Characterization of Vector DNA Microsatellite Dengue Hemorragic08052017092447

I

i

I

rir

Uniuerritor Lompung,

Diduhur:g

oleh:

FAKULTAS MATEMATIKA DAN

L.,

ALAM

*

.*;;12

6C

oo

o

)

,^{,

#

s

I

i

c

o

{)

0

i

c

I

.a;. rF

%

o

t

8.

ETAHUAN

.

UNIVERSITAS LAMPUNG

to-t2Mei20t3

e

*

{

t

aaa

.:.:dj.FEl

omh

:lue

,

t{

*

ll ,- _"-. '1, .

@

PH

E

NOM

/

alytical

t

D

{

,-!

\_7

"'J

,

t

l

C _s

d

o

o

o l*

,..j

. )a _o

1,G

o

s

[o]

il ov'

lJ n'

c"_:

v\

dll

o

o'

c

o

o

o

f^\

o

l'1

"oJ

e

"o

cr-\

i )"

s

o

o

o

c

A^^

li{

il

o

o

oo Oa\

q^r

a,o

o

PROSIDING

SEMINAR DAN

RAPAT

TAHUNAN

Bidang

MIPA BKs PTN

wilayah

Barat

Tahun

zo1.s

Bandar Lampung,

10

- lZ

Mei

ZtI13

ISBN

97

8_602 _95559

-2

-O

Dewan Penyunting

Warsito

Sutopo Hadi Tati

Suhartati

Simon

Sembiring

Mulyono

Muslim Ansori

Mustofa Usman

Kurnia Muludi

Endang

Linirin

W

Sumardi Buhani

Suripto

Dwi Yuwono

fani

Master

Sugeng Sutiarso

Abdurrahman

Nismah

Nukmal

Penyunting

Pelaksana

Heri

Satria

Kamisah D Pandiangan EIIy Lestari

Febriandi

Hasibuan

Rifqi Alrnusawi

R

Diterbitkan

oleh

FMIpA

Universitas lampung

Bandar Lampung

Penyunting: Warsito dkk.

rsBN 978-602_9855

9 _2^O

Cetakan

Pertama, Tahun Z0L3

@copyright

FMIPA

Unila

'..{ItN,

DAFTAR ISI

Halaman

KATA

PENGANTAR

DAFTAR

ISI

i

ii

COOKIES

IKAN

GABUS SEBAGAI

MAKANAN

TAMBAHAN

UNTUK IBU HAMIL

TRIMESTER

II

Arfi1,anti

FORTTFIKASI

COOKIES

DAGING

SAPI

DENGAN

BAHAN

MAKANAN

SUMBER

GIZI

UNTUK

IBU

HAMIL

TRIMESTER

II

Arfiyanti

POTENSI

CEPHALOPODA SEBAGAI

BIOMATERIAL

BARU

Abdil

Razak*

FAKTOR IMUNOMODULATOR KELENJAR

SALIVA

ANOPHELES

SUNDAICUS

SEBAGAI

TARGET

POTENSIAL

DALAM

PEMBUATAN

TRANSMISSION

BLOCKING

VACCINE

(TBV)

MELAWAN MALARIA

Actria/ , Zulkarnain Edwardt, Suci Lestari2

KEANEKARAGAMAN

PEKANtsARU,

RIAU

Ahmad Muhantnrud

FLORA

DAN

FAI.INA

DI

KOTA

HUBUNGAN

ANTARA VALIDITAS BUTIR,

RELIABILITAS,

TINGKAT

KESUKARAN

DAN DAYA

PEMBEDA

SOAL

UJIAN

SEMESTER GENAP

BIDANG

STUDI BIOLOGI

KELAS

XI

SMA/MA

NEGEzu

DI

KOTA PADANG TAHLIN PELAJARAN

2O1,u2O1,I* '

Anizam Zein**, Mulryiatul Fadillah**, Rahnta Novianti***

ANALISIS KESINAMBLINGAN MATERI BIOLOGI

PADA

BUKU

SEKOLAH ELEKTRONIK (BSE)

JENJANG

SD, SMP,

DAN

SMA.

SEBUAH

STUDI DESKRIPTIF

KUALITATIF.

Apriliana Laily Fitri, Binta S.K.A. Sasongko, Eka P. Azrai

PENGARUH

MODEL

PEMBELAJARAN

AzuAS

DENGAN

PENDEKATAN

CTL

TERHADAP

HASIL

BELAJAR

BIOLOGI

SISWA

KELAS

VII

SMPN

1

PADANG

Arcli.), Ramadhon Smnarmin*), Friska Ellen-.)

KEARIFAN

LOKAL

PENGGLTNAAN

TUMBUHAN OBAT

OLEH

SUKU LEMBAK

DELAPAN

DI

KABUPATEN

BENGKULU

TENGAI{,

BENGKULU

Ariefo Prinmir Yani / FKIP Ltniversitas Bengkulu

1-8

9-16

t7-20

21-30

31-38

39-48

49-62

63-70

71.-74

PENGARUH

PEMBERIAN FTINGI

MIKORIZA

MULTISPORA

TE,RHADAP PRODUKSI

TANAMAN

JAGLING (ZEA

MAYSL.)

Gustina Indriati. ; Liza lrda Ningsih. ; Rizki.

IMPOTANCE

VALUE

OF

GROLIND VEGETATION

AT

TWO

RUBBER

PLANTATIONS,

TNDRALAYA.

