i INTISARI
Kejadian kanker payudara di Indonesia mencapai 13% dari total seluruh kejadian kanker. Reseptor estrogen alfa (REα) berperan dalam difusi dari estrogen yang dikaitkan dengan induksi dan pertumbuhan kanker payudara. Genistein secara in vitro diketahui memiliki aktivitas sebagai antikanker, sehingga untuk menambah informasi tentang kemampuan genistein sebagai ligan antikanker pada Reα dilakukan uji in silico terhadap REα.
Pada penelitian ini dilakukan penambatan pada luaran SPORES menggunakan PLANTS1.2. Iterasi penambatan molekul dilakukan tiga kali. Luaran berupa 1000 pose yang mempunyai skorChemPLP dan PLIF bitstring yang digunakan untuk menilai keaktifan genistein sebagai ligan dengan decision
tree pada post docking analysis yang digunakan. Pengamatan visual interaksi
genistein dengan REα dilakukan menggunakan PyMol 1.2R1.
Hasil dari penelitian ini adalah genistein merupakan ligan reseptor estrogen alfa (REα). Genistein memenuhi syarat pada decision tree, yaitu PLIF
bitstring 320 on dan skor ChemPLP yang lebih kecil dari 84,8200, yaitu
-84,9031.
ii ABSTRACT
Breast cancer incidence in Indonesia reached 13% of the total incidence of cancer. Estrogen Receptor Alpha (ERα) plays a role in the diffusion of estrogen associated with breast cancer induction and growth. Previous in vitro study showed that genistein had anticancer activity,thereforein silicostudy of genistein is needed to add information about the ability of genistein as a ligand on ERα.
In this study, the output from SPORES was docked using PLANTS1.2. Iteration of molecular docking had been done three times. The outputs are 1000 poses that haveChemPLP score and PLIF bitstring as the results. They were used to assess the activity of genistein as ligand with the decision tree that was used inpost docking analysis. Visual observation of the interaction of genistein with ERα was performed using PyMol 1.2R1.
Results from this study showed that genistein is ligand in the binding pocket of ERα. That is because genistein’s PLIF bitstring320 is on and the score ofChemPLP of genistein smaller than -84,8200, i.e., -84,9031 that is in agreement with the decision tree.
UJI IN SILICO SENYAWA GENISTEIN SEBAGAI LIGAN PADA RESEPTOR ESTROGEN ALFA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Aprilini Khaterin Johan
NIM : 128114036
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
UJI IN SILICO SENYAWA GENISTEIN SEBAGAI LIGAN PADA RESEPTOR ESTROGEN ALFA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Aprilini Khaterin Johan
NIM : 128114036
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA 2016
HALAMAN PERSEMBAHAN
“I am only one; but still I am one. I cannot do everything, but still I
can do something. I will not refuse to do something I can do.”
– Helen Keller
“ If you can’t fly then run, if you can’t run then walk, if you
can’t walk then crawl, but whatever you do you have to keep
moving
forward.”
– Martin Luther King Jr.“ I can do everything through Him who gives me strength.” – Philippians 4 : 13
“ Kamu adalah garam dunia. Jika garam itu menjadi tawar, dengan
apakah ia diasinkan? Tidak ada lagi gunanya selain dibuang dan
diinjak orang. Kamu adalah terang dunia. Kota yang terleyak di atas
gunung tidak mungkin tersembunyi. Lagipula orang tidak menyalakan
pelita lalu meletakkannya di bawah gantang, melainkan di atas kaki
dian sehingga menerangi semua orang di dalam rumah.”
PRAKATA
Puji Syukur penulis ucapkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas
berkat-Nya penyusunan skripsi yang berjudul “UJI IN SILICO SENYAWA GENISTEIN SEBAGAI LIGAN PADA RESEPTOR ESTROGEN-ALFA” dapat dilaksanakan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat
untuk meraih gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Fakultas Farmasi, Universitas
Sanata Dharma, Yogyakarta.
Selama proses penelitian dan penyusunan skripsi ini, penulis mendapatkan
banyak bantuan dan dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu penulis
3. Dita Maria Virginia, M.Sc., Apt., selaku Wakil Kepala Program Studi S1
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan
dukungan dan motivasi.
4. Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing skripsi
dan akademik yang telah memberikan masukan, pengarahan, serta
motivasi dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini.
5. Maywan Hariono, Ph.D., Apt., selaku dosen penguji skripsi yang telah
memberikan masukan dalam penyusunan skripsi ini.
6. Florentinus Dika Octa Riswanto, M. Sc., selaku dosen penguji skripsi yang
telah memberikan masukan dalam penyusunan skripsi ini.
7. Mama dan David Alfonso yang telah memberikan dukungan penuh kepada
penulis selama proses penyusunan skripsi.
8. Clara Felicia, Felicia Fraulein, Liliana, dan Karla Violeta, teman-teman
seperjuangan skripsi yang telah mendukung dan mengingatkan penulis.
9. Sahabatku, Abal, Ave, Edo, Ela, Indra, Irest, Mic, Resta, dan Rina, terima
kasih atas kebersamaan serta canda dan tawa selama pengerjaan skripsi ini.
10. Putra, Adis, Dara, Tari, dan Ike serta teman-teman pengurus Badan
Eksekutif Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas
segala kerja keras dan dukungan untuk penulis dalam menyelesaikan
skripsi ini.
11. Teman-teman FST A 2012 atas pengalaman dan kebersamaan yang
berharga selama menjalani perkulihan di Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma
12. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu atas bantuan
dalam proses penyusunan skripsi ini.
