Batasan operasional

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

BAB 3. METODOLOGI PENELITIAN

3.4 Batasan operasional

Identifikasi Streptococcus pneumoniae ditegakkan berdasarkan:

• Pada media agar darah domba yang diinkubasi pada suhu 35-37⁰C dengan kadar CO2 5% selama 24 jam, tumbuh koloni bakteri dengan karakteristik koloni berukuran kecil, berwarna keabu-abuan, mukoid, tepi rata, bagian tengah cekung, dan memiliki aktivitas hemolisis α.

• Pada pewarnaan Gram tampak sebagai bakteri positif Gram dengan morfologi diplokokus atau kokus berantai pendek.

• Uji katalase memberikan hasil negatif.

• Uji sensitivitas terhadap optochin memberikan hasil yang sensitif terhadap optochin, yaitu terbentuk zona inhibisi berdiameter ≥ 14 mm dengan menggunakan cakram optochin berdiameter 6 mm.

Uji PCR untuk gen psaA Streptococcus pneumoniae dinyatakan “positif”

bila pada elektroforesis ditemukan amplikon dengan berat molekul 838 pasang basa.⁸

Metode biakan dan PCR dinyatakan “mampu mendeteksi Streptococcus pneumoniae” bila didapatkan > 60% dari 20 replicate yang memberikan hasil positif.

3.5 Pemeriksaan Laboratorium 3.5.1 Alat

Alat yang digunakan adalah kaca sediaan, sengkelit steril, bunsen, spuit disposable (ukuran 3 ml dan 10 ml), mikroskop, cawan petri disposable (ukuran 90 x 15 mm), inkubator, candle jar, pinset steril, tabung reaksi (ukuran 12 ml), alat densicheck yang dikalibrasi dengan densicheck^TM calibration standard dari BioMerieux, alat BD BACTEC^TM 9050, tabung mikrosentrifus (ukuran 1,5 ml), sentrifus, freezer (suhu -20⁰C dan -80⁰C), pipet semiotomatik (ukuran 0,5-10 µL, 2-20 µL, 10-100 µL, 100-1000 µL) dengan tip pipet (steril) yang sesuai, jangka sorong, rak tabung, water bath, vortex mixer, thermoblock (suhu 4⁰C), safety cabinet (NuAire^® biological safety cabinet), laminar flow cabinet (ESCO^® laminar flow cabinet), Applied Biosystems PCR GeneAmp^® PCR Systems 9700 thermocycler, cetakan gel agarosa, labu Erlenmeyer (ukuran 250 ml), microwave, Thermo Scientific NanoDrop™ ND-1000 Spectrophotometer, tangki elektroforesis (Bio Rad^® Wide Mini Sub (R) Cell GT), power supply, imaging gel documentation (Bio Rad^® Gel Doc XR System), dan tabung PCR (ukuran 0,2 ml).

3.5.2 Bahan

3.5.2.1 Bakteri kontrol

Penelitian ini menggunakan bakteri kontrol Streptococcus pneumoniae ATCC (American Type Culture Collection) 49619 yang direkomendasikan oleh NCCLS (National Committee For Clinical Laboratory Standards).

3.5.2.2 Media

• Tryptone soya agar (TSA, Oxoid^®, katalog nomor CM0131, masa kadaluarsa: Mei 2019) yang ditambahkan dengan 5% darah domba.

• BD BACTEC^TM Plus Aerobic/F Culture Vials (katalog nomor 442192, masa kadaluarsa: April 2015), berisi 30 ml larutan yang mengandung

soybean-casein digest broth 3%, yeast extract 0,25%, animal tissue digest, amino acids 0,05%, sugar, sodium citrate, sodium polyanetholsulfonate (SPS) 0,05%, vitamins 0,025%, antioxidants/reductants 0,005%, nonionic adsorbing resin 16%, dan cationic exchange resin 1%.