SOUTH

SUMATERAERROR!

BOOKMARK

NOT DEFINED.

Han{a Marisa & Salni

KONSERVASI INDIGENOUS

SPECIE,S

EKOSISTEM

HUTAN

RAWA GAMBUT RIAU

Haris Gtmmranl , Alunad Muhammadt, Ntu'ul Qomar2

SCREENINC OF

BIOSURFACTANT

PRODUCING

HYDROCARBONOCLASTIC BACTERIA AS

A

BIOREMEDIATION

AGENT

OF PETROLEUM

CONTAMINATED ENVIRONMENT

Hary Widjajanti, Muharni. dan

Mi{at

CHARACTERIZATION

OF

VECTOR

DNA

MICROSATELLITE

DENGUE

HEMORRAGIC

FEVER (DHF)

AEDES AEGYPTI WITH

ENzuCHMENT METHOD

Hasmiwatit, Djong Hon Tjongz dan Dessl' Arisanty 3

PENGGUNAAN

BIJI ASAM JAWA

(TAMARINDUS

INDICA

L.)

DAN

BIJI KECIPIR

(PSOPHOCAfuPUS TETRAGONOLOBUS

L.)

SEBAGAI

KOAGULAN

ALAMI DALAM

PERBAIKAN

KUALITAS

AIR

TANAH

Hendrav,ati'. Delsy Syamsumarsih t. Nm'hasni I

HISTOLOGI

ULAS

VAGINA

DAN WAKTU

SIKLUS ESTRUS

MASA

SUBUR

MENCIT BETINA

SETELAH

PEN4BE,RIAN EKSTRAK

RIMPANG

RUMPUT TE,KI

Drs. Hendri Busman, h[.Biomed

HASIL

LOKAL

323-328

329-332

333-338

339-346

347-356

357-370

371-376

377-380

381-388

HIBzuD

F1

KACANG

HIJAU (''IGNA

RADIATA

L.

PERSILANGAN

VARIETAS

KENARI

X

KULTIVAR

KAMPAR

'Hermarr, tDewi Inclritani Roslim ctan 2ZttlkiTi

)

KOMUNITAS

BULU BABI

(ECHONOIDEA)

DI

PULAU

CINGKUAK. PULAU SIKUAI DAN PULAU SETAN

SUMATERA

BARAT

Indra Junaidi Zakaria

DESAIN

DAN

PENGAYAAN

KANDANG

DALAM

UPAYA

KONSERVASI

EX-SITU

TARSIUS

BANCANUS SALTATOR

DI

GLTNUNG

TAJAM,

PULAU BELITLTNG Indra Yttstian & Nadya B. Silva Lestari

VI

Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013

Characterization

of vector

DNA

microsatellite

Dengue

Hemorragic

Fever

@HF)

Aecles

aegypti

rvith

Enrichment

Method

Hasmiwatir,

Djong Hon

fjong2

dan

Dessy

Arisanty

r

t

_{Parasitologt Deyision,}

nedictl

_{Facul4,, .-lndulu.s L'niversiq'. Puclung}

E ma i I : ha s tn

it

at i 6 5 _@lgma il. c o nt

2

Biolog,, Deparrement,

llathenitic

toul Scicnce Fttcultt,,

I

ndal as L'n ir e rs i t y', P atlu n

g

3

Biochemestry Deyi.sion, metlicul

Fac

_4', ;lntlctlus fhtit'crsitl',

Putkng

Latar

Belakang

Demam

berdarah

Dengue

(DBD)

merupakan

salah

satu

penyakit

yang

bermasalah

besar

di

daerah

tropik

dan

subtropik

.

Populasi nyamuk Aedes

aeg,pti

yang berasal

dari

daerah geografi berbeda

dapat

berbeda

dan

menunjukan kapasitas

vektorialnyaa atau kerentanannya terhadap

virus dengue j uga berbeda.

Pengendalian

nyamuk selama

ini

biasanya dilakukan kalau

terjadi

epidemik

DBD

di

suatu

lokasi

dengan

fogging

menggunakan insektisida.

Penggunaan

inseksida

yang terus

menerus

akan

menyebabkan

nyamuk menjadi

resisten,

jika

nyamuk

telah

resisten

maka

kemampuan

menularkannya

semakin

tinggi,

selain

itu

dengan

terjadinya pemanasan global maka akan berpengaruh

Abstrak. Penelitian

ini

bertujuan untuk mengkarakterisasi DNA mikrosateiit dari nlamuk Aedes aeg;pti dengan metode Enrichment (Pengal'aan).

DNA

diisolasi dan sc'lanjutnya dilakukan pemolongan dengan enzim restriksi secara simultan menggunakan

enzim.\lu

l.

Rsal dan Hinc

II

. Selanjutnya diligasi dengan adaptor Mlul (terdifi dari

2l

- mc'r:

5'

CTC

TTG CTT ACG CGT GGA CTA3'dan phosporilated 25-mer pada uiung 5':

I

ACA CGA GAA CGA A

TG

GCA CCT GATp 5'). Sebanyak 6 oligonukleotida bennotit rnikrosatelit

(AT)ro ,(CT)ro (GT)rq. (AC)20 (AG):o dan (GC)ro)

di

hibridisasi menggunakan membran Hybon. Fragmen hasil hibridisasi

di

elusi dan diamplihkasi

(

PCR )dengan menggunakan

primer

21-

mer.