Akhir kata, penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam
penyusunan skripsi ini mengingat keterbatasan kemampuan dan pengetahuan
penulis. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun
dari semua pihak. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi pembaca.
Penulis
DAFTAR ISI
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ... 5
A. Kanker Payudara ... 5
C. Genistein ... 7
D. Uji In Silico ... 9
E. Penapisan Virtual Berbasis Struktur ... 9
F. Landasan Teori ... 13
G. Hipotesis ... 13
BAB III METODE PENELITIAN ... 14
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 14
B. Variabel Penelitian ... 14
1. Variabel penelitian ... 14
C. Definisi Operasional ... 15
1. Ligan ... 15
2. PLIF bitstring ... 15
3. Pose genistein ... 15
4. Protokol penelitian ... 15
5. Protokol post docking analysis... 15
6. PVBS ... 15
7. Senyawa Marginal ... 15
8. Senyawa yang diuji ... 15
9. Skor ChemPLP ... 15
D. Bahan dan Alat Penelitian ... 16
1. Bahan yang digunakan dalam penelitian... 16
2. Alat atau instrumen penelitian ... 16
E. Tata Cara Penelitian ... 17
1. Preparasi genistein ... 17
2. Penambatan genistein ... 17
F. Tata Cara Analisis Hasil ... 17
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 19
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 23
A. Kesimpulan... 23
B. Saran ... 23
DAFTAR PUSTAKA ... 24
BIOGRAFI PENULIS ... 26
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I. PLIF bitstring yang penting dalam decision tree ... 12
Tabel II. Data bitstring pose yang divisualisasikan ... 19
Tabel III. Skor pada PLIF bitstring penting ... 23
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Contoh ligan untuk reseptor estrogen ... 7
Gambar 2. Klasifikasi utama fitoestrogen ... 8
Gambar 3. Contoh dari Senyawa yang masuk golongan Isoflavon ... 8
Gambar 4. Decision tree yang dikembangkan oleh Istyastono ... 13
Gambar 5. Pose visulisasi genistein pada kantung ikatan REα ... 20
Gambar 6. Alur decision tree yang diperoleh berdasarkan data genistein... 21
INTISARI
Kejadian kanker payudara di Indonesia mencapai 13% dari total seluruh
kejadian kanker. Reseptor estrogen alfa (REα) berperan dalam difusi dari estrogen
yang dikaitkan dengan induksi dan pertumbuhan kanker payudara. Genistein secara in vitro diketahui memiliki aktivitas sebagai antikanker, sehingga untuk menambah informasi tentang kemampuan genistein sebagai ligan antikanker pada
REα dilakukan uji in silico terhadap REα.
Pada penelitian ini dilakukan penambatan pada luaran SPORES menggunakan PLANTS1.2. Iterasi penambatan molekul dilakukan tiga kali. Luaran berupa 1000 pose yang mempunyai skor ChemPLP dan PLIF bitstring yang digunakan untuk menilai keaktifan genistein sebagai ligan dengan decision
tree pada post docking analysis yang digunakan. Pengamatan visual interaksi genistein dengan REα dilakukan menggunakan PyMol 1.2R1.
Hasil dari penelitian ini adalah genistein merupakan ligan reseptor
estrogen alfa (REα). Genistein memenuhi syarat pada decision tree, yaitu PLIF
bitstring 320 on dan skor ChemPLP yang lebih kecil dari -84,8200, yaitu
-84,9031.
Kata kunci : Kanker payudara, REα, genistein, in silico, PLANTS1.2,
PyMOL1.2r1., skor ChemPLP, PLIF bitstring.
ABSTRACT
Breast cancer incidence in Indonesia reached 13% of the total incidence of
cancer. Estrogen Receptor Alpha (ERα) plays a role in the diffusion of estrogen
associated with breast cancer induction and growth. Previous in vitro study showed that genistein had anticancer activity, therefore in silico study of genistein is needed to add information about the ability of genistein as a ligand on ERα.
In this study, the output from SPORES was docked using PLANTS1.2. Iteration of molecular docking had been done three times. The outputs are 1000 poses that have ChemPLP score and PLIF bitstring as the results. They were used to assess the activity of genistein as ligand with the decision tree that was used in post docking analysis. Visual observation of the interaction of genistein with ERα was performed using PyMol 1.2R1.
Results from this study showed that genistein is ligand in the binding
pocket of ERα. That is because genistein’s PLIF bitstring 320 is on and the score
of ChemPLP of genistein smaller than -84,8200, i.e., -84,9031 that is in agreement with the decision tree.
Key words : Breast cancer, ERα, genistein, in silico, PLANTS1.2,
PyMOL1.2rs1., ChemPLP Scores, PLIF bitstring.
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kanker atau neoplasma merupakan suatu penyakit akibat adanya
pertumbuhan yang abnormal dari sel-sel jaringan tubuh yang mengakibatkan
invasi ke jaringan-jaringan normal. Kanker dapat menyebar pada bagian tertentu
seperti payudara. Kanker payudara (Carcinoma mammae) merupakan salah satu
jenis kanker yang mempunyai prevalensi yang cukup tinggi (Siswono, 2003).
Diperkirakan pada tahun 2012 terdapat 1,7 juta wanita didiagnosa menderita
kanker payudara (WCRF, 2015). Menurut Pusat Data dan Informasi Kementerian
Kesehatan Republik Indonesia pada tahun 2013 kejadian kanker payudara di
Indonesia mencapai sebesar 61.682 manusia.