3.5.2.3 Reagen

• NaCl 0,9% steril

• Gram-color staining kit (Merck^®, terdiri dari: larutan kristal violet, lugol, alkohol 70%, dan safranin)

• Larutan H2O2 30% (Merck^®)

• Cakram optochin (Oxoid^®, katalog nomor DD0001, masa kadaluarsa: April 2015) dengan diameter 6 mm, yang berisi 5 µg optochin

• Phosphate buffered saline (PBS) 1x

• Lysozyme (10 mg/ml dalam 10 mM Tris-HCl, pH 8)

• Isopropanol absolut

• Etanol absolut

• High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche^®, katalog nomor 11 796 828 001, masa kadaluarsa: Oktober 2015)

• GoTaq^® Green Master Mix (Promega^®, katalog nomor M7122, masa kadaluarsa: 29 April 2017)

• Primer (konsentrasi 40 µM) untuk deteksi gen psaA, yang terdiri dari primer psaA forward [5’CTTTCTGCAATCATTCTTG3’] dan primer psaA reverse [3’GCCTTCTTTACCTTGTTCTGC5’] serta kontrol positif berupa DNA bakteri yang terbukti memiliki gen psaA melalui tehnik PCR.

• Nuclease-free water (ddH2O)

• Bubuk agarosa (Vivantis^®, katalog nomor PC0701-100G, masa kadaluarsa:

Februari 2016)

• 1x TBE (Tris-borate-EDTA) buffer

• GelRed™ Nucleic Acid Gel Stain 0,5 ml (Biotium™)

• VC 100 bp Plus DNA ladder 50 µg (Vivantis^®, katalog nomor NL1407)

3.5.2.4 Bahan lainnya

Bahan lain yang dipakai adalah sarung tangan nitril, masker, alcohol swab, paper towel, parafilm, spiritus, dan minyak imersi.

3.5.3 Cara kerja

Bakteri kontrol Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 ditumbuhkan media agar darah domba yang diinkubasi pada suhu 35-37⁰C dengan kadar CO2 5%

selama 24 jam. Karakteristik koloni yang tumbuh pada media tersebut adalah kecil, berwarna keabu-abuan, mukoid, tepi rata, bagian tengah cekung, dan memiliki aktivitas hemolisis α.

Langkah selanjutnya adalah membuat suspensi bakteri dengan mencampurkan 10 ml NaCl 0,9% steril dengan koloni bakteri Streptococcus pneumoniae yang diambil dengan sengkelit steril pada bagian puncak koloni kuman. Kekeruhan suspensi bakteri ini diatur hingga sesuai dengan standar kekeruhan 4 McFarland yang ekuivalen dengan densitas bakteri sebanyak 12 x 10⁸ organisme/ml. Kekeruhan suspensi bakteri 4 McFarland ini diukur dengan menggunakan alat densicheck yang dikalibrasi dengan densicheck^TM calibration standard dari BioMerieux. Alat ini mampu mengukur kekeruhan suspensi bakteri 0-4 McFarland. Tabung yang berisi suspensi bakteri 4 McFarland dinamakan tabung 1. Selanjutnya dari suspensi bakteri 4 McFarland ini dilakukan pengenceran serial dengan ketentuan yang dapat dilihat pada Tabel 3.1.

Tabel 3.1. Pengenceran serial untuk membuat suspensi bakteri dengan densitas bakteri tertentu.

(suspensi bakteri / NaCl 0,9%) 1

Setelah dilakukan pengenceran serial, dari tiap tabung tersebut (tabung 1-8) diambil 0,5 ml suspensi bakteri yang selanjutnya bersama dengan 9,5 ml NaCl 0,9%, dimasukkan ke dalam botol BD BACTEC^TM Plus Aerobic/F Culture Vials, lalu dihomogenkan. Dengan demikian, dinamakan botol 1-8 sesuai suspensi bakteri dari tabung 1-8 yang dimasukkan ke dalam botol BD BACTEC^TM Plus Aerobic/F Culture Vials (Tabel 3.2).

Tabel 3.2. Perlakuan yang diberikan pada botol BD BACTEC^TMPlus Aerobic/F Culture Vials setelah pengenceran serial.