Hasil

penelitian

ini

menunjukan produk amplifikasi

dari

DNA

elusi didapatkan fragmen

berukuran

700 bp, 610 bp, 550 bp, 490 bp dan -150

bp

y'ang

merupakan kandidat fragmen DNA yang mengandung motif mikosatelit. Dari penelitian ini

dapat disimpulkan metode pengayaan

(

enrichment) dapat menghasilkan kanclidat fragmen

DNA mikosatelit Aedes aegtpti vektor DBD di Sumatera Barat.

Key rvords: ledes aeg)pti,lsolasi, Pengayaan, Hibridisasi dan DNA Mikosatelit

PENDAHULUAN

terhadap

jumlah

populasi nyamuk sehingga

kasus

DBD

selalu

terjadi

maka salah satu

altematil'e dalam

usaha pengendaliannya

dapat dilakukan secara genetik.

Usaha

pengendalian

nyamuk,.lecle.r

ueglpli

secan

genetik adalah

dengan

mengetahui dilersitasnva.

Diversitas genelik meliputi struktur generik. aliran ren dan differensiasi

antar

dan inter populasi.

Diversitas generik dapat

dipelajari

dengan

mcnggunakan

beberapa

marker

seperti

allozim,

RAPD, RFLP

dan

DNA

mikrosatelit

(Lovin.

de Brul'n.

fiemnre.

Mori,

Epstein, Harker, Streit dan Ser erson.

2009).

DNA

Mikrosatelit

rnerupakan salah

satu

tool

(marker/penanda) molekuler

lang

dikembangkan untuk mempelajari genetika

populasi

dan

diversitas

genetik

pada

serangga dan merupakan salah

satu

marker

yang mempunyai tingkat kepercayaan

lang

tinggi

(Jarne

dan

Lagoda, 1996).

Istilah

Hasmiwati, Characterization

ofvector

DNA microsatellite Dengue Hemorragic Fever (DHF) Aedes aegypti with Enrichment Method

mikosatelit

yang sering

digunakan oleh

para peneliti

antara

lain

:

Short Tandem

Repeat

(STR) (Craig,

et

ai.

1988)

;

dan

Simple

Sequences Repeats (SSRs) (Jacob

et.al.

l99l).

Mikosatelit juga

merupakan

penanda

genetik

yang

serir,g

digunakan

untuk mempelajari system perkawinan dan

struktur

populasi

(Steffen

et

al.

1993),

pautan (linkage), pemetaan kromosom dan

analisa populasi (Silva et a/. 1999)

Penelitian tentang diversitas

genetik

Aedes

aegeti

berdasarkan

DNA

mikosatelit

telah dilakukan antara lain oleh

Huber,

Mousson, Rodhain

dan

Failloux

(1999)

yaitu

sekqen

mikrosatelit

sebagai

marker dalam studi genetik Aedes aegypti

sebagai

vektor

DBD.

Ravel,

Monteny,

Olmos,

Verdugo

dan

Cuny

(2001)

melakukan

studi awal tentang

genetika

populasi Aedes aeg,,pti

di

Mexico.

Lovin, de Bruyn, Hemme,

Mori,

Epstein, Harker,

Streit

dan

Severson

(2009)

mengenai

pengembangan

polimorfik

DNA

mikosatelit

dan

validasi serta

study populasi genetika nyamuk Aedes

aegtpti

di

Haiti.

Kemudian Paupy, Brengues, Ndiath,

ToB,

Herve

dan

Simard

(2010) menggabungkan data

morfologi

dan

DNA

mikosatelit

untuk

melihat

variabilitas

morfologi dan

genetik

Aedes

oeg;pti

di

Niakhar, Senegal.

Penanganan kasus

DBD

menjadi

lebih

komplek

di

Sumatera

Barat

karena

mobilitas

penduduk

yang

tinggi

dan

penyebaran vektomya, yang cepat melalui

transportasi

oleh

karena

itu

perlu

perancangan

primer

penanda

(marker)

genetik

berdasarkan

DNA

mikosatelit

unluk

Aedes aeg,;pti

di

Sumatera Barat

penting dilakukan,

hal

ini

akan

menjadi

dasar dalam pengendalian nyamuk vektor

DBD ini

terutama terkait dengan kebijakan

penyusunan strategi pengendalian vektor.

Tujuan Penelitian ini

adalah

mengkarakterisasi

DNA

mikrosatelit

dengan metode Enrichment (Pengayaan).

METODE

PENELITIAN

Cara

Kerja

Isolasi

DNA

n1'amuk

DNA

nyamuk disolasi menurut prosedur

([{oelzel,

1994)

y'ang

telah

dimodifikasi

oleh

Anggraini

,l 998), yaitu

CTAB

(Cet1 l

Trimetyl

ammonium Bromide) dipanaskan

pada waterbath 60 oC selama

l0

menit dan

penambahan proteinase K.

Elektoforesis

Hasil

isolasi

DNA

dicek

dengan

menggunakan

gel

elektroforesis

1.2

Yo

dalam

buffer 0,5 TBE

(Sambrook

et al,

1989). Krvantitas (Konsentrasi)

DNA

lang

didapat dengan rnembandingkanya dengan )"

DNA,

selain

itu

konsentrasi

DNA

diukur

dengan mcnggunakan nano

Drop.