Estrogen dikaitkan dengan induksi dan pertumbuhan kanker payudara.
Mekanisme yang tepat untuk estrogen menstimulasi proliferasi sel kanker
payudara masih belum diketahui, tetapi kemungkinan besar melibatkan
genotoksitas estrogen dan juga induksi gen yang mengatur produksi faktor
pertumbuhan, mempromosikan distroma dan sel epitel payudara serta merangsang
poliferasi. Estrogen sebagai hormon endokrin, berdifusi ke dalam jaringan
payudara dan beredar secara sistemik dengan berinteraksi dengan reseptor steroid,
khususnya reseptor estrogen alfa dan reseptor estrogen beta (REα dan REβ)
(Berry, 2008).
Genistein merupakan salah satu fitoestrogen yang dapat berinteraksi
dengan reseptor estrogen untuk menghasilkan efek estrogenik lemah atau anti-
estrogenik. Struktur kimia yang khas dari fitoestrogen adalah adanya cincin
fenolik adalah prasyarat untuk mengikat reseptor estrogen. Secara in vitro
genistein telah diketahui memiliki aktivitas untuk menghambat REα pada sel
kanker payudara (Hsieh, 1998).
Uji in silico mengenai aktivitas REα didasarkan pada metode Penapisan
Virtual Berbasis Struktur (PVBS). PVBS berdasarkan struktur tiga dimensi (3D)
target makromolekul diterapkan secara luas untuk mengidentifikasi kemungkinan
untuk mengikat target. Prinsip dari penapisan ini membutuhkan struktur dari
molekul target dan senyawa uji. Setiap senyawa uji ditambatkan secara virtual
pada molekul target melalui perangkat lunak penambatan yang memodelkan ligan
dengan target secara komputasi untuk mendapatkan sifat fisika kimia yang
optimal (Wadood, 2013).
Dalam penelitian ini, pose genistein dalam kantung ikatan REα diseleksi
menggunakan protokol penambatan virtual oleh Setiawati, Riswanto, Yuliani and
Istyastono (2014) dan protokol post docking analysis oleh Istyastono (2015).
Penelitian ini digunakan untuk memberikan tambahan informasi mengenai
genistein sebagai ligan pada REα dengan protokol yang digunakan.
1.Permasalahan
Apakah genistein bertindak sebagai ligan pada REα secara in silico
menurut protokol penambatan yang dikembangkan oleh Setiawati et al. (2014)
2.Keaslian penelitian
Adapun jurnal terkait antara lain “Retrospective Validation of a Structure-
Based Virtual Screening Protocol To Identify Ligands For Estrogen Receptor
Alpha and Its Application To Identify The Alpha-Mangostin Binding Pose” oleh
Setiawati, Riswanto, Yuliani, and Istyastono pada tahun 2014 dan “Employing
Recursive Partition and Regression Tree Method To Increase The Quality of
Structure-Based Virtual Screening In The Estrogen Receptor Alpha Ligands
Identification” oleh Istyastono pada tahun 2015. Sejauh pengetahuan peneliti,
penelitian mengenai uji in silico senyawa genistein sebagai ligan reseptor estrogen
alfa dengan protokol Setiawati, et al. (2014) dan post docking analysis oleh
Istyastono (2015) belum pernah dilakukan.
3.Manfaat Penelitian a. Manfaat teoretis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan tambahan informasi mengenai
kemampuan genistein sebagai ligan pada REα dan mengetahui pose
genistein dalam kantung ikatan REα.
b. Manfaat praktis
Penelitian ini diharapkan dapat mengaplikasikan protokol penambatan
virtual untuk penemuan obat baru.
c. Manfaat metodologis
Penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai validasi eksternal
protokol penambatan virtual oleh Setiawati et al. (2014) dan protokol post
B.Tujuan Penelitian 1.Tujuan Umum
Tujuan umum penelitian ini adalah mengetahui kemampuan
potensi senyawa genistein sebagai senyawa antikanker secara in silico.
2.Tujuan Khusus
a. Mengetahui dan menguji kemampuan protokol penambatan virtual in
silico yang telah dikembangkan oleh Setiawati et al (2014) dan
protokol post docking analysis oleh Istyastono (2015) dalam
mengenali genistein sebagai ligan pada REα.
b. Mengetahui pada tingkat molekuler pose genistein dalam kantung
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Kanker Payudara
Kanker atau neoplasma merupakan suatu penyakit akibat adanya
pertumbuhan yang abnormal dari sel-sel jaringan tubuh yang mengakibatkan
invasi ke jaringan-jaringan normal. Kanker dapat menyebar pada bagian tertentu
seperti payudara (Brunce, 2008).
Payudara terdiri dari jaringan duktural, fibrosa yang mengikat lobus-lobus,
dan jaringan lemak di dalam dan di antara lobus-lobus. Jaringan payudara 85%
terdiri dari lemak. Sedikit di bawah pusat payudara dewasa terdapat puting (papila
mamaria), tonjolan yang berpigmen dikelilingi oleh areola (Santi, 2015).
Kanker payudara (Carcinoma mammae) merupakan salah satu jenis
kanker yang mempunyai prevalensi yang cukup tinggi (Siswono, 2003).
Diperkirakan pada tahun 2012 terdapat 1,7 juta wanita didiagnosa menderita
kanker payudara (WCRF, 2015). Menurut Pusat Data dan Informasi Kementerian
Kesehatan Republik Indonesia pada tahun 2013 kejadian kanker payudara di
Indonesia mencapai sebesar 61.682 manusia.