Densitas

Selanjutnya, pada tiap botol (botol 1-8) diberi perlakuan seperti terlihat pada alur kerja penelitian (Gambar 3). Botol BD BACTEC^TM Plus Aerobic/F Culture Vials diinkubasi dengan menggunakan alat BD BACTEC^TM 9050 selama 24 jam.

Pada Gambar 3 terlihat bahwa pada tiap botol BD BACTEC^TM Plus Aerobic/F Culture Vials, saat sebelum inkubasi dan pasca-inkubasi 24 jam, diberi perlakuan berupa pewarnaan Gram; diinokulasikan pada media agar darah domba yang diinkubasi pada suhu 35-37⁰C dengan kadar CO2 5% selama 24 jam untuk diamati ada atau tidak adanya pertumbuhan bakteri dengan karakteristik koloni kecil, berwarna keabu-abuan, mukoid, tepi rata, bagian tengah cekung, dan memiliki aktivitas hemolisis α; serta diambil 1 ml suspensi dari tiap botol sebagai bahan PCR menggunakan primer psaA. Bila dijumpai pertumbuhan bakteri pada media agar darah domba dengan karakteristik koloni bakteri seperti yang disebutkan di atas,

maka dilanjutkan dengan uji katalase. Pada uji katalase dengan hasil negatif dilanjutkan dengan uji sensitivitas terhadap optochin.

Identifikasi Streptococcus pneumoniae ditegakkan berdasarkan hasil pewarnaan Gram berupa bakteri positif Gram dengan morfologi diplokokus atau kokus berantai pendek, disertai dengan adanya pertumbuhan bakteri pada media agar darah domba yang diinkubasi pada suhu 35-37⁰C dengan kadar CO2 5% selama 24 jam dengan karakteristik koloni kecil, berwarna keabu-abuan, mukoid, tepi rata, bagian tengah cekung, dan memiliki aktivitas hemolisis α; uji katalase negatif;

sensitif terhadap optochin. Uji PCR untuk keseluruhan sampel sebelum inkubasi maupun setelah inkubasi 24 jam dilakukan masing-masing sebanyak 1 kali. Uji PCR untuk gen psaA Streptococcus pneumoniae dinyatakan “positif” bila pada elektroforesis ditemukan amplikon dengan berat molekul 838 pasang basa.⁸ Baik untuk biakan maupun PCR dinyatakan “mampu mendeteksi Streptococcus pneumoniae” bila didapatkan > 60% dari 20 replicate yang memberikan hasil positif.

Hasil yang diperoleh akan digunakan untuk menentukan batas kemampuan tehnik PCR gen psaA mendeteksi Streptococcus pneumoniae yang dinyatakan dalam jumlah awal bakteri dalam inokulum yang dapat dideteksi sebelum inkubasi dan setelah inkubasi 24 jam.

3.5.3.1 Alur kerja penelitian

3.5.4 Pembuatan media agar darah domba

Media agar darah domba dibuat dengan mencampurkan 10 ml bubuk Tryptone Soya Agar (TSA, Oxoid^®, katalog nomor CM0131) ke dalam 250 ml air destilasi dalam labu Erlenmeyer (ukuran 250 ml). Suspensi ini dipanaskan dalam

Gambar 3. Alur kerja penelitian.

Keterangan:

*) Bila tidak segera dilakukan PCR, bahan pemeriksaan ini dapat disimpan di freezer dengan suhu -20⁰C atau -80⁰C.

**) Karakterisitik koloni bakteri: kecil, keabu-abuan, mukoid, tepi rata, bagian tengah cekung, aktivitas hemolisis α

PCR: polymerase chain reaction

microwave hingga larut sempurna. Suspensi yang sudah larut ini kemudian dilakukan autoklaf pada suhu 121⁰C selama 15 menit. Setelah proses autoklaf selesai, labu Erlenmeyer ini didinginkan di dalam water bath pada suhu 56⁰C hingga suhu water bath konstan. Larutan kemudian dicampurkan dengan 5% darah domba (12,5 ml darah domba) dan dihomogenkan. Larutan ini siap dituangkan ke dalam cawan petri (steril). Media yang sudah berada di dalam cawan petri ini dibiarkan di dalam laminar flow cabinet hingga mengeras, lalu dapat disimpan di dalam refrigerator.

