ml
6 12 x 103 1 ml (tabung 5) / 9 ml
7 12 x 102 1 ml (tabung 6) / 9 ml
8 12 x 101 1 ml (tabung 7) / 9 ml
Setelah dilakukan pengenceran serial, dari tiap tabung tersebut (tabung 1-8) diambil 0,5 ml suspensi bakteri yang selanjutnya bersama dengan 9,5 ml NaCl 0,9%, dimasukkan ke dalam botol BD BACTECTM Plus Aerobic/F Culture Vials, lalu dihomogenkan. Dengan demikian, dinamakan botol 1-8 sesuai suspensi bakteri dari tabung 1-8 yang dimasukkan ke dalam botol BD BACTECTM Plus Aerobic/F Culture Vials (Tabel 3.2).
Tabel 3.2. Perlakuan yang diberikan pada botol BD BACTECTMPlus Aerobic/F Culture Vials setelah pengenceran serial.
Densitas Bakteri (organisme/ml)
Perlakuan Nomor Botol
Densitas Awal Bakteri dalam Inokulum
(organisme/ml) 12 x 108
0,5 ml suspensi bakteri dari tiap tabung + 9,5 ml NaCl 0,9% + 30 ml (botol BD BACTECTM Plus
Aerobic/F Culture Vials)
1 6 x 107
12 x 107 2 6 x 106
12 x 106 3 6 x 105
12 x 105 4 6 x 104
12 x 104 5 6 x 103
12 x 103 6 6 x 102
12 x 102 7 60
12 x 101 8 6
Selanjutnya, pada tiap botol (botol 1-8) diberi perlakuan seperti terlihat pada alur kerja penelitian (Gambar 3). Botol BD BACTECTM Plus Aerobic/F Culture Vials diinkubasi dengan menggunakan alat BD BACTECTM 9050 selama 24 jam.
Pada Gambar 3 terlihat bahwa pada tiap botol BD BACTECTM Plus Aerobic/F Culture Vials, saat sebelum inkubasi dan pasca-inkubasi 24 jam, diberi perlakuan berupa pewarnaan Gram; diinokulasikan pada media agar darah domba yang diinkubasi pada suhu 35-370C dengan kadar CO2 5% selama 24 jam untuk diamati ada atau tidak adanya pertumbuhan bakteri dengan karakteristik koloni kecil, berwarna keabu-abuan, mukoid, tepi rata, bagian tengah cekung, dan memiliki aktivitas hemolisis α; serta diambil 1 ml suspensi dari tiap botol sebagai bahan PCR menggunakan primer psaA. Bila dijumpai pertumbuhan bakteri pada media agar darah domba dengan karakteristik koloni bakteri seperti yang disebutkan di atas,
maka dilanjutkan dengan uji katalase. Pada uji katalase dengan hasil negatif dilanjutkan dengan uji sensitivitas terhadap optochin.
Identifikasi Streptococcus pneumoniae ditegakkan berdasarkan hasil pewarnaan Gram berupa bakteri positif Gram dengan morfologi diplokokus atau kokus berantai pendek, disertai dengan adanya pertumbuhan bakteri pada media agar darah domba yang diinkubasi pada suhu 35-370C dengan kadar CO2 5% selama 24 jam dengan karakteristik koloni kecil, berwarna keabu-abuan, mukoid, tepi rata, bagian tengah cekung, dan memiliki aktivitas hemolisis α; uji katalase negatif;
sensitif terhadap optochin. Uji PCR untuk keseluruhan sampel sebelum inkubasi maupun setelah inkubasi 24 jam dilakukan masing-masing sebanyak 1 kali. Uji PCR untuk gen psaA Streptococcus pneumoniae dinyatakan “positif” bila pada elektroforesis ditemukan amplikon dengan berat molekul 838 pasang basa.8 Baik untuk biakan maupun PCR dinyatakan “mampu mendeteksi Streptococcus pneumoniae” bila didapatkan > 60% dari 20 replicate yang memberikan hasil positif.