Kanker payudara muncul sebagai akibat sel-sel yang abnormal terbentuk
pada payudara dengan kecepatan tidak terkontrol dan tidak beraturan. Sel-sel
tersebut merupakan hasil mutasi gen dengan perubahan-perubahan bentuk,
ukuran, maupun fungsinya (Santi, 2015).
B.Reseptor Estrogen
Estrogen memiliki peranan penting dalam perkembangan, diferensiasi dan
fungsi dari sistem reproduksi (Berry, 2008). Estrogen akan masuk ke dalam sel,
tetapi hanya sel yang mengandung reseptor estrogen yang akan merespon. Di
dalam tubuh terdapat dua reseptor estrogen yang dikenal, yaitu reseptor estrogen
alfa (REα) dan reseptor estrogen beta (REβ) (Beshay, 2013). Jika suatu reseptor
estrogen berikatan dengan estrogen, maka akan terjadi perubahan konformasi
reseptor yang memungkinkan terjadinya ikatan dengan koaktivator dan
mengaktifkan faktor transkripsi. Aktivasi transkripsi gen akan mengarahkan
sintesis protein tertentu yang kemudian mempengaruhi berbagai fungsi sel
tergantung macam dan targetnya (Putra, 2008). Estrogen berikatan dengan
reseptor estrogen (RE) membentuk kompleks aktif dan mempengaruhi transkripsi
gen yang mengatur proliferasi sel (Gibbs, 2000).
Salah satu titik tangkap pengobatan kanker khususnya kanker payudara
adalah dengan menghambat aktivitas estrogen pada reseptor estrogen alfa (REα).
Pada kasus kanker payudara, REα berikatan dengan estrogen dan berpoliferasi
secara abnormal (Putra, 2008).
REα memiliki tiga tempat ikatan spesifik, yaitu terhadap ligan yang
disebut ligand binding domain (AF-2), terhadap growth factor (AF-1), dan
terhadap DNA (DNA-binding domain). Ligan yang mengikat reseptor estrogen
dan berkompetisi dengan estrogen disebut Selective Estrogen Receptor
Modulators (SERMs). Senyawa SERMs dapat bertindak sebagai antagonis
disebabkan karena pada jaringan yang berbeda, REα memiliki konformasi yang
berbeda. (Putra, 2008). REα merupakan protein dengan berat 66kDa dengan asam
-asam amino pada kantung ikatannya antara lain MET 343, LEU 346, LEU 349,
ALA 350, GLU 353, TRP 383, LEU 384, LEU 387, MET 388, LEU 391,
ARG 394, PHE 404, MET 421, ILE 424, PHE 425, LEU 428, HIS 524, LEU 525,
dan GLY 529 (Mustarichie, 2014). Gambar 1 di bawah ini menunjukkan contoh
dari beberapa ligan untuk reseptor estrogen.
Gambar 1. Contoh ligan untuk reseptor estrogen (Berry, 2008)
C.Genistein
Fitoestrogen merupakan suatu senyawa yang bersifat estrogenik yang
lignan. Isoflavonoid dibagi menjadi tiga kelompok yaitu isoflavon, isoflavan, dan
coumestan. Genistein dan daidzein merupakan contoh isoflavon (Whitten dan
Pattisaul, 2001). Gambar 2 di bawah ini menunjukkan kalsifikasi pada
fitoestrogen dan Gambar 3 menunjukkan bahwa genistein terdapat dalam
golongan isoflavon.
Gambar 2. Klasifikasi utama fitoestrogen (Barlow, 2007)
Gambar 3. Contoh dari senyawa yang masuk golongan isoflavon (Barlow, 2007)
Genistein adalah fitoestrogen yang berasal dari prekursor tanaman
tertentu, seperti biji kedelai dan kacang-kacangan lainnya (Hsieh, 1998).
Genistein merupakan golongan fitoestrogen bekerja sebagai SERMs, sehingga
menghambat proliferasi sel pada kanker payudara secara in vitro di dosis > 10µM
dan menstimulasi proliferasi sel pada dosis < 10µM (Khairiah, 2014). Menurut
penelitian Khairiah (2014), genistein bersifat antagonis dan menurunkan efek
estrogenik pada kultur sel stroma dan kelenjar endometrium yang tinggi tingkat
estrogennya. Hasil dari penelitiannya menunjukkan bahwa genistein mampu
menurunkan poliferasi sel stroma pada payudara didosis 50µM dengan waktu
inkubasi 24 jam. Menurut penelitian in vitro dengan suspensi MCF-7 (2000 sel/
100μL) yang dilakukan oleh Matsuda et al (2001), IC50 untuk genistein adalah 1,3
µM dan Ki untuk genistein adalah 0,37µM.
D. Uji In Silico
Uji in silico adalah suatu istilah untuk percobaan atau uji yang dilakukan
dengan metode simulasi komputer. Uji in silico telah menjadi metode yang
digunakan untuk mengawali penemuan senyawa obat baru dan untuk
meningkatkan efisiensi dalam optimasi aktivitas senyawa induk. Kegunaan uji in
silico adalah memprediksi, memberi hipotesis, memberi penemuan baru atau
kemajuan baru dalam pengobatan dan terapi (Hardjono, 2013).