Setelah

itu

sampel disimpan pada -20oC sebelum digunakan untuk proses berikutnya.

Restriksi/Pemotongan

DNA

Pemotongan

DNA

genom

(sesuai

dengan

instruksi

pemasok enzim

)

dari

DNA

genom

di

potong

dengan menggunakan enzim

Alu

I

, Rsa

I

dan Hind

ll

(Vivantis),

secara simultan. diinkubasi

pada suhu 37"C

selama 16

jam.

Hasil

pemotongan

ketiga.enzim

restriksi

dapat dicek dengan dgn menggunakan Nano drop.

Ligasi

dengan

adaptor

DNA

yang telah dipotong

selanjutnya

di

ligasi dengan

3 pg

adaptor

Mlul

(terdiri

dari

2l-mer

:

5'

CTC TTG CTT ACG CGT

CGA CTA3'

dan

phosporilated 25-mer pada ujung

5': 3'ACA

CGA

GAA

CGA A

TG

GCA CCT

GATp5').

Komposisi ligasi adalah sebagai berikut :

DNA

I

pl,

adaptor

2l-mer 0,5

pl,

adaptor

25-mer

I pl.

5x

Rapid ligation buffer 5

pl.

T4

DNA

ligase

I pl

(Promega-USA) dan nuclease free

water

hingga

total volume

50

pl,

y'ang

diinkubasi pada suhu

4'C

selama

I

malam.

Prosiding Semirata FMIPA Universitos Lampung, 2013

Amplifikasi

Amplifikasi

dilakukan

menggunakan

primer

adaptor

2l-mer.Siklus

temperature

PCR yang

di

gunakan pada penelitian ini

adalah

denaturasi

arval pada suhu

9-l"C

selama

30

detik

I

kali,

denaturasi 94oC selama 30 detik, annealing pada suhu 600C

selama

lmenit,

polimerisasi pada suhu 72

oC

selama

2

menit

dengan

35

_siklus.

polimerisasi

akhi

72"C

selama

l0

menit.

Flasil

amplifikasi

di cek

dengan elektroforesis pada gel agarose 1,50lo dalam 0,5x TBE.

Pengavaan

Nlikrosatelit

Persiapan Reagen

Oligonukleotida

yang

digunakan untuk

memperka-va

DNA

mengandung

motif

mikrosatelit adalah

:

(AT)n

(CT)n

(GT)n

(AC)n

(AG)n (GC)n (Slotman et

aI.2007),

6

Oligonukleotida

dibagi

menjadi

3

kelompok membran

mengikuti

Kusumarvaty ( I

999)

berdasarkan melting

temperature

(Tm)

dari

masing-masing

nukleotida

yang

diformulasi

oleh Sambrook et.ul. (1989) dengan rumus : Tm

=

81.5

+

16.6

log [Na+]

+0.41 (% G+C)

-600/n.

Untuk tiap

kelompok membran,

l0

pl

dari

masing-masing

nukleotida

dicampur

kemudian ditambahkan

5x

SSC

(Standar

Salin

Citrate:75

ml\4 sodium citrate

pH

7

dan

750 mM NaCl)

hingga

total

volume

1000

pl.

Campuran tersebut

diteteskan

diatas membran Hybond

N+

berukuran 0.5

cmr

(Amersham,

Arlington

Heigh.lL

US).

Kemudian membran dikering

anginkan

selama

I jam

dan

diliksatifpada

suhu 65"C selama

I

jam.

selanjutnya didedahkan pada

UV

selama

30

detik. Untuk

melepaskan

oligonukleotida

yang terikat

lemah

pada

membran-

membran

dicuci

2x menggunakan

l0

nl

butl'er hibridisasi (50%

formamide,3x SSC, 25 mM Na-fosfat, pH7

dan

5%

SDS) pada suhu

45'C

selama 48

jarn

(ganti

buffer

hibridisasi

lx

24

jam).

Selanjutnya membran disimpan dalam petri

steril

pada

suhu -20'C

hingga

saat diperlukan.

Pen ga1'aan/Enrich men

DNA

i\Iikrosatelit

Nletode

yang

digunakan

berdasarkan

Edrvard er..r1. ( 1996) dan Zane et.al. (2002)

dengan

sedikit

modifikasi.

Pengayaan

mikrosatelit

dibagi

atas

3

tabung. Setiap

tabung berisi berisi 50

pl DNA

_1'ang telah

terdenaturasi

(dimasukan

dalam

air

mendidih selama

l0

menit)

dalam

500

pl buffer hibridisasi ( 5x SSC, 25 mM natrium

phosfat

pH 7,0,05%

SDS),

2

pg 2l-mer

oligonukleotida dan

I

membran. Pengayaan

dilakukan pada

3

tabung (tabung

I

berisi

I

membran

dan

buffer

hibridisasi

tanpa

formamide, tabung

II,

I

nrembran dengan

buffer hibrisasi

dan 25oh

lbrmamide

dan

tabung

III, I

membran dengan

buffer

hiridisasi dengan

50%

formamide.

Hibridisasi pada suhu 50"C selama 48 jam

dengan menagunakan

:

"Shake

'n

Stack

oven

hibridisasi.

DNA

1'ang

terikat

atau

yang terhibridisasi pada

oligo

yang terikat pada membran dielusi pada suhu

95'C

(air

mendidih)

dan

DNA

hasil

elusi

ini

disimpan pada

-20"

C

dan

selanjutnya

diamplifikasi.