Hasil yang diperoleh akan digunakan untuk menentukan batas kemampuan tehnik PCR gen psaA mendeteksi Streptococcus pneumoniae yang dinyatakan dalam jumlah awal bakteri dalam inokulum yang dapat dideteksi sebelum inkubasi dan setelah inkubasi 24 jam.
3.5.3.1 Alur kerja penelitian
3.5.4 Pembuatan media agar darah domba
Media agar darah domba dibuat dengan mencampurkan 10 ml bubuk Tryptone Soya Agar (TSA, Oxoid®, katalog nomor CM0131) ke dalam 250 ml air destilasi dalam labu Erlenmeyer (ukuran 250 ml). Suspensi ini dipanaskan dalam
Gambar 3. Alur kerja penelitian.
Keterangan:
*) Bila tidak segera dilakukan PCR, bahan pemeriksaan ini dapat disimpan di freezer dengan suhu -200C atau -800C.
**) Karakterisitik koloni bakteri: kecil, keabu-abuan, mukoid, tepi rata, bagian tengah cekung, aktivitas hemolisis α
PCR: polymerase chain reaction
microwave hingga larut sempurna. Suspensi yang sudah larut ini kemudian dilakukan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. Setelah proses autoklaf selesai, labu Erlenmeyer ini didinginkan di dalam water bath pada suhu 560C hingga suhu water bath konstan. Larutan kemudian dicampurkan dengan 5% darah domba (12,5 ml darah domba) dan dihomogenkan. Larutan ini siap dituangkan ke dalam cawan petri (steril). Media yang sudah berada di dalam cawan petri ini dibiarkan di dalam laminar flow cabinet hingga mengeras, lalu dapat disimpan di dalam refrigerator.
3.5.5 Persiapan suspensi Streptococcus pneumoniae dengan pengenceran serial
Suspensi bakteri dibuat dengan mencampurkan 10 ml NaCl 0,9% steril dengan koloni bakteri Streptococcus pneumoniae yang diambil dengan sengkelit steril pada bagian puncak koloni bakteri. Kekeruhan suspensi bakteri ini diatur hingga sesuai dengan standar kekeruhan 4 McFarland yang ekuivalen dengan densitas bakteri sebanyak 12 x 108 organisme/ml. Kekeruhan suspensi bakteri 4 McFarland ini diukur dengan menggunakan alat densicheck yang sudah dikalibrasi dengan densicheckTM calibration standard dari BioMerieux. Alat ini mampu mengukur kekeruhan suspensi bakteri 0-4 McFarland. Tabung yang berisi suspensi bakteri 4 McFarland dinamakan tabung 1. Selanjutnya dari suspensi bakteri 4 McFarland ini dilakukan pengenceran serial dengan ketentuan yang dapat dilihat pada Tabel 1. Pada persiapan ini diperlukan alat berupa tabung steril (ukuran 12 ml), sengkelit steril, spuit steril (ukuran 10 ml), alat densicheck. Bahan yang diperlukan adalah NaCl 0,9% steril, bakteri kontrol Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 yang ditumbuhkan media agar darah domba yang diinkubasi pada suhu 35-370C dengan kadar CO2 5% selama 24 jam.