Salah satu uji in silico dilakukan dengan melakukan docking molekul
kandidat senyawa obat dengan reseptor yang dipilih. Docking adalah suatu upaya
untuk menselaraskan antara ligan yang merupakan molekul kecil ke dalam
reseptor yang merupakan molekul protein yang besar, dengan memperhatikan
E.Penapisan Virtual Berbasis Struktur (PVBS)
Penapisan Virtual Berbasis Struktur (PVBS) adalah penapisan virtual yang
mengacu pada evaluasi sifat-sifat senyawa secara in silico seperti aktivitas dari
beberapa penyusunan molekul yang berbeda. Penapisan virtual berdasarkan
struktur 3D target makromolekul diterapkan secara luas untuk mengidentifikasi
kemungkinan untuk mengikat target berupa ligan. Prinsip dari penapisan ini
membutuhkan struktur dari molekul target dan senyawa uji. Setiap senyawa uji
ditambatkan secara virtual pada molekul target melalui perangkat lunak
penambatan yang memodelkan ligan dengan target secara komputasi untuk
mendapatkan sifat fisika kimia yang optimal (Wadood, 2013).
PVBS yang digunakan dalam penelitian ini adalah protokol penambatan
yang dikembangkan dan telah divalidasi oleh Setiawati et al. (2014). Protokol
penambatan ini menggunakan Structure Protonation and Recognition System
(SPORES) (Brink dan Exner, 2009) yang berfungsi untuk mempersiapkan
senyawa yang akan ditambatkan di Protein-Ligand ANT System versi 1.2
(PLANTS1.2) (Korb et al., 2006), PLANTS1.2 (Korb et al., 2006) untuk
menambatkan senyawa pada kantung ikatan REα dan Python-based Protein-
Ligand Interaction Fingerprinting (PyPLIF) (Radifar et al., 2013) untuk
mengidentifikasi Protein-Ligan Interaction Fingerprint (PLIF).
Protokol Setiawati et al. (2014) divalidasi dengan menggunakan Directory
of Useful Decoy Enhanced (DUD-E) (Mysinger, Carchia, Irwin, Shoicher, 2012).
DUD-E merupakan kumpulan dari 102 data berisi target obat dalam bentuk
yang berfungsi untuk membantu mengevaluasi kecocokan antara reseptor dan
ligan. Protokol post docking analysis yang digunakan adalah protokol yang
dikembangkan oleh Istyastono (2015) dengan metode Recursive Partition and
Regression Tree (RPART). Analisis statistik digunakan aplikasi R 3.0.2 (R
Development Core Team, 2015). Skor ChemPLP yang merupakan hasil pada
PLANTS1.2 memberi skor menurut faktor ikatan dan interaksi akseptor metal
antara ligan dengan protein (Korb, Stutzle dan Exner, 2007).
PyPLIF merupakan program Interaction Fingerprinting (IFP) yang
bergantung pada Open Babel. Pada protokol ini PyPLIF berfungsi sebagai IFP
dengan cara merubah interaksi molekul antara ligan dan protein menjadi data bit
(bitstring) menurut pilihan residu dan jenis interaksi (Radifar, Yuniarti dan
Istyastono, 2013). Open Babel merupakan sebuah perpustakaan kimia untuk
memberikan alat IFP gratis yang dapat digunakan dan dimodifikasi sesuai
kebutuhan. Hasil yang didapat berupa bitstring dan digunakan untuk post docking
analysis dengan protokol Istyastono (2015).
Metode RPART pada protokol post docking analysis Istyastono (2015)
menggunakan skor ChemPLP dan PLIF bitstring hasil dari penambatan yang
dilakukan untuk membuat sebuah decision tree, sehingga membantu
mengidentifikasi aktifitas dalam ikatan protein dengan ligan. Decision tree ini
berfungsi untuk menentukan keaktifan suatu senyawa sebagai ligan pada REα,
Gambar 4. Decision tree yang dikembangkan oleh Istyastono (2015)
Berikut ini disertakan tabel yang menjelaskan PLIF bitstring yang penting
menurut decision tree di atas.
Tabel I. PLIF bitstring penting dalam decision tree (Istyastono, 2015)
Bitstring Nomor Residu Jenis interaksi
320 GLY 420 Ikatan hidrogen (protein sebagai akseptor) 242 ARG 394 Ikatan hidrogen (protein sebagai donor) 117 GLU 353 Ikatan hidrogen (protein sebagai akseptor) 411 GLY 521 Ikatan hidrogen (protein sebagai akseptor) 473 CYS 530 Ikatan hidrogen (protein sebagai donor) 105 ASP 351 Interaksi elektrostatik ( protein sebagai anion) 201 LEU 387 Ikatan hidrogen (protein sebagai akseptor) 470 CYS 530 Interaksi non-polar
F.Landasan Teori
Kanker payudara dapat terjadi akibat adanya perkembangan sel-sel secara
abnormal pada payudara. Hal ini dapat disebabkan adanya mutasi gen, sehingga
berdampak pada perubahan bentuk dan ukuran. Estrogen berperan penting dalam
perkembangan sistem reproduksi, salah satunya adalah payudara. Estrogen
dikaitkan juga dengan induksi dan pertumbuhan kanker payudara. REα adalah
salah satu dari reseptor yang terdapat pada payudara dan dapat berikatan dengan
estrogen, sehingga estrogen dapat berdifusi kedalam jaringan payudara.
Genistein yang merupakan senyawa golongan isoflavon telah terbukti
secara in vitro dan in vivo berfungsi sebagai antikanker. Struktur genistein juga
menunjukkan adanya cincin fenolik yang merupakan syarat untuk berikatan
dengan REα. Penetuan pose yang berupa skor ChemPLP dilakukan dengan
menggunakan perangkat lunak PLANTS1.2 dan dengan protokol yang dibuat oleh
Setiawati et al (2014) dilakukan penambatan molekuler dan dipilih dari skor
terbaik (terendah) serta PLIF bitstring yang akan digunakan dalam penentuan
decoy atau ligan dari senyawa uji (genistein) menggunakan decision tree pada
post docking analysis yang dikembangkan oleh Istyastono (2015).