Amplifikasi

DNA Elusi

DNA hasil elusi

diamplifikasi

dengan

mc-nggunakan

primer

adaptor

2l-mer

dengan kondisi PCR : denaturasi awal pada

suhu

94oC selama

30

detik

1

kali,

denaturasi 9.loC selama 30 detik, annealing

pada

suhu 60oC

selama

I

menit,

polimerisasi pada

suhu

72'C

selama 2

menit dengan 35

siklus,

polimerisasi akhir

72oC selama

l0

menit. Hasil amplifikasi di

cek dengan elektroforesis pada gel agarose

1,5% dalam

0,5x

TBE

dengan pewarnaan

dengan

Etidium Bronrid

2

pg/100

ml.

Fragmen

DNA

yang teramplifikasi diamati dengan Geldoc selanjutnya didokumentasi.

Hasmiwati'Characterization of vector DNA microsatellite Dengue Hemorragic Fever (DHF) Aedes aegypti with Enrichment Method

HASIL

DAN DISKUSI

enzim

restriksi, karena

untuk

restriksi

diperlukan konsentrasi

DNA

yang tinggi. Isolasi

DNA

nyamukAedes

aegtpli

Pada

penelitian

ini

DNA

nyamuk

disolasi menurut prosedur

(Hoelzel,

1994)

yang telah dimodifikasi

oleh

Anggraini

,1998).

Sebanyak

100

ul

larutan

buffer

CTAB

(Cetyl

Trimetyl

ammonium

Bromide) . Hasil isolasi

DNA

dicek dengan

gel elektroforesis I

,5

Yo dalam

buffer

0,5x

TBE

(Sambrook

el

al.,

1989).

Hasil

isolasi

DNA

dapat

dilihat

pada Gambar

l.

Hasil isolasi

ini

cukup baik karena tidak kelihatan smear. Untuk mengetahui konsentrasi

DNA

dilakukan dengan menggunakan Nano Drop

hasilnya

seperti

terlihat

pada

Tabel

l.

Konsentrasi

yang

didapatkan

bervariasi

anlara

3,6

sampai

60,9

ng/pl

dengan

kemurnian 1,82 sampai 2,52.

Dari hasil

ini

dipilih

beberapa konsentrasi

DNA

yang

tinggi

untuk selanjutnya dilakukan restriksi

atau

pemotongan

dengan

menggunakan [image:8.598.306.503.151.361.2]

Tabel

I

: Konsentrasi DNA Nyamuk Aedes aegtpti dengan Nano Drop

Gambar 1. Contoh fragmen hasil Isolasi DNA

nyamukAedes aegtpti.

blank 5p 1p sB blank s7 s10 9p blank 9s 6s 5s 6p 4p 4p 4s 3s blank 3p 2p alu blank hind3 0 26,2 60,9 16,4 0 10,7 23,6 29,7 0 23,5 23,9 3,6 42,8 29 48,6 50,6 14,2 0 22,4 27 5,5 0 5,7 ng/pl ng/pl ng/pl ng/pl ng/pl ng/pl ng/pl ng/pl ng/prl ng/;rl ng/pl ng/pl ng/prl ng/pl ng/pl ng/pl ng/pl ng/pl ng/pl ng/pl ng/pl ng/pl ng/pl 0 0,525 1,219 0,328 0 0,215 0,471 0,593 0 o,47 0,478 0,072 0,856 0,58 0,973 1,012 0,284 0,001 0,448 0,541 0,11 0,001 0,114 -0,002 0,276 0,608 0,162 -0,012 0,093 0,216 0,3 -0,012 0,213 0,226 0,029 0,387 0,319 0,469 0,503 0,122 -0,006 0,213 0,263

0,1 08

-0,006 0,027 -0,1 -0,03 0,64 0,7 0,56 0,06 0,32 0,65 0,7 0,06 0,6 0,78 0,15 0,92 0,85 0,98 0,96 0,74 0,14 0,82 1,04 0,12 0,14 0,24 DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA 1,9 2,01 2,03 0,01 2,3 2,18 1,98 0,01 2,2 2,11 2,52 2,22 1,82 2,07 2,01 2,32, -0,12 2,1 2,06 1,02 -0,12 4,31 Sample ID

Nucleic Acid

Conc. Unit A260 A280

350 |

So*:.*

?0 13 f H lP A U,;l^

B&

l*:]EfF,*tKffi,#

*

260t280 2601230

[image:8.598.89.498.430.772.2]

Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013

Restriksi

atau

Pemotongan

DNA

genom

Aedes

Aegl'pti

Restriksi dilakukan

dengan

menggunakan enzim

restriksi Alu

I

,

Rsal

dan

Hind

II.

sesuai dengan y'ang dilakukan

Edr,vards et al (1996) dan Kusutnarvaty et

al

(

2005). Restriksi

ini

dilakLrkan secara

simultan,

hal ini

dilakukan

untuk menghasilkan fragmen

DNA

yang pendek

berukuran

2A0

sampai 1500

bp

,vang

bertujuan

untuk

memudahkan penempelan

adaptor

saat

dilakukan

ligasi

dengan

adaptor. Petnotongan

DNA

dengarr banl'ak

enzim

ini

menurut Zane

et

ul

(2002)

bahrva

restriksi

DNA

genom

dengan

banyak

enzim akan

dapat

meningkatkan

peluang

mendapatkan

motif

mikrosatelit

dan

mengurangi

fragrnen sisipan

yang

sama.