3.5.6 Uji katalase
Katalase adalah enzim yang memecah hidrogen peroksida (H2O2) menjadi H2O dan O2. Uji katalase positif ditunjukkan dengan terbentuknya gelembung- gelembung gas yang menandakan adanya O2. Uji katalase dapat digunakan untuk membedakan genus Streptococcus dengan Staphylococcus. Organisme dengan
spesies yang termasuk dalam genus Staphylococcus merupakan katalase positif, sedangkan genus Streptococcus dan Enterococcus merupakan katalase negatif.14
Uji katalase yang sering dilakukan adalah dengan slide method. Pada uji ini diambil bagian tengah dari satu koloni murni bakteri berusia 24 jam yang tumbuh di media agar darah domba dengan ujung dari swab stick yang sudah dipotong menjadi lebih pendek dan diletakkan di atas kaca objek yang bersih. Larutan H2O2
30% kemudian diteteskan 1 tetes di atas kaca objek tersebut. Hasil dari uji katalase dapat terlihat setelah beberapa saat. Uji katalase dikatakan positif bila terbentuk gelembung-gelembung gas setelah beberapa saat tersebut. Jika tidak terbentuk gelembung, maka uji katalase dikatakan negatif.16
3.5.7 Uji sensitivitas optochin
Pemeriksaan ini dapat membedakan pneumokokus dengan spesies Streptococcus lainnya yang juga mempunyai aktivitas hemolisis α (misalnya:
Streptococcus viridans), karena pneumokokus umumnya sensitif terhadap optochin (ethylhydrocupreine hydrochloride). Cakram optochin sering disebut dengan “P disks”.15,16
Bahan pemeriksaan ini adalah satu koloni murni bakteri berusia 24 jam yang tumbuh di media agar darah domba, media agar darah domba, dan cakram optochin (Oxoid®, katalog nomor DD0001) berdiameter 6 mm yang berisi 5 µg optochin.
Satu koloni murni diinokulasikan pada media agar darah domba, lalu cakram optochin diletakkan di bagian tengah media atau daerah dengan inokulum padat, menggunakan pinset steril. Media tersebut selanjutnya diinkubasi pada suhu 35- 370C selama 24 jam, dengan kadar CO2 5%. Diameter zona inhibisi yang terbentuk di sekitar cakram setelah inkubasi 24 jam diukur dengan jangka sorong. Zona inhibisi yang terbentuk dengan diameter ≥ 14 mm dikatakan sebagai sensitif terhadap optochin dan dapat diidentifikasikan sebagai pneumokokus. Zona inhibisi yang terbentuk dengan diameter < 14 mm dikatakan sebagai resisten terhadap optochin, yang dieksklusi pada penelitian ini.15,16
3.5.8 Biakan pada media biakan (BD BACTECTM Plus Aerobic/F Medium) 3.5.8.1 Prinsip
Bila mikroorganisme terdapat dalam bahan pemeriksaan yang diinokulasi dalam botol/vial BD BACTECTM Plus Aerobic/F Medium, maka CO2 akan dihasilkan saat terjadi metabolisme substrat yang ada di vial oleh organisme tersebut. CO2 akan bereaksi dengan substansi kimia yang bersifat fluoresens dan merupakan sensor pada vial. Peningkatan fuoresensi yang disebabkan oleh tingginya jumlah CO2, akan terdeteksi oleh fotodetektor pada alat. Sinyal ini kemudian akan dikirimkan ke komputer pada alat, sehingga akan dianalisis sebagai hasil positif. Hasil positif ini akan terlihat berupa lampu indikator pada tempat vial berada akan menyala dan juga adanya bunyi alarm.
3.5.8.2 Alat
Alat yang dipakai adalah spuit steril (ukuran 10 ml), alcohol swab, alat BD BACTECTM 9050, botol/vial BD BACTECTM Plus Aerobic/F Medium.
3.5.8.3 Bahan
Bahan yang digunakan adalah suspensi bakteri Streptococcus pneumoniae dengan standar kekeruhan 4 McFarland yang ekuivalen dengan densitas bakteri sebanyak 12 x 108 organisme/ml. Kekeruhan suspensi bakteri 4 McFarland ini diukur dengan menggunakan alat densicheck yang dikalibrasi dengan densicheckTM calibration standard dari Biomerieux. Selanjutnya dari suspensi bakteri 4 McFarland ini dilakukan pengenceran secara serial sesuai ketentuan yang dapat dilihat pada Tabel 3.1.
3.5.8.4 Cara kerja
Setelah dilakukan pengenceran serial, dari tiap tabung tersebut (tabung 1-8) diambil 0,5 ml suspensi bakteri yang selanjutnya bersama dengan 9,5 ml NaCl 0,9%, dimasukkan ke dalam botol media biakan (BD BACTECTM Plus Aerobic/F Medium) yang berisi 30 ml larutan di dalamnya lalu dihomogenkan. Dengan demikian, dinamakan botol 1-8 sesuai suspensi bakteri dari tabung 1-8 yang dimasukkan ke dalam botol BD BACTECTM Plus Aerobic/F Medium (Tabel 3.2).