G.Hipotesis
Genistein bertindak sebagai ligan pada REα secara in silico menurut
protokol penambatan yang dikembangkan oleh Setiawati et al (2014) dan post
BAB III
METODE PENELITIAN
A.Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian dengan judul “Uji In Silico Senyawa Genistein sebagai Ligan
pada Reseptor Estrogen Alfa” termasuk penelitian eksperimental berbantukan
komputer.
B.Variabel Penelitian 1.Variabel Penelitian
a. Variabel utama
1) Variabel bebas : Pose senyawa genistein dalam kantung
ikatan REα
2) Variabel tergantung : Skor ChemPLP dan PLIF bitstring
b. Variabel pengacau
1) Variabel pengacau terkendali : spesifikasi perangkat keras dan
versi perangkat lunak yang
digunakan peneliti.
2) Variabel pengacau tidak terkendali : ketidakstabilan yang disebabkan
oleh bentuk cembung permukaan
partikel (Lyapunov instability)
(Posch, Hoover, 2006).
C.Definisi Operasional
1. Ligan : Ligan aktif.
2. PLIF bitstring : luaran dari post docking analysis menggunakan PyPLIF.
3. Pose genistein : Pose senyawa di dalam kantung ikatan
REα yang dipilih secara obyektif
kuantitatif berdasarkan nilai ChemPLP
dan PLIF bitsring.
4. Protokol penelitian : Protokol penambatan virtual yang dikembangkan dan divalidasi oleh
Setiawati et al. (2014).
5. Protokol post docking analysis : Protokol analisis yang mengacu pada protokol post docking oleh Istyastono
(2015).
6. PVBS : Penapisan Virtual Berbasis Struktur
7. Senyawa Marginal : Senyawa yang berada pada perbatasan sebagai ligan aktif atau tidak aktif.
8. Senyawa yang diuji : Senyawa genistein dalam bentuk berkas digital.
9. Skor ChemPLP : Skor yang dihasilkan oleh perangkat lunak PLANTS1.2 (Korb et al., 2006)
yang menunjukkan ikatan antara
D.Bahan dan Alat Penelitian 1.Bahan yang digunakan dalam penelitian
a. Protokol penelitian.
b. Protokol post docking analysis.
c. Struktur tiga dimensi genistein (didapat dari zinc.docking.org, kode:
ZINC188253300).
d. Perangkat lunak penambatan PLANTS1.2 (Korb et al., 2006) untuk
melakukan simulasi penambatan molekuler sehingga didapat skor
ChemPLP, SPORES (Brink dan Exner, 2010) untuk memastikan
format .mol2 dapat digunakan oleh perangkat lunak PLANTS1.2,
PyPLIF (Radifar et al., 2013) untuk mengidentifikasi protein-ligan
interaction fingerprint, PyMol 1.2r1 (Lill dan Danielson, 2011) untuk
menghasilkan gambar molekuler, serta R versi 3.0.2 (R Development
Core Team, 2013) untuk analisis statistik.
2. Alat atau Instrumen Penelitian
Server Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dengan nomor alamat
IP 103.247.10.66 (pharcomp.usd), laptop HP 430 dengan spesifikasi: prosesor
Intel Core i3-2330 2,2 Ghz, RAM 2GB 1067 MHz DDR3, dengan sistem operasi
ubuntu 12.04 versi kernel 3.5.0-23-genetic.
E. Tata Cara Penelitian
1. Preparasi genistein
Struktur genistein dalam format .mol2 diunduh dari ZINC
menggunakan aplikasi SPORES agar dapat ditambatkan pada penambatan
molekuler menggunakan PLANTS1.2.
2. Penambatan genistein
Luaran dari SPORES ditambatkan menggunakan PLANTS1.2 dengan
konfigurasi mengacu pada Setiawati et al. (2014) dan dianalisis IFP menggunakan
PyPLIF. Setiap kali penambatan (1 run) dilakukan tiga kali iterasi penambatan
molekuler, masing-masing menghasilkan 50 pose. Diperoleh 3 x 50 pose lalu
diambil satu pose yang terbaik dengan ChemPLP. Dilakukan 1000 kali run hingga
didapat 1000 pose terbaik beserta data PLIF bitstring.
F. Tata Cara Analisis Hasil
Analisis hasil dilakukan dengan menguji 1000 pose hasil penambatan
menggunakan aplikasi statistik R versi 3.0.2 dengan protokol post docking
analysis yang dikembangkan Istyastono (2015). Hasil penambatan berupa skor
ChemPLP dan PLIF bitstring yang dimasukkan pada decision tree melalui metode
RPART dengan aplikasi statistik R versi 3.0.2 (R Development Core Team, 2015).
Data hasil analisis dari decision tree akan memperlihatkan senyawa genistein aktif
sebagai ligan yang ditunjukkan dengan angka 1 atau tidak aktif dalam ligan yang
ditunjukkan dengan angka 0.