DNA

genom Ae,les

aeg'pti

yang telah

dipotong

dicek

dengan

elektroforesis,

secara

teori

dinyatakan bahrva

restriksi

DNA

genom akan menghasilkan fragmen

yang smear

karena banyaknya

fragmen

yang terpotong namun pada penelitian

ini

tidak

dapat ditunjukan hasilnya,

hal

ini

mungkin

disebabkan

karena

konsentrasi

DNA

hasil restriksi

sangat

kecil

sehingga

tidak

tervisualisasi

melalui

gel

elektroforesis.

untuk

ini

dilakukan dengan

menggunakan

Experion

I

kb.

hasilnya

dapat

dilihat

pada Gambar ? berikut :

Hasil

restriksi

ini

selanjutnya dilakukan ligasi dengan adaptor

Mul

(

terdiri

dari

2l

-mer

:

5'

CTC

TTG

CTT

ACC

CCT

GGA

CTA3'

dan

phosporilated

25-mer

pada

ujung

5':

3'ACA CGA GAA

CGA

A

TG

GCA CCT GATp5').

Ligasi

fragmen

DNA

Aedes

aegt'pti dengan

adaptor

Pada penelitian

ini

dilakr.rkarr dengan

menggunakan

kit

Ligation

(Promega)

prosedur

)'ang dilakukan

sesuai

dengan

)'ang

direkomendasikan

pabrik

dengan

menambahkan adaptor

MIul.

Hasil

ligasi selanjutnya

dimplifikasi

(di

PCR)

dengart

prinrer

21-

mer dan

di

cek

dengan

elektroforesis.

Hasil PCR

ini

dapat

dilihat

pada gambar

3.

Hasil

ini

menunjukan

bahrva

terdapatnya

fragmen

DNA

yang

berukuran

antara

100

sampai 1000

bp

seseuai dengan hasil restriksi. Hasil ini akan

memberi peluang penempelan mikrosatelit

pada saat dilakukan pengayaan.

Si"e

t:;uut.p

''j

=,1$-Ganrbar

2.

Hasil

Restriksi Genom Aecles

aeg,pti

-yang

dicek

dengan Experion

I

kb

I 0*ilt,t)

- 800hp

60OlrP SB0bP

d Outl6l ,Ll8trP

1S rlrrp

[image:9.600.75.540.405.822.2]

I gi-!hf1

Gambar

3.

Produk PCR

hasil Ligasi

DNA dengan adaptor IVIiul.

Ket

: M =

marker. 1, 2. 3,

4

dan

5

sampel

rryamuk Aecles aeg'tpti

ffi

$ffii^t"z

zo13 tt4t}A

U.;tr

l35L

Hasmiwati,Characterization of vector DNA microsatellite Dengue Hemorragic Fever (DHF) Aedes aegypti

with

Enrichment Method

Fragmen

DNA

genom nyamuk

Aedes

aegtpti

hasil ligasi telah menunjukan hasil sesuai dengan target

yaitu

fragmen dengan

ukuran 100

sampai

1000

bp. Hasil

ini

menunjukan

hasil yang

baik

untuk

dilanjutkan untuk dihibridasi dengan

motif

hibridisasi. Fragmen

DNA

genom nyamuk Aedes aegypti hasil ligasi telah menunjukan

hasil

sesuai dengan

target

yaitu

fragmen

dengan ukuran 100 sampai 1000

bp.

Hasil

ini

menunjukan

hasil

yang

baik

untuk

dilanjutkan untuk dihibridasi dengan

motif

mikrosatelit.

Hibridisasi

Proses

hibridisasi dilakukan

dilakukan pengayaan dengan rnenggunakan

6

macam

motif

mikrosatelit.

Motif

yang

dipakai

adalah

:

(AT)zo ,(CT)zo (GT)zo'

(AC):o

(AG)zo

dan

(GC)zo

Ke

enam

motif

mikrosatelit

ini

dikelompokkan

menjadi

3

membran berdasarkan

Tm

mengacu pada

metode Edwards

et al.

(1996)

dan

Kusumawaty

et al

(2005).

Hasil pengelompokan

ini

dapat dilihat pada Tabel 3 berikut :

T abel 2 : Pengelompokan ol i gonukleotida (moti f mikrosatel it) berdasarkan Tm

Setelah hibridisasi dilakukan proses elusi

(pencucian)

dan

dilakukan

PCR

untuk

mendapatkan

kandidat-kandidat mikrosatelit yang akan diperbanyak melalui

proses

kloning.

Proses

elusi

dilakukan

untuk

melepaskan fragmen-fragmen

DNA

yang

terikat

pada membran,

yaitu

dengan

merendam

membran

hasil

hibridisasi

dengan air mendidih selama

l0

menit. Pada

kondisi suhu

tinggi

diharapkan

DNA

sampel

yang

menempel

pada

membran

dapat lepas, selanjutnya

dilakukan

PCR.

Hibridisasi

adalah merupakan pengikatan

antara

DNA

hasil

amplifikasi yang

telah

terdenaturasi

dengan membran

nilon

hybon(Amersham,

USA)

yang

telah

mengandung

motif

mikrosatelit.