3.5.5 Persiapan suspensi Streptococcus pneumoniae dengan pengenceran serial

Suspensi bakteri dibuat dengan mencampurkan 10 ml NaCl 0,9% steril dengan koloni bakteri Streptococcus pneumoniae yang diambil dengan sengkelit steril pada bagian puncak koloni bakteri. Kekeruhan suspensi bakteri ini diatur hingga sesuai dengan standar kekeruhan 4 McFarland yang ekuivalen dengan densitas bakteri sebanyak 12 x 10⁸ organisme/ml. Kekeruhan suspensi bakteri 4 McFarland ini diukur dengan menggunakan alat densicheck yang sudah dikalibrasi dengan densicheck^TM calibration standard dari BioMerieux. Alat ini mampu mengukur kekeruhan suspensi bakteri 0-4 McFarland. Tabung yang berisi suspensi bakteri 4 McFarland dinamakan tabung 1. Selanjutnya dari suspensi bakteri 4 McFarland ini dilakukan pengenceran serial dengan ketentuan yang dapat dilihat pada Tabel 1. Pada persiapan ini diperlukan alat berupa tabung steril (ukuran 12 ml), sengkelit steril, spuit steril (ukuran 10 ml), alat densicheck. Bahan yang diperlukan adalah NaCl 0,9% steril, bakteri kontrol Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 yang ditumbuhkan media agar darah domba yang diinkubasi pada suhu 35-37⁰C dengan kadar CO2 5% selama 24 jam.

3.5.6 Uji katalase

Katalase adalah enzim yang memecah hidrogen peroksida (H2O2) menjadi H2O dan O2. Uji katalase positif ditunjukkan dengan terbentuknya gelembung-gelembung gas yang menandakan adanya O2. Uji katalase dapat digunakan untuk membedakan genus Streptococcus dengan Staphylococcus. Organisme dengan

spesies yang termasuk dalam genus Staphylococcus merupakan katalase positif, sedangkan genus Streptococcus dan Enterococcus merupakan katalase negatif.¹⁴

Uji katalase yang sering dilakukan adalah dengan slide method. Pada uji ini diambil bagian tengah dari satu koloni murni bakteri berusia 24 jam yang tumbuh di media agar darah domba dengan ujung dari swab stick yang sudah dipotong menjadi lebih pendek dan diletakkan di atas kaca objek yang bersih. Larutan H2O2

30% kemudian diteteskan 1 tetes di atas kaca objek tersebut. Hasil dari uji katalase dapat terlihat setelah beberapa saat. Uji katalase dikatakan positif bila terbentuk gelembung-gelembung gas setelah beberapa saat tersebut. Jika tidak terbentuk gelembung, maka uji katalase dikatakan negatif.¹⁶

3.5.7 Uji sensitivitas optochin

Pemeriksaan ini dapat membedakan pneumokokus dengan spesies Streptococcus lainnya yang juga mempunyai aktivitas hemolisis α (misalnya:

Streptococcus viridans), karena pneumokokus umumnya sensitif terhadap optochin (ethylhydrocupreine hydrochloride). Cakram optochin sering disebut dengan “P disks”.^15,16

Bahan pemeriksaan ini adalah satu koloni murni bakteri berusia 24 jam yang tumbuh di media agar darah domba, media agar darah domba, dan cakram optochin (Oxoid^®, katalog nomor DD0001) berdiameter 6 mm yang berisi 5 µg optochin.