Pose dari senyawa genistein dilihat interaksinya dengan REα
menggunakan PyMol. Visualisasi pose dengan PyMol1.2r1 dilakukan dengan
1. Pose dengan bitstring 320 aktif dan skor ChemPLP terkecil.
2. Pose dengan skor ChemPLP terkecil.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian mengenai uji in silico genistein terhadap REα bertujuan untuk
mengetahui kemampuan senyawa genistein sebagai ligan pada REα melalui
protokol penambatan virtual yang dikembangkan dan divalidasi oleh Setiawati et
al. (2014) dan protokol post docking analysis oleh Istyastono (2015). Tujuan
lainnya adalah untuk mengetahui dan menguji kemampuan protokol penambatan
virtual in silico yang telah dikembangkan oleh Setiawati et al (2014) dan protokol
post docking analysis oleh Istyastono (2015) dalam mengenali genistein sebagai
ligan pada REα, serta untuk mengetahui tingkat molekuler pose genistein dalam
kantung ikatan REα.
Hasil luaran dari PyPLIF menunjukkan pose aktif pada bitstring 320
(GLY 420), 242 (ARG394), 117 (GLU 353), 411 (GLY 521), 473 (CYS 530), 105
(ASP 351), 201 (LEU 387), 470 (CYS 530), 170 (TRP 383), dan 323 (MET 421).
Pose inaktif ditunjukkan oleh bitstring 171 (TRP 383).
Untuk visualisasi pose senyawa genistein, digunakan pose replikasi ke-
950 yang memiliki skor ChemPLP –84,9031 yang merupakan skor ChemPLP
terendah. Hasil visualisasi menunjukkan adanya interaksi antara senyawa
genistein dengan tiga residu yang berperan penting dalam interaksi ligan-protein,
yaitu ARG 394 dengan bitstring ke-242 mempunyai jarak 1.8 A dan GLU 353
dengan bitstring ke-117 mempunyai jarak 1.8 A serta GLY 420 dengan bitstring
ke-320 mempunyai jarak 2.1 A. Ikatan yang terbentuk dengan ARG 394 adalah
ikatan hidrogen dengan protein sebagai donor, dan ikatan dengan GLU 353 dan
GLY 420 adalah ikatan hidrogen dengan protein sebagai akseptor. Senyawa
genistein yang divisualisasikan (Gambar 5) terlihat memiliki ikatan dengan residu
HIS 520 yang berjarak 2.6 A. Jarak antar ligan dan reseptor untuk dikatakan
punya ikatan yang kuat adalah 4.5 A (Clark, 2006). Pada jarak HIS 520 dan ligan
(dalam hal ini genistein) dapat dikatakan sudah cukup memiliki ikatan yang kuat.
Ikatan yang terjadi antar HIS 520 dengan genistein adalah ikatan hidrogen.
Pada reseptor estrogen alfa terdapat beberapa residu penting berdasarkan
PLIF bitstring pada decision tree, dan apabila mengacu pada post docking
analysis oleh Istyastono (2015), PLIF bitstring dijadikan parameter dalam analisis
RPART karena meningkatkan kualitas dari penapisan virtual berbasis struktur.
Hal ini dapat terjadi karena hasil dari analisis RPART adalah decision tree seperti
terlihat pada Gambar 4 dan dengan decision tree terdapat perbedaan signifikan
yang lebih baik untuk nilai akurasinya dibandingkan dengan protokol yang diacu
membantu agar ligan yang dianalisis menggunakan metode RPART menghasilkan
data yang lebih akurat untuk identifikasi terhadap potensi ligan terhadap REα.
Selain hasil dari visualisasi yang telah disebutkan diatas, cincin fenolik
pada genistein diasumsikan membantu menguatkan posisi genistein dalam
kantung ikatan REα. Hal ini diperkuat karena adanya residu Triptofan (TRP)
dalam daftar residu penting yang sesuai dengan PLIF bitstring pada decision tree,
yang mempunyai jenis interaksi aromatis yang kemungkinan besar akan
berinteraksi dengan cincin fenolik yang ada pada senyawa genistein.
Gambar 5. Pose visualisasi genistein pada kantung ikatan REα
Interaksi polar ditunjukkan dengan garis putus-putus berwarna hitam
Berdasarkan decision tree genistein merupakan ligan dikarenakan
memenuhi syarat yang ada pada decision tree, yaitu nilai pada bitstring 320
84,82, yaitu -84,9031. Hal ini sesuai dengan hipotesis yang mengatakan senyawa
genistein secara in silico dapat bertindak sebagai ligan bagi REα dengan protokol
yang digunakan. Alur dari decision tree yang diperoleh berdasarkan data genistein
terlihat pada Gambar 6.
Gambar 6. Alur decision tree yang diperoleh berdasarkan data genistein Panah merah menunjukkan alur pembuatan keputusan apakah senyawa merupakan ligan atau decoy. Pose yang digunakan adalah pose yang
divisualisasikan. Apabila jawaban dari pertanyan di decision tree “ya” mengikuti garis skema ke kiri, dan sebaliknya
No
Tabel dibawah ini akan memperlihatkan skor pada PLIF bitstring penting
serta presentase skor yang memiliki nilai 1(on) ataupun 0 (off). Terlihat pada tabel
bahwa PLIF bitstring penting yang memiliki 100% nilai 1 ada 4, yaitu 320, 242,
117, dan 323, sedangkan yang memiliki nilai 0 100% ada 7, yaitu 411, 473, 105,
201, 470, 170 dan 171.
Tabel III. Skor pada PLIF bitstring penting
320 242 117 411 473 105 201 470 170 171 323
1 100% 100% 100% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 100%
0 0% 0% 0% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 0%
Senyawa dapat dikatakan sebagai ligan aktif apabila memiliki afinitas
(IC50, EC50, Ki, Kd, dan variasi lognya) pada konsentrasi di bawah 1 µM.