Untuk

penyiapan membran yang akan digunakan

dalam proses

hibridisasi

motif

yang digunakan adalah

motif

non label

radioaktif

pemilihan

ini

dilakukan karena lebih aman

dan murah,

jika

dibandingkan dengan yang

radioaktif. Motif

yang dilabel

raioaktif

lebih

sensitif

tapi

kurang arnan

dalam

penggLlnaannya.

Dalam

mengusahakan

pengikatan

yang

kuat

oligonukleotida

(motifl) pada

membran

dilakukan

dengan

pendedahan

dengan

sinar

Ultra

Violet. Setelah

itu

dilakukan

fiksasi

pada

oven

yang

berguna

untuk

pembentukan ikatan

kovalen antara

DNA

dan membran.

Hal ini

sesuai

yang

dinyatakan

Read

&.

Mann

(1985)

untuk

pengikatan yang kuat antara

membran

DNA

dapat

dilakukan

dengan

radiasi

UV.

Dalam

proses

hibridisasi digunakan beberapa komponen untuk buffer

hibridisasi seperti SSC, Formamid

dan

SDS. SSC

dapat

berfungsi

untuk meningkatkan efisiensi transfer yang besar,

formarnid berfungsi

untuk

menurunkan

suhu hibridisasi sedangkan SDS berfungsi untuk mencuci ikatan tidak

Si-e r 5r:lrJbrf

'l !:rucrbItr

r:i l:r l:) L' t]

$ tf !:l l:! il.

fr.rr)lflf -afrI}trp 3arrf,trF : r:r l.J lr t:.

[image:10.598.302.511.598.759.2]

l,JUt:rE!

Gambar

4.

Pengayaan kandidat-kandidat

fragmen DNA

bermotif mikrosatelit

Membr4n

I

Membran

II

Membran

III

Oligonukleotida

TM

(oc)

Oligonukleotida TI\,{ _CC) Oligonukleotida

TM

(oc)

(CT)zo 59,8 (GT)zo 64,3 (AT)zo 34.5

(AG)zo 59,8 (AC)zo 64,3

Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2 07 3

[image:11.598.91.294.111.292.2] [image:11.598.89.300.335.734.2]

KESIN,IPULAN

DAN SARAN

Gambar

5.

Pengayaan kandidat-kandidat

fragmen

DNA

bermotif mikrosatelit

Ket:610 bp dan 450 bp.

Gambar 3,

4

dan

5

rnemperlihatkan bahrva

diperkirakan

adanya

kandidat-kandidat

fragmen

DNA yang

mengandung

mikrosatelit,

hal

ini

dinyatakan oleh Zane

et.al

(2002)

bahrva

metode

Enrichment (pengal'an) adalah strategi yang baik untuk meningkatkan hasil dan mendapatkan target

yang spesifik dalam

mengisolasi penanda

mikrosatelit,

juga

dinyatakannya penggunaan

waktu yang lebih

efisien

jika

dibandingkan dengan menggunakan metode

konvensional.

Metode

konvensional

kurang

efisien

apalagi

untuk

spesies yang

mempunyai frekuensi

mikrosatelit

rendah.

Nyamuk

Aedes

aegy-pti

ditandai

dengan

kelimpahan mikrosatelit yang rendah dalam genomnya et.ol.200

Saze

t 5 CrOtarf,

Kesimpulan

Berdasarkan dari hasil

ini

dapat diambil

kesimpulan :

l.

Proses restriksi secara simultan dengan 3 macam enzim

(Alu I,

Rsal dan

Hind II)

dan

ligasi

den-lan adaptor

iMlul

untuk

genom Aetles

oeg;pti telah

berhasil

didapatkan.

2. Proses Hibridisasi dengan

membran

yang

bermotif 5

macam

motif

(CT.AC, GT.

AT

dan

AC)

dengan pengal'aan ini

didapatkan fragmen

DNA

700 bp,

610

bp,

550

bp,

490

bp

dan

450 bp

yang

diduga mengandung

motif

mikrosatelit.

Saran

Penelitian

ini

harus

dilanjutkankan

dengan proses

kloning untuk

mendapat

motif motif

mikrosatelit

dan

setelah

dilakukan

sekuensing

akan

dilakukan

perancangan

primer

DNA

mikrosatelit

berdasarkan

motif

dan akan dilakukan

uji

generalisasi

pada nyamuk Aedes aeg'pti

vektor

DBD

di

Sumatera

Barat

sehingga

akan

menghasilkan

suatu

Marker

atau Penanda Molekuler

DNA

mikrosatelit.

UCAPAN

TERII\TA

KASIH

Penulis mengucapkan

terima kasih

dan

penghargaan yang sebesar-besarnl'a kepada

HPEQ

PROJECTiPROGRAIv'I

PENINGKATAN

KUALITAS

PENDIDIKAN

DOKTER (PHKPKPD) FK

UNAND

Tahun

Anggaran

2012

atas dukungan dana untuk melakukan penelitian.

Ucapan

terima kasih

juga

disampaikan

kepada

Staf

dan

Analis

Lab

Biomedik

FKUA

dan Prot.

Dr.

sc. agr.

Ir.

Jamsari.

MP sebagai konsultan dalam penelitian ini.

DAFTAR

PUSTAICA

Anggraini, E.

1998.