Botol BD BACTECTM Plus Aerobic/F Medium diinkubasikan pada alat BD BACTECTM 9050 selama 24 jam.
Pada tiap botol BD BACTECTM Plus Aerobic/F Culture Vials, saat sebelum inkubasi dan pasca-inkubasi 24 jam, diberi perlakuan berupa pewarnaan Gram;
diinokulasikan pada media agar darah domba yang diinkubasi pada suhu 35-370C dengan kadar CO2 5% selama 24 jam untuk diamati ada atau tidak adanya pertumbuhan bakteri dengan karakteristik koloni kecil, berwarna keabu-abuan, mukoid, tepi rata, bagian tengah cekung, dan memiliki aktivitas hemolisis α; serta diambil 1 ml suspensi dari tiap botol sebagai bahan PCR menggunakan primer psaA.
3.5.9 Validasi volume DNA template yang dipakai untuk uji PCR psaA 3.5.9.1 Tujuan
Validasi ini bertujuan untuk menentukan volume DNA template yang optimal untuk digunakan dalam campuran PCR sebagai reagen PCR, agar visualisasi dari produk amplifikasi PCR dengan elektroforesis gel (berupa pita DNA spesifik yang telah diamplifikasi) menjadi lebih jelas.
3.5.9.2 Alat
Alat yang dipakai adalah tabung mikrosentrifus (ukuran 1,5 ml), sentrifus, freezer (suhu -200C), pipet semiotomatik (ukuran 0,5-10 µL, 2-20 µL, 10-100 µL, 100-1000 µL) dengan tip pipet (steril) yang sesuai, vortex mixer, thermoblock (suhu 40C), laminar flow cabinet (ESCO® laminar flow cabinet), Applied Biosystems PCR GeneAmp PCR Systems 9700 thermocycler, cetakan gel agarosa, labu Erlenmeyer (ukuran 250 ml), microwave, tangki elektroforesis (Bio Rad® Wide Mini Sub (R) Cell GT), power supply, imaging gel documentation (Bio Rad® Gel Doc XR System), dan tabung PCR (ukuran 0,2 ml).
3.5.9.3 Bahan
Bahan yang digunakan dalam campuran PCR sebagai reagen PCR adalah hasil ekstraksi DNA (sebagai DNA template), GoTaq® Green Master Mix (Promega®), primer psaA (primer psaA forward dan reverse) dengan konsentrasi
40 µM, nuclease-free water (ddH2O), bubuk agarosa (Vivantis®), bufer TBE 1x, GelRed™ Nucleic Acid Gel Stain 0,5 ml (Biotium™), dan VC 100 bp Plus DNA ladder 50 µg (Vivantis®).
3.5.9.4 Cara kerja
Hasil ekstraksi DNA diamplifikasi dengan tehnik PCR konvensional menggunakan primer psaA (forward primer dan reverse primer). Campuran PCR (master mix 1x) terdiri dari GoTaq® Green Master Mix, primer psaA (forward primer dan reverse primer), ddH2O, dan DNA template. Volume campuran PCR yang digunakan adalah 25 µl. Proses pembuatan master mix PCR dilakukan dengan menggunakan thermoblock (suhu 40C).
Pada awalnya digunakan volume DNA template 2 µl pada campuran PCR.
