Pengolahan data - METODOLOGI PENELITIAN

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

BAB 3. METODOLOGI PENELITIAN

3.6 Pengolahan data

Metode biakan dan PCR dinyatakan “mampu mendeteksi Streptococcus pneumoniae” bila didapatkan > 60% dari 20 replicate yang memberikan hasil positif. Hasil digunakan untuk menentukan batas kemampuan tehnik PCR gen psaA mendeteksi Streptococcus pneumoniae yang dinyatakan dalam jumlah awal bakteri dalam inokulum yang dapat dideteksi sebelum inkubasi dan setelah inkubasi 24 jam.

HASIL PENELITIAN

4.1 Identifikasi Streptococcus pneumoniae secara Mikrobiologik 4.1.1 Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram yang dilakukan pada sampel menunjukkan gambaran mikroskopis berupa bakteri kokus positif Gram yang tersusun berpasangan (diplokokus), namun ada juga yang soliter ataupun kokus berantai pendek. Hal ini dapat dilihat pada Gambar 4.1. Sampel berasal dari bakteri kontrol Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 dalam media cair BD BACTEC^TM Plus Aerobic/F Culture Vials.

4.1.2 Pengamatan makroskopis koloni Streptococcus pneumoniae

Koloni Streptococcus pneumoniae yang tumbuh pada media agar darah domba yang diinkubasi pada suhu 35-37⁰C dengan kadar CO2 5% selama 24 jam mempunyai karakteristik berupa koloni berukuran kecil, berwarna keabu-abuan, mukoid, tepi rata, bagian tengah cekung, dan memiliki aktivitas hemolisis α. Hal ini terlihat pada Gambar 4.2.

Gambar 4.1. Hasil pewarnaan Gram.

[Sumber: dokumentasi pribadi]

4.1.3 Uji katalase

Semua sampel yang menunjukkan pertumbuhan koloni Streptococcus pneumoniae pada media agar darah domba dilakukan uji katalase, yang menunjukkan hasil negatif. Hasil negatif ditunjukkan dengan tidak terbentuknya gelembung-gelembung gas setelah diteteskannya larutan H2O2 30% di atas kaca objek yang sudah diberi satu koloni murni bakteri berusia 24 jam yang tumbuh di media agar darah domba.

4.1.4 Uji sensitivitas optochin

Semua sampel yang menunjukkan uji katalase negatif dilanjutkan dengan uji sensitivitas optochin, yang menunjukkan hasil sensitif terhadap optochin.

Sensitivitas terhadap optochin ditunjukkan dengan terbentuknya zona inhibisi di sekitar cakram optochin dengan diameter ≥ 14 mm. Hal ini dapat dilihat pada Gambar 4.3. Sensitivitas terhadap optochin ini sesuai dengan identifikasi pada Streptococcus pneumoniae.

Gambar 4.2. Koloni Streptococcus pneumoniae yang tumbuh pada media agar darah domba. [Sumber: dokumentasi pribadi]

Gambar 4.3. Hasil uji sensitivitas terhadap optochin.

Hasil keduanya pada gambar di atas menunjukkan sensitif terhadap optochin, berupa terbentuknya zona inhibisi di

sekitar cakram optochin dengan diameter ≥ 14 mm.

[Sumber: dokumentasi pribadi]

4.2 Hasil Validasi Volume DNA Template pada Uji PCR psaA

Uji PCR psaA menggunakan volume DNA template 2 µL pada campuran PCR menunjukkan visualisasi pita DNA dari hasil elektroforesis tidak jelas.

Amplifikasi gen psaA ditandai dengan terbentuknya pita DNA berukuran 838 pasang basa (pb).⁸ Visualisasi dari validasi volume DNA template yang dipakai pada uji PCR psaA terlihat pada Gambar 4.4.

Uji PCR psaA dilanjutkan dengan menggunakan volume DNA template 5 µL pada campuran PCR, karena visualisasi pita DNA dari hasil elektroforesis dengan menggunakan volume DNA template 2 µL pada campuran PCR tidak jelas, yang dapat disebabkan oleh kadar DNA rendah sehingga dibutuhkan volume DNA template lebih banyak dalam campuran PCR agar visualisasi lebih optimal.