Tingkat Keanekaragaman Genetik nyamuk Aetles

agtpti

dari Kotamadya Bandung Dengan

Menggunakan

Metoda

Random

S.a l.j,:t(,t:rl

8[Obil

6 fla)tr F

5'O,lrrp {OObF 3OObp : O ot,p

I DOt,t'

I r_r Lrijrltrl]

€l Cl rf tr f!

r:i (-l l) lf, li SLflfLrp .1L|O':,f) :llfta-lhl!

4'lJ rL b ltr

Ghffi-6[r'

6 Pengayaan kandidat-kandidat

fragmen

DNA

bermotif mikrosatelit

Ket : fragmen 700 bp, 550 bp dan 490 bp.

Hasmiwati' Characterization

ofvector

DNA microsatellite Dengue Hemorragic Fever

(DHfl

Aedes aegypti with Enrichment Method

Amplified

Polymorphic

DNA

RAPD)

PCR. Tesis

52

Institut

Tekhnologi Bandung.

Craig

J.,

Fowler

S.,Burgoyne

L.A.,

Scott

A.C.,

and

Harding

H.W.J.

1988

Repetitive deoxyribonucleic acid

(DNA)

and Human Genom variation ;

A

concise

review

relevant

to

forensic

biology.

J.

Forensic. Sci.

33:l

I I

l-l

126

Edwards,K.

J,

Baker

J. H.

A,

Datly

A.

Jones

C. And

Karp

A.

1996.

Microsatellite Libraries Enchired

for

Several Microsatellite

Sequences

in

Plant. Bio Tecques 20.

Hoelzel,

A.R.

1994. Moleculer

Genetic

Analysis

of

Poptlation.

A.Pratical

Aproach,

IRL.

Press.

Oxford

University

Press:71-74.

Huber

K,

Mousson

L,

Rodhain F, Failloux

A-B.1999.Microsatellite

sequences

as markers for population genetic studies

of

the

mosquito Aedes

aegtpti. Am

J

Trop Med Hyg, 6l :1001-1003.

Huber,

K.,

Mousson,

L.,

Rodhain,

F.,

Failloux,

A.B.,

2001.

Isolation

and

variability

of polymorphic microsatellite

loci

in

Aedes aegypti

the

vector

of

dengue viruses. Mol. Ecol. Notes

1,219-222.-prone spontaneously hypertensive rat. Cell 67 :657 -662 .

Jarne,

P. And

Pierre

J.L.

Lagoda.

1996.

Microsatellites

from

molecul

to

populations

and back.

Elsivier

Sci.

:

424429.

Kusumawaty,

D.

1999.

Isolasi

dan

Karakterisasi Mikrosatelit

pada

Jati

(Tectona

grandis).

Tesis

Magister

Jurusan

Biologi

Moleculer

ITB

Bandung.

Kusumawaty,

D., M.M.

Margrita.

N.R.

Arma

dan

A.

Pancoro. 2005a. Isclation

and

Characterization

Microsattelites

Locus

in

Oshronemus

gouramy.

Inteernational

Procceding

Seminars;

Asian

Science

and

Technology

Week

(7tn

ASWT):

Biotechnology

for

Suistainable

Utilization

of

Biological Resources

in

Agriculture

and

Healt ASEAN.

Lovin,

D.D.,

Washington,

K.O.,

deBruyn,

B.,

Hemme,

R.R.,

Mori,

A.,

Epstein,

S.R.,

Harker,

B.W., Streit,

T.G., Severson,

D.W.,

2009.

Genome-based

polymorphic microsatellite development

and

validation

in

the

mosquito

ledes

aeglpti

andapplication

to

population

genetics

in

Haiti. BMC

Genomics 10,

590.

Paupy Christophe

C.,

Brengues

C.

Ndiath

C, Toty

C.,

Herve JP, Simard

F.2010.

Morphological

and

genetic variability

within

Aedes

aeg)pti

and

in

Niakhar,

Senegal

Genetics

and Evolution l0

(2010)

473480.

Promega. 1999. Protocol and Application

Guide.

Edisi

ke

3

USA.

Promega

Corperation.

Silva, F.,Gusmao,

L.

and

Amorim

A.

1999.

Segregation analysis

of

tetra

and

pentanucleotide

short

tandem

repeat

polymorphism

:

deviation

from

Mendelian expectation. Electrophoresis,

20:1697-1701.

Slotman,

M.A., N.B. Kelly,

L.C. Harrington, S. Kittahawe, J. W. Jones, T.

W.

Scott,

A.

Caccone

and

J.R.

Porvell.2007. Polymorphic microsatellite

markers

for

studies

of

Aedes aegg'pti

(Diptera: Culicidae),

the

vector of

dengue

and

yellorv

fever.Molecular

Ecology Notes. 7

:

168 17

l.

Steffen,

P.,

Eggen,

A.,

Dietz,

A.B.,

Womack, J.E., Stanzinger, G.

And

fries,

R.

1993.

Issolation

and

mapping

polymorphic

microsatellites

in

catle.

Anim.

Genet.

j

Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013

Sambrook,

J., Fritscly,

EF.

And

N4aniatis,

T. 1989.

Molecular

Cloning,

Laboratory Manual. Second

Edition.

Cold

Spring Harbor

Laboratory Press.

New York.

Zane

L,

Bargelloni

L,

and Patameello T.

2002.

Strategies

for

microsatellite

isolation:

a

revierv.

Molecular

Ecology

ll:

I-16.