Satu koloni murni diinokulasikan pada media agar darah domba, lalu cakram optochin diletakkan di bagian tengah media atau daerah dengan inokulum padat, menggunakan pinset steril. Media tersebut selanjutnya diinkubasi pada suhu 35-37⁰C selama 24 jam, dengan kadar CO2 5%. Diameter zona inhibisi yang terbentuk di sekitar cakram setelah inkubasi 24 jam diukur dengan jangka sorong. Zona inhibisi yang terbentuk dengan diameter ≥ 14 mm dikatakan sebagai sensitif terhadap optochin dan dapat diidentifikasikan sebagai pneumokokus. Zona inhibisi yang terbentuk dengan diameter < 14 mm dikatakan sebagai resisten terhadap optochin, yang dieksklusi pada penelitian ini.^15,16

3.5.8 Biakan pada media biakan (BD BACTEC^TM Plus Aerobic/F Medium) 3.5.8.1 Prinsip

Bila mikroorganisme terdapat dalam bahan pemeriksaan yang diinokulasi dalam botol/vial BD BACTEC^TM Plus Aerobic/F Medium, maka CO2 akan dihasilkan saat terjadi metabolisme substrat yang ada di vial oleh organisme tersebut. CO2 akan bereaksi dengan substansi kimia yang bersifat fluoresens dan merupakan sensor pada vial. Peningkatan fuoresensi yang disebabkan oleh tingginya jumlah CO2, akan terdeteksi oleh fotodetektor pada alat. Sinyal ini kemudian akan dikirimkan ke komputer pada alat, sehingga akan dianalisis sebagai hasil positif. Hasil positif ini akan terlihat berupa lampu indikator pada tempat vial berada akan menyala dan juga adanya bunyi alarm.

3.5.8.2 Alat

Alat yang dipakai adalah spuit steril (ukuran 10 ml), alcohol swab, alat BD BACTEC^TM 9050, botol/vial BD BACTEC^TM Plus Aerobic/F Medium.

3.5.8.3 Bahan

Bahan yang digunakan adalah suspensi bakteri Streptococcus pneumoniae dengan standar kekeruhan 4 McFarland yang ekuivalen dengan densitas bakteri sebanyak 12 x 10⁸ organisme/ml. Kekeruhan suspensi bakteri 4 McFarland ini diukur dengan menggunakan alat densicheck yang dikalibrasi dengan densicheck^TM calibration standard dari Biomerieux. Selanjutnya dari suspensi bakteri 4 McFarland ini dilakukan pengenceran secara serial sesuai ketentuan yang dapat dilihat pada Tabel 3.1.

3.5.8.4 Cara kerja

Setelah dilakukan pengenceran serial, dari tiap tabung tersebut (tabung 1-8) diambil 0,5 ml suspensi bakteri yang selanjutnya bersama dengan 9,5 ml NaCl 0,9%, dimasukkan ke dalam botol media biakan (BD BACTEC^TM Plus Aerobic/F Medium) yang berisi 30 ml larutan di dalamnya lalu dihomogenkan. Dengan demikian, dinamakan botol 1-8 sesuai suspensi bakteri dari tabung 1-8 yang dimasukkan ke dalam botol BD BACTEC^TM Plus Aerobic/F Medium (Tabel 3.2).

Botol BD BACTEC^TM Plus Aerobic/F Medium diinkubasikan pada alat BD BACTEC^TM 9050 selama 24 jam.

Pada tiap botol BD BACTEC^TM Plus Aerobic/F Culture Vials, saat sebelum inkubasi dan pasca-inkubasi 24 jam, diberi perlakuan berupa pewarnaan Gram;

diinokulasikan pada media agar darah domba yang diinkubasi pada suhu 35-37⁰C dengan kadar CO2 5% selama 24 jam untuk diamati ada atau tidak adanya pertumbuhan bakteri dengan karakteristik koloni kecil, berwarna keabu-abuan, mukoid, tepi rata, bagian tengah cekung, dan memiliki aktivitas hemolisis α; serta diambil 1 ml suspensi dari tiap botol sebagai bahan PCR menggunakan primer psaA.

3.5.9 Validasi volume DNA template yang dipakai untuk uji PCR psaA 3.5.9.1 Tujuan

Validasi ini bertujuan untuk menentukan volume DNA template yang optimal untuk digunakan dalam campuran PCR sebagai reagen PCR, agar visualisasi dari produk amplifikasi PCR dengan elektroforesis gel (berupa pita DNA spesifik yang telah diamplifikasi) menjadi lebih jelas.