Visualisasi hasil elektroforesis produk PCR dengan menggunakan volume DNA template 5 µL ini terlihat lebih jelas dibandingkan dengan volume DNA template 2 µL (Gambar 4.4), sehingga untuk selanjutnya volume DNA template 5 µL divalidasi untuk digunakan dalam campuran PCR untuk uji PCR psaA pada sampel lainnya.

Gambar 4.4. Visualisasi dari validasi volume DNA template pada uji PCR psaA. Amplifikasi gen psaA ditandai dengan adanya

pita DNA berukuran 838 pb (pasang basa).

Kolom 1. DNA ladder (VC 100 bp Plus DNA ladder, Vivantis^®) Kolom 2. Sampel 1.1, sebelum inkubasi (volume DNA template 2 µL) Kolom 3. Kontrol positif (volume DNA template 2 µL)

Kolom 4. Kontrol negatif

Kolom 5. Sampel 1.1, sebelum inkubasi (volume DNA template 5 µL) Kolom 6. Kontrol positif (volume DNA template 5 µL)

Kolom 7. Kontrol negatif

[Sumber: dokumentasi pribadi]

4.3 Hasil Biakan dan Uji PCR psaA Sebelum Inkubasi dan Setelah Inkubasi 24 Jam

Data mentah hasil penelitian dapat dilihat pada Lampiran 2 (Tabel 4.1).

Hasil biakan dan uji PCR psaA pada sampel sebelum inkubasi dapat dilihat pada Tabel 4.2. Hasil pada inokulum dengan densitas awal bakteri 6 x 10⁷ organisme/ml sebelum inkubasi adalah terdeteksi 20 dari 20 replicate (100%) yang tumbuh dengan metode biakan, dan terdeteksi 9 dari 20 replicate (45%) uji PCR psaA yang positif. Hasil pada inokulum dengan densitas awal bakteri 6 x 10⁶ organisme/ml sebelum inkubasi adalah terdeteksi 20 dari 20 replicate (100%) yang tumbuh dengan metode biakan, dan terdeteksi 9 dari 20 replicate (45%) uji PCR psaA yang positif. Hasil pada inokulum dengan densitas awal bakteri 6 x 10⁵ organisme/ml sebelum inkubasi adalah terdeteksi 20 dari 20 replicate (100%) yang tumbuh dengan metode biakan, dan terdeteksi 3 dari 20 replicate (15%) uji PCR yang positif. Hasil pada inokulum dengan densitas awal bakteri 6 x 10⁴ organisme/ml sebelum inkubasi adalah tidak terdeteksi sama sekali dari 20 replicate (0%) yang tumbuh dengan metode biakan, dan terdeteksi 1 dari 20 replicate (5%) uji PCR psaA yang positif. Hasil pada inokulum dengan densitas awal bakteri 6 x 10³ organisme/ml sebelum inkubasi adalah tidak terdeteksi sama sekali dari 20 replicate (0%) yang tumbuh dengan metode biakan, maupun dengan uji PCR psaA yang positif. Hasil pada inokulum dengan densitas awal bakteri 6 x 10² organisme/ml, 6 x 10¹ organisme/ml, dan juga 6 organisme/ml sebelum inkubasi serupa dengan hasil pada inokulum dengan densitas awal bakteri 6 x 10³ organisme/ml sebelum inkubasi, yaitu tidak terdeteksi sama sekali dari 20 replicate (0%) yang tumbuh dengan metode biakan, maupun dengan uji PCR psaA yang positif. Korelasi antara kadar DNA dan hasil uji PCR psaA positif sebelum inkubasi terlihat pada Lampiran 2 (Tabel 4.1), yang menunjukkan bahwa sampel dengan hasil uji PCR psaA positif mempunyai kadar DNA berkisar antara 85,4 ng/µL (densitas awal bakteri 6 x 10⁵ organisme/ml dalam inokulum) hingga 130,7 ng/µL (densitas awal bakteri 6 x 10⁷ organisme/ml dalam inokulum).

Tabel 4.2. Hasil biakan dan uji PCR psaA yang positif pada sampel sebelum inkubasi.