Komposisi campuran PCR yang digunakan adalah GoTaq® Green Master Mix 10 µL, forward primer psaA 0,25 µL, reverse primer psaA 0,25 µL, ddH2O 12,5 ml, dan DNA template 2 µl. Pada tabung kontrol positif dimasukkan 2 µl DNA template dari bakteri kontrol S.pneumoniae ATCC 49619, sedangkan pada tabung kontrol negatif dimasukkan 2 µl ddH2O. Campuran PCR tersebut kemudian dilakukan sentrifugasi (spin down) untuk homogenisasi campuran PCR. Amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan alat Applied Biosystems PCR GeneAmp® PCR Systems 9700 thermocycler untuk 30 siklus. Alat ini dijalankan dengan program seperti tertera pada Tabel 3.3. Produk amplifikasi (amplikon) DNA selanjutnya dianalisis dengan elektroforesis gel, dengan hasil berupa pita DNA yang spesifik divisualisasikan dengan gel documentation system. Pada uji PCR gen psaA ini dikatakan “positif” bila pada elektroforesis ditemukan amplikon dengan berat molekul 838 pasang basa. Pada visualisasi hasil elektroforesis produk PCR dengan menggunakan volume DNA template 2 µL, dilihat apakah pita DNA yang menunjukkan amplikon dengan berat molekul 838 pasang basa, terlihat cukup jelas.
Bila pita DNA tersebut terlihat kurang jelas, dicoba dengan menggunakan volume DNA template 5 µL pada campuran PCR.
Bila menggunakan volume DNA template 5 µL, komposisi campuran PCR yang digunakan adalah GoTaq® Green Master Mix 10 µL, forward primer psaA 0,25 µL, reverse primer psaA 0,25 µL, ddH2O 9,5 ml, dan DNA template 5 µl. Pada
tabung kontrol positif dimasukkan 5 µl DNA template dari bakteri kontrol S.pneumoniae ATCC 49619, sedangkan pada tabung kontrol negatif dimasukkan 5 µl ddH2O. Proses selanjutnya yang dilakukan adalah sama seperti di atas. Bila dengan menggunakan volume DNA template 5 µL pada campuran PCR, visualisasi hasil elektroforesis produk PCR tampak lebih jelas dibandingkan dengan menggunakan volume DNA template 2 µL, maka untuk selanjutnya volume DNA template 5 µL ini divalidasi untuk uji PCR psaA pada sampel lainnya.
3.5.10 Ekstraksi DNA
Prosedur ekstraksi DNA dilakukan dengan menggunakan High Pure PCR Template Preparation Kit dari Roche®. Elution buffer dihangatkan hingga suhu 700C sebelum prosedur dimulai. Proteinase K dilarutkan dalam 4,5 ml nuclease- free water (ddH2O), lalu dibuat beberapa aliquot sesuai kebutuhan pemakaian.
Aliquot larutan proteinase K yang belum dipakai disimpan dalam freezer dengan suhu (-15)-(-25)0C. Inhibitor removal buffer, sebelum digunakan, ditambahkan dengan 20 ml etanol absolut, lalu diberi label dan tanggal penambahan etanol absolut pada botol tersebut. Wash buffer, sebelum digunakan, ditambahkan 80 ml etanol absolut, lalu diberi label dan tanggal penambahan etanol absolut pada botol tersebut. Inhibitor removal buffer dan wash buffer yang sudah ditambahkan dengan etanol absolut dapat disimpan pada suhu 15-250C.23
Sampel sebanyak 1 ml dalam tabung mikrosentrifus steril (ukuran 1,5 ml) disentrifugasi dengan kecepatan 13000 g selama 5 menit. Supernatan dibuang.
Endapan disuspensikan dalam 1 ml PBS, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13000 g selama 5 menit. Supernatan dibuang, lalu endapan disuspensikan dalam 200 µL PBS. Suspensi ini ditambahkan 5 µL lysozyme (10 mg/ml dalam 10 mM Tris-HCl, pH 8) dan diinkubasi dalam penangas air selama 15 menit pada suhu 370C. Selanjutnya, suspensi sampel tersebut ditambahkan 200 µL binding buffer dan 40 µL proteinase K, lalu dicampur segera dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 700C. Suspensi sampel kemudian ditambahkan 100 µL isopropanol dan dihomogenkan. Satu high pure filter tube dipasang pada 1 tabung pengumpul.
Pipetkan suspensi sampel ke dalam bagian atas buffer reservoir dari filter tube.