3.5.9.2 Alat

Alat yang dipakai adalah tabung mikrosentrifus (ukuran 1,5 ml), sentrifus, freezer (suhu -20⁰C), pipet semiotomatik (ukuran 0,5-10 µL, 2-20 µL, 10-100 µL, 100-1000 µL) dengan tip pipet (steril) yang sesuai, vortex mixer, thermoblock (suhu 4⁰C), laminar flow cabinet (ESCO^® laminar flow cabinet), Applied Biosystems PCR GeneAmp PCR Systems 9700 thermocycler, cetakan gel agarosa, labu Erlenmeyer (ukuran 250 ml), microwave, tangki elektroforesis (Bio Rad^® Wide Mini Sub (R) Cell GT), power supply, imaging gel documentation (Bio Rad^® Gel Doc XR System), dan tabung PCR (ukuran 0,2 ml).

3.5.9.3 Bahan

Bahan yang digunakan dalam campuran PCR sebagai reagen PCR adalah hasil ekstraksi DNA (sebagai DNA template), GoTaq^® Green Master Mix (Promega^®), primer psaA (primer psaA forward dan reverse) dengan konsentrasi

40 µM, nuclease-free water (ddH2O), bubuk agarosa (Vivantis^®), bufer TBE 1x, GelRed^™ Nucleic Acid Gel Stain 0,5 ml (Biotium^™), dan VC 100 bp Plus DNA ladder 50 µg (Vivantis^®).

3.5.9.4 Cara kerja

Hasil ekstraksi DNA diamplifikasi dengan tehnik PCR konvensional menggunakan primer psaA (forward primer dan reverse primer). Campuran PCR (master mix 1x) terdiri dari GoTaq^® Green Master Mix, primer psaA (forward primer dan reverse primer), ddH2O, dan DNA template. Volume campuran PCR yang digunakan adalah 25 µl. Proses pembuatan master mix PCR dilakukan dengan menggunakan thermoblock (suhu 4⁰C).

Pada awalnya digunakan volume DNA template 2 µl pada campuran PCR.

Komposisi campuran PCR yang digunakan adalah GoTaq^® Green Master Mix 10 µL, forward primer psaA 0,25 µL, reverse primer psaA 0,25 µL, ddH2O 12,5 ml, dan DNA template 2 µl. Pada tabung kontrol positif dimasukkan 2 µl DNA template dari bakteri kontrol S.pneumoniae ATCC 49619, sedangkan pada tabung kontrol negatif dimasukkan 2 µl ddH2O. Campuran PCR tersebut kemudian dilakukan sentrifugasi (spin down) untuk homogenisasi campuran PCR. Amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan alat Applied Biosystems PCR GeneAmp^® PCR Systems 9700 thermocycler untuk 30 siklus. Alat ini dijalankan dengan program seperti tertera pada Tabel 3.3. Produk amplifikasi (amplikon) DNA selanjutnya dianalisis dengan elektroforesis gel, dengan hasil berupa pita DNA yang spesifik divisualisasikan dengan gel documentation system. Pada uji PCR gen psaA ini dikatakan “positif” bila pada elektroforesis ditemukan amplikon dengan berat molekul 838 pasang basa. Pada visualisasi hasil elektroforesis produk PCR dengan menggunakan volume DNA template 2 µL, dilihat apakah pita DNA yang menunjukkan amplikon dengan berat molekul 838 pasang basa, terlihat cukup jelas.

Bila pita DNA tersebut terlihat kurang jelas, dicoba dengan menggunakan volume DNA template 5 µL pada campuran PCR.