Hasil biakan dan uji PCR psaA pada sampel setelah inkubasi selama 24 jam dapat dilihat pada Tabel 4.3. Hasil pada inokulum dengan densitas awal bakteri 6 x 10⁷ organisme/ml setelah inkubasi selama 24 jam adalah terdeteksi 20 dari 20 replicate (100%) yang tumbuh dengan metode biakan, maupun dengan uji PCR psaA yang positif. Hasil pada inokulum dengan densitas awal bakteri 6 x 10⁶ organisme/ml setelah inkubasi selama 24 jam adalah terdeteksi 20 dari 20 replicate (100%) yang tumbuh dengan metode biakan, dan terdeteksi 18 dari 20 replicate (90%) uji PCR psaA yang positif. Hasil pada inokulum dengan densitas awal bakteri 6 x 10⁵ organisme/ml setelah inkubasi selama 24 jam adalah terdeteksi 20 dari 20 replicate (100%) yang tumbuh dengan metode biakan, dan terdeteksi 11 dari 20 replicate (55%) uji PCR psaA yang positif. Hasil pada inokulum dengan densitas awal bakteri 6 x 10⁴ organisme/ml setelah inkubasi selama 24 jam adalah terdeteksi 20 dari 20 replicate (100%) yang tumbuh dengan metode biakan, dan terdeteksi 8 dari 20 replicate (40%) uji PCR psaA yang positif. Hasil pada inokulum dengan densitas awal bakteri 6 x 10³ organisme/ml setelah inkubasi selama 24 jam adalah terdeteksi 20 dari 20 replicate (100%) yang tumbuh dengan metode biakan, dan terdeteksi 4 dari 20 replicate (20%) uji PCR psaA yang positif. Hasil pada inokulum dengan densitas awal bakteri 6 x 10² organisme/ml setelah inkubasi selama 24 jam adalah terdeteksi 20 dari 20 replicate (100%) yang tumbuh dengan metode biakan, dan terdeteksi 2 dari 20 replicate (10%) uji PCR psaA yang positif. Hasil pada

inokulum dengan densitas awal bakteri 6 x 10¹ organisme/ml dan juga 6 organisme/ml setelah inkubasi selama 24 jam adalah tidak terdeteksi sama sekali dari 20 replicate (0%) yang tumbuh dengan metode biakan, maupun dengan uji PCR psaA yang positif. Korelasi antara kadar DNA dan hasil uji PCR psaA positif setelah inkubasi selama 24 jam terlihat pada Lampiran 2 (Tabel 4.1), yang menunjukkan bahwa sampel dengan hasil uji PCR psaA positif mempunyai kadar DNA berkisar antara 84,3 ng/µL (densitas awal bakteri 6 x 10² organisme/ml dalam inokulum) hingga 179,6 ng/µL (densitas awal bakteri 6 x 10⁷ organisme/ml dalam inokulum).

Tabel 4.3. Hasil biakan dan uji PCR psaA yang positif pada sampel setelah inkubasi 24 jam.

Eksperimen (Setelah Inkubasi 24 Jam)

Uji PCR psaA (Setelah Inkubasi 24 Jam)

1 6 x 10⁷ 20 / 20 replicate (100%) 20 / 20 replicate (100%)

Gambar 4.5 menunjukkan salah satu contoh visualisasi hasil elektroforesis produk PCR pada replicate 1, sebelum inkubasi dan setelah inkubasi 24 jam.

Gambar 4.5. Salah satu contoh visualisasi hasil elektroforesis produk PCR gen psaA sebelum inkubasi dan setelah inkubasi 24 jam. Amplifikasi gen psaA ditandai dengan

adanya pita DNA berukuran 838 pb (pasang basa).

Kolom 1. DNA ladder (VC 100 bp Plus DNA ladder, Vivantis^®) Kolom 2. Sampel 1.1 (sebelum inkubasi), psaA (+)

Kolom 3. Sampel 1.1 (setelah inkubasi 24 jam), psaA (+) Kolom 4. Sampel 1.2 (sebelum inkubasi), psaA (+) Kolom 5. Sampel 1.2 (setelah inkubasi 24 jam), psaA (+) Kolom 6. Sampel 1.3 (sebelum inkubasi), psaA (-) Kolom 7. Sampel 1.3 (setelah inkubasi 24 jam), psaA (+) Kolom 8. Sampel 1.4 (sebelum inkubasi), psaA (-) Kolom 9. Sampel 1.4 (setelah inkubasi 24 jam), psaA (+) Kolom 10. Sampel 1.5 (sebelum inkubasi), psaA (-) Kolom 11. Sampel 1.5 (setelah inkubasi 24 jam), psaA (-) Kolom 12. Sampel 1.6 (sebelum inkubasi), psaA (-) Kolom 13. Sampel 1.6 (setelah inkubasi 24 jam), psaA (-) Kolom 14. Sampel 1.7 (sebelum inkubasi), psaA (-) Kolom 15. Sampel 1.7 (setelah inkubasi 24 jam), psaA (-) Kolom 16. Sampel 1.8 (sebelum inkubasi), psaA (-) Kolom 17. Sampel 1.8 (setelah inkubasi 24 jam), psaA (-) Kolom 18. Kontrol positif

Kolom 19. Kontrol negatif

[Sumber: dokumentasi pribadi]

PEMBAHASAN

5.1 Identifikasi Streptococcus pneumoniae secara Mikrobiologik

Hasil pewarnaan Gram, pengamatan makroskopis koloni yang tumbuh pada media agar darah domba, uji katalase, dan uji sensitivitas terhadap optochin menunjukkan identifikasi Streptococcus pneumoniae, yang sesuai dengan sampel yang berasal dari bakteri kontrol Streptococcus pneumoniae ATCC 49619.

5.2 Hasil Penelitian pada Sampel Sebelum Inkubasi dan Setelah Inkubasi 24 Jam

Metode biakan dan PCR dinyatakan “mampu mendeteksi Streptococcus pneumoniae” bila didapatkan > 60% dari 20 replicate yang memberikan hasil positif. Tabel 4.2 menunjukkan hasil biakan dan uji PCR psaA positif dari 20 replicate sebelum inkubasi. Biakan sebelum inkubasi menunjukkan pertumbuhan koloni Streptococcus pneumoniae pada media agar darah domba, yang dikonfirmasi dengan uji katalase negatif dan sensitivitas terhadap optochin, mulai pada inokulum dengan densitas awal bakteri 6 x 10⁵ organisme/ml. Hasil uji PCR psaA sebelum inkubasi tidak ada yang memenuhi kriteria “mampu mendeteksi Streptococcus pneumoniae”, sehingga diperlukan inkubasi 24 jam agar dapat memenuhi kriteria tersebut.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa kadar DNA yang dibutuhkan agar dapat terdeteksi dengan uji PCR psaA adalah ≥ 84 ng/µL. Hal ini terlihat pada hasil uji PCR psaA positif sebelum inkubasi yang tidak dapat memenuhi kriteria “mampu mendeteksi Streptococcus pneumoniae”, misalnya pada inokulum dengan densitas awal bakteri 6 x 10⁷ organisme/ml, 6 x 10⁶ organisme/ml, 6 x 10⁵ organisme/ml hanya tedeteksi 9 (45%), 9 (45%), 3 (15%) dari 20 replicate. Kemungkinan penyebab dapat berupa proses ekstraksi DNA yang tidak optimal sehingga akhirnya kadar DNA yang diekstraksi sangat bervariasi, ada yang rendah, sehingga mempengaruhi hasil uji PCR pada penelitian. Hal ini dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti jumlah/volume sampel yang dilakukan ekstraksi DNA, konsentrasi proteinase K dan lama inkubasinya, serta volume elution buffer.

Optimasi tehnik ekstraksi DNA dapat dilakukan pada beberapa faktor tersebut,

seperti meningkatkan jumlah/volume sampel, meningkatkan konsentrasi proteinase K dan lama inkubasinya, serta optimasi pada volume elution buffer. Proteinase K merupakan enzim yang termasuk dalam kelompok protease serin dan digunakan pada prosedur ekstraksi DNA untuk mendenaturasi protein, serta menginaktivasi nuklease yang dapat mendegradasi/merusak DNA selama proses ekstraksi.