Bila menggunakan volume DNA template 5 µL, komposisi campuran PCR yang digunakan adalah GoTaq^® Green Master Mix 10 µL, forward primer psaA 0,25 µL, reverse primer psaA 0,25 µL, ddH2O 9,5 ml, dan DNA template 5 µl. Pada

tabung kontrol positif dimasukkan 5 µl DNA template dari bakteri kontrol S.pneumoniae ATCC 49619, sedangkan pada tabung kontrol negatif dimasukkan 5 µl ddH2O. Proses selanjutnya yang dilakukan adalah sama seperti di atas. Bila dengan menggunakan volume DNA template 5 µL pada campuran PCR, visualisasi hasil elektroforesis produk PCR tampak lebih jelas dibandingkan dengan menggunakan volume DNA template 2 µL, maka untuk selanjutnya volume DNA template 5 µL ini divalidasi untuk uji PCR psaA pada sampel lainnya.

3.5.10 Ekstraksi DNA

Prosedur ekstraksi DNA dilakukan dengan menggunakan High Pure PCR Template Preparation Kit dari Roche^®. Elution buffer dihangatkan hingga suhu 70⁰C sebelum prosedur dimulai. Proteinase K dilarutkan dalam 4,5 ml nuclease-free water (ddH2O), lalu dibuat beberapa aliquot sesuai kebutuhan pemakaian.

Aliquot larutan proteinase K yang belum dipakai disimpan dalam freezer dengan suhu (-15)-(-25)⁰C. Inhibitor removal buffer, sebelum digunakan, ditambahkan dengan 20 ml etanol absolut, lalu diberi label dan tanggal penambahan etanol absolut pada botol tersebut. Wash buffer, sebelum digunakan, ditambahkan 80 ml etanol absolut, lalu diberi label dan tanggal penambahan etanol absolut pada botol tersebut. Inhibitor removal buffer dan wash buffer yang sudah ditambahkan dengan etanol absolut dapat disimpan pada suhu 15-25⁰C.²³

Sampel sebanyak 1 ml dalam tabung mikrosentrifus steril (ukuran 1,5 ml) disentrifugasi dengan kecepatan 13000 g selama 5 menit. Supernatan dibuang.

Endapan disuspensikan dalam 1 ml PBS, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13000 g selama 5 menit. Supernatan dibuang, lalu endapan disuspensikan dalam 200 µL PBS. Suspensi ini ditambahkan 5 µL lysozyme (10 mg/ml dalam 10 mM Tris-HCl, pH 8) dan diinkubasi dalam penangas air selama 15 menit pada suhu 37⁰C. Selanjutnya, suspensi sampel tersebut ditambahkan 200 µL binding buffer dan 40 µL proteinase K, lalu dicampur segera dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 70⁰C. Suspensi sampel kemudian ditambahkan 100 µL isopropanol dan dihomogenkan. Satu high pure filter tube dipasang pada 1 tabung pengumpul.

Pipetkan suspensi sampel ke dalam bagian atas buffer reservoir dari filter tube.

High pure filter tube dimasukkan ke dalam sentrifus, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 8000 g selama 1 menit.²³

Filter tube setelah disentrifugasi dipisahkan dari tabung pengumpul. Flow through kemudian dibuang bersama dengan tabung pengumpul tersebut.

Selanjutnya, filter tube dipasang dengan tabung pengumpul yang baru, lalu 500 µL inhibitor removal buffer ditambahkan ke bagian atas reservoir dari filter tube dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 g selama 1 menit. Filter tube dipisahkan dari tabung pengumpul. Flow through kemudian dibuang bersama dengan tabung pengumpul tersebut.²³

Selanjutnya, filter tube dipasang dengan tabung pengumpul yang baru, lalu 500 µL wash buffer ditambahkan ke bagian atas reservoir dari filter tube dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 g selama 1 menit. Filter tube dipisahkan dari tabung pengumpul. Flow through kemudian dibuang bersama dengan tabung pengumpul tersebut.²³

Selanjutnya, filter tube dipasang dengan tabung pengumpul yang baru, lalu 500 µL wash buffer ditambahkan ke bagian atas reservoir dari filter tube dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 g selama 1 menit. Flow through kemudian dibuang.²³