Proteinase K juga berperan pada lisis sel (bakteri) sehingga melepaskan DNA dari sel (bakteri).²⁶

Tabel 4.3 menunjukkan hasil biakan dan uji PCR psaA positif dari 20 replicate pada sampel setelah inkubasi selama 24 jam. Biakan setelah inkubasi selama 24 jam menunjukkan pertumbuhan koloni Streptococcus pneumoniae pada media agar darah domba mulai pada inokulum dengan densitas awal bakteri 6 x 10² organisme/ml. Hasil uji PCR psaA pada sampel setelah inkubasi selama 24 jam dapat memenuhi kriteria “mampu mendeteksi Streptococcus pneumoniae” mulai pada inokulum dengan densitas awal bakteri 6 x 10⁶ organisme/ml. Hasil uji PCR psaA sampel setelah inkubasi 24 jam dapat memenuhi kriteria karena jumlah/densitas bakterinya sudah lebih banyak setelah diinkubasi selama 24 jam sehingga bisa lebih banyak terdeteksi dengan uji PCR psaA. Namun, penelitian ini tidak bertujuan untuk menentukan jumlah/densitas bakteri setelah diinkubasi selama 24 jam, melainkan jumlah/densitas awal bakteri dalam inokulum.

KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan

Pada penelitian ini telah dilakukan uji PCR menggunakan gen psaA Streptococccus pneumoniae dari spesimen berupa inokulum bakteri kontrol Streptococccus pneumoniae dengan densitas bakteri tertentu dalam media cair. Bila hasil penelitian ini diaplikasikan pada spesimen klinis (misalnya: darah), sebelum inkubasi tidak dapat mendeteksi S.pneumoniae, tetapi setelah inkubasi 24 jam, bila inokulum awal sebesar ≥ 6 x 10⁶ organisme/ml dalam spesimen, mulai dapat terdeteksi dengan uji PCR psaA.

Berdasarkan data kadar DNA hasil ekstraksi dan hasil uji PCR psaA sebelum inkubasi dan setelah inkubasi 24 jam, ternyata diperlukan kadar DNA ≥ 84 ng/µL untuk memberikan hasil uji PCR psaA yang positif. Kelemahan pada penelitian ini adalah proses ekstraksi DNA yang tidak optimal sehingga kadar DNA yang diekstraksi sangat bervariasi dan menyebabkan gen psaA tidak terdeteksi sebelum inkubasi, serta baru dapat mendeteksi S.pneumoniae dengan jumlah ≥ 6 x 10⁶ organisme/ml setelah inkubasi 24 jam.

6.2 Saran

Penelitian lebih lanjut dapat dilakukan dengan optimasi pada tehnik ekstraksi DNA.

DAFTAR PUSTAKA

1. Hung IFN, Tantawichien T, Tsai YH, Patil S, Zotomayor R. Regional epidemiology of invasive pneumococcal disease in Asian adults: epidemiology, disease burden, serotype distribution, and antimicrobial resistance patterns and prevention. Int J Infect Dis. 2013; 17:e364-73.

2. Bandettini R, Melioli G. Laboratory diagnosis of Streptococcus pneumoniae infections: past and future. J Prev Med Hyg. 2012; 53:85-8.

3. Blaschke AJ. Interpreting assays for the detection of Streptococcus pneumoniae. Clin Infect Dis. 2011; 52(Suppl 4):S331-7.

4. Todar K. Streptococcus pneumoniae [Internet]. 2012 [cited 2014 Oct 13].

Available from: http://textbookofbacteriology.net/S.pneumoniae.html.

5. King MH, Baldeh I, Secka O, Falade A, Greenwood B. Detection of Streptococcus pneumoniae DNA in blood cultures by PCR. J Clin Microbiol.

1994; 32(7):1721-4.

6. Jedrzejas MJ. Pneumococcal virulence factors: structure and function.

Microbiol Mol Biol Rev. 2001; 65(2):187-207.

7. Morrison KE, Lake D, Crook J, Carlone GM, Ades E, Facklam R, et al.

Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. J Clin Microbiol.