Selanjutnya, High Pure disentrifugasi dengan kecepatan 13000 g selama 10 detik. Tabung pengumpul kemudian dibuang. Filter tube dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifus steril baru berukuran 1,5 ml, lalu ditambahkan 200 µL elution buffer yang sudah dihangatkan (suhu 70⁰C) sebelumnya ke bagian atas reservoir dari filter tube. Tabung tersebut kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8000 g selama 1 menit. Tabung yang sudah disentrifugasi ini akan berisi DNA yang sudah dielusi. Bila DNA yang sudah dielusi ini tidak segera digunakan untuk pemeriksaan, maka dapat disimpan pada suhu 2-8⁰C atau -15⁰C hingga -25⁰C.²³

Penelitian ini menggunakan alat Thermo Scientific NanoDrop™ ND-1000 Spectrophotometer untuk mengukur kadar DNA hasil ekstraksi. Alat ini mempunyai kemampuan batas deteksi 2 - 3700 ng/µL untuk double-stranded DNA (dsDNA). Perhitungan konsentrasi/kadar asam nukleat pada alat ini menggunakan modifikasi hukum Beer-Lambert dengan persamaan sebagai berikut: c = (A * ε)/b;

dengan c adalah konsentrasi/kadar asam nukleat (ng/µL), A adalah absorbansi (AU), ε adalah wavelength-dependent extinction coefficient (ng-cm/µL), dan b adalah path length (cm). Nilai ε untuk dsDNA pada alat ini digunakan 50 ng-cm/µL.

Nilai b yang digunakan adalah 1 mm (0,1 cm). Nilai A diperoleh dari hasil pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 260 nm.^24,25

3.5.11 Amplifikasi DNA dengan tehnik PCR

Hasil ekstraksi DNA diamplifikasi dengan tehnik PCR konvensional menggunakan primer psaA. Sekuens primer yang digunakan untuk memperbanyak psaA adalah [5’CTTTCTGCAATCATTCTTG3’] sebagai forward primer dan [3’GCCTTCTTTACCTTGTTCTGC5’] sebagai reverse primer. Campuran PCR (master mix 1x) terdiri dari GoTaq^® Green Master Mix, primer psaA (forward primer dan reverse primer), ddH2O, dan DNA template. Volume campuran PCR yang digunakan adalah 25 µL. Volume DNA template yang digunakan pada campuran PCR sesuai dengan hasil validasi volume DNA template pada uji PCR psaA.

GoTaq^® Green Master Mix mempunyai komposisi berupa Taq DNA polymerase, dATP, dGTP, dCTP, dTTP, MgCl2, dan bufer. Proses pembuatan master mix PCR dilakukan dengan menggunakan thermoblock (suhu 4⁰C).

Amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan alat Applied Biosystems PCR GeneAmp^® PCR Systems 9700 thermocycler untuk 30 siklus. Alat ini dijalankan dengan program seperti tertera pada Tabel 3.3.

Tabel 3.3. Tahapan amplifikasi DNA dalam thermocycler.⁷

Tahapan dalam 1 siklus Waktu Suhu

Tahap 1 Hold (dibiarkan tanpa batas waktu) 25⁰C

Bila proses PCR sudah selesai, maka tabung PCR yang sudah berisi amplikon PCR dapat diangkat dari alat thermocycler. Uji PCR untuk keseluruhan sampel sebelum inkubasi maupun setelah inkubasi 24 jam dilakukan masing-masing sebanyak 1 kali pada penelitian ini. Proses selanjutnya adalah elektroforesis gel. Bila proses elektroforesis gel ini ditunda, maka amplikon PCR ini dapat disimpan pada suhu 4⁰C.

3.5.12 Elektroforesis gel

Produk amplifikasi (amplikon) dari PCR dianalisis dengan menggunakan elektroforesis gel yang akan memberikan visualisasi dari segmen DNA yang diamplifikasi dan menentukan spesifisitasnya. Elektroforesis adalah tehnik untuk

Produk amplifikasi (amplikon) dari PCR dianalisis dengan menggunakan elektroforesis gel yang akan memberikan visualisasi dari segmen DNA yang diamplifikasi dan menentukan spesifisitasnya. Elektroforesis adalah tehnik untuk