2000; 38(1):434-7.

8. Putri RRH. Identifikasi bakteri untypeable Streptococcus pneumoniae menggunakan gen psaA, lytA, cpsA, dan recA [Internet]. 2013 [cited 2014 November 5]. Available from: http:// lib.ui.ac.id/file?file=digital/20347654-S47317-Rengganis%20RHP.pdf.

9. Kaijalainen T. The identification of Streptococcus pneumoniae. 1^st ed. Helsinki:

National Public Health Institute; 2006.

10. Perilla MJ, Ajello G, Bopp C, Elliott J, Facklam R, Knapp JS, et al. Manual for the laboratory identification and antimicrobial susceptibility testing of bacterial pathogens of public health importance in the developing world. 1^st ed.

Switzerland: World Health Organization; 2003.

11. Catterall JR. Streptococcus pneumoniae. Thorax. 1999; 54:929-37.

12. Velasco EA, Verheul AF, Verhoef J, Snippe H. Streptococcus pneumoniae:

virulence factors, pathogenesis, and vaccines. Microbiol Rev. 1995; 59(4):591-603.

13. Yuliarti K, Hadinegoro SR, Supriyatno B, Karuniawati A. Invasive pneumococcal disease among hospitalized children aged 28 days to 60 months in Jakarta. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2012; 43(1):136-44.

14. Winn WC, Koneman EW, Allen SD, Procop GW, Schreckenberger PC, Janda WM, et al. Koneman’s color atlas and textbook of diagnostic microbiology. 6^th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2006. p. 672-764.

15. Castillo D, Harcourt B, Hatcher C, Jackson M, Katz L, Mair R, et al. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. WHO manual. 2^nd ed.

Geneva: World Health Organization; 2011. p. 73-86.

16. Werno AM, Murdoch DR. Laboratory diagnosis of invasive pneumococcal disease. Clin Infect Dis. 2008; 46:926-32.

17. MacFaddin JF. Biochemical tests for identification of medical bacteria. 3^rd ed.

Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2000.

18. McPherson MJ, Moller SG. PCR. 2^nd ed. New York: Taylor & Francis Group;

2006.

19. Rustam YH. Mengenal PCR (polymerase chain reaction) [Internet]. 2009 [cited 2014 Sept 21]. Available from: http://sciencebiotech.net/mengenal-pcr-polymerase-chain-reaction/.

20. Stephenson FH, Abilock MC. Optimizing the polymerase chain reaction [Internet]. 2012 [cited 2014 Sept 21]. Available from:

http://www.babec.org/files/PCR_2012/PCR_Optimization_Student_Guide_2012.pdf 21. Pelt-Verkuil E, Belkum A, Hays JP. Principles and technical aspects of PCR

amplification. 1^st ed. Netherland: Springer; 2008.

22. Amersham Biosciences. PCR product analysis: a guide to using semidry flatbed gel electrophoresis [Internet]. [cited 2014 Sept 21]. Available from:

http://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/131 4729545976/litdoc80643796_20140706224920.pdf.

23. Roche. High pure PCR template preparation kit [Internet]. 2012 [cited 2014 Oct 30]. Available from: http://www.roche-applied-science.com.

24. Thermo Fisher Scientific. Nucleic acid. Thermo Scientific NanoDrop spectrophotometers [Internet]. 2010 [cited 2015 Jan 10]. Available from:

http://www.nanodrop.com/ND1/files/nanodrop_nucleicacid_olv_rev_3_11_r.pdf.

25. Thermo Fisher Scientific. NanoDrop 1000 spectrophotometer user's manual [Internet]. 2008 [cited 2015 Jan 10]. Available from:

http://www.nanodrop.com/library/nd-1000-v3.7-users-manual-8.5x11.pdf.

26. Kim J. 10 questions you want to ask about proteinase K [Internet]. 2013 [cited 2015 Jan 10]. Available from: http://info.agscientific.com/blog/bid/158711/10-Questions-you-want-to-ask-about-PROTEINASE-K.

LAMPIRAN

Lampiran 1. Keterangan lolos kaji etik

Lampiran 2.

Tabel 4.1. Data mentah hasil penelitian.