Senyawa dianggap decoy apabila memiliki afinitas 30µM ke atas. Selain itu
terdapat senyawa marginal, yang memiliki afinitas antara 1-30µM (Mysinger, et
al., 2012). Senyawa genistein memiliki nilai IC50 1,3 µM dan nilai Ki 0,37µM.
Berdasarkan nilai IC50, genistein termasuk senyawa marginal, sedangkan
berdasarkan nilai Ki, genistein termasuk ligan aktif.
Menurut protokol yang sudah dilakukan, genistein termasuk ligan. Hal
ini menunjukkan protokol dapat mendeteksi genistein sebagai ligan pada kantung
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Genistein merupakan ligan Reseptor Estrogen alfa (REα) menurut
protokol Setiawati et al. (2014) dan post docking analysis oleh Istyastono
(2015).
B. Saran
Genistein dapat dikembangkan dan diformulasikan menjadi obat
baru untuk menghambat pertumbuhan kanker payudara terutama pada
REα.
DAFTAR PUSTAKA
Barlow, J, Johnson, J.A., Scofield, L., 2007, Fact Sheet on the Phytoestrogen
Genistein,BCERC COTC Fact Sheet, Maryland, pp. 47-48.
Berry, N. B., 2008, Regulation of Estrogen Receptor-alpha Ubiquitination and
Proteasomemediated Receptor Degradation, ProQuest, Champaign, pp.3-
5.
Brink, Tim ten, Exner, Thomas E., 2009, Influence of Protonation, Tautomeric, and Tereoisomeric States on Protein-Ligand Docking Results, J. Chem.
Inf. Model,49, 1535-1546.
Brunce, C. A., Elisabeth, C., 2008. Development and Spread of Cancer, Merck Manual, United States.
Clark, A. M., 2006, Ligand Interaction Diagrams, Chemical Computing Group Inc., Canada.
Dixon, R., A., Ferreira, D., 2002, Phytochemistry, Elsevier, 60, 205.
Hardjono S., 2013, Sintesis dan Uji Aktivitas Antikanker Senyawa 1-(2- Klorobenzoiloksi)urea da 1-(4-klorobenzoiloksi)urea, Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, 2 (1), 1.
Hsiesh, C., Santell, R.C., Haslam, S.Z., Helferich, W.G., 1998. Esterogic Effects
of Genisteinon the Growth of Estrogen Receptor-positive Human Breast Cancer (MCF-7) Cells inVitro and in Vivo, Cacer Research, 58(1), 1.
Istyastono, E. P., 2015, Employing Recursive Partition and Regression Tree
Method to Increase The Quality of Structure-Based Virtual Screening in The Estrogen Receptor Alpha Ligands Identification, Asian Journal of
Pharmaceutical and Clinical Research, 8, 208.
Jensen F., 2007, Introduction to Computational Chemistry, 2nd Ed, Odense,
Denmark : 415-416.
Korb, O., Stützle, T., Exner, T. E., 2007, An Ant Colony Optimization Approach to Flexible Protein-Ligand Docking, Swarm Intell, 1, 115-134.
Lil, Markus A, Danielson, Matthew L., 2011, Computer-Aided Drug Design Platform Using PyMOL, J Comput Aided Mol Des, 25, 13-19.
Matsuda, H., Shimoda, H., Morikawa, T., and Yoshikawa M., 2001,
Phytoestrogens from the Roots of Polygonum cuspidatum (Polygonaceae): Structure-Requirement of Hydroxyantraquinones for Estrogenic Activity,
Bioorgan & Medicinal Chemistry Letters 11, 1842.
Marcou, G., Rognan, D., 2006, Optimizing Fragment and Scaffold Docking by
Use of Molecular Interaction Fingerprints, Journal Chemistry, p.195.
Mustarichie, R., Levitas, J., Arpina, J., 2014, In silico study of curcumol,
curcumenol, isocurcumenol, and β-sitosterol as potential inhibitors of
estrogen receptor alpha of breast cancer, Med J Indones 23 (1), 16.
Pawiroharsono, S., 2001, Prospek dan Manfaat Isoflavin untuk Kesehatan. http://www.tempo.co.id/medika/arsip/042001/pus-2.htm, 16 Januari 2016.
Posch, H. A., Hoover, W. G., 2006, Lyapunov Instability of Classical Many-Body Systems, Journal of Physics: Conference Series, 31, 9-17.
Pusat Data dan Informasi Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 2013, Info Datin : Stop Kanker. Kementerian Kesehatan RI, Jakarta. hal. 4.
Putra, I. G. N. S., Nurcahya, B.M., Rachmattika, B., Wynanda, Sudarmanto, B. S. A., Meiyanto, E., 2008, Kurkumin dan Analognya sebagai Selective
Estrogen Receptor Modulators (SERMS): Kajian Berdasarkan Metode Docking pada Reseptor Estrogen Alfa, Pharmacon, 9 (1), 7-9.
Radifar, Muhammad, Yuniarti, Nunung, Enade, Istyastono, 2013, PyPLIF: Python-based Protein-Ligand Interaction Fingerprinting, Bioinformation, 9(6), 325-328.
Ramirez, M. C., 2007, Regulation of Estrogen Receptor Alpha Expression in
Breast CancerCells by Sulforaphane, ProQuest, Champaign, pp. 1-2.
R Development Core Team, R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Foundation for Statistival Computing, Vienna, Austria, http://www.R-project.org/, 2015.
Santi, D. A., 2015, Mencegah dan Mengobati Kanker Payudara, Deuyis, Yogyakarta, hal.3,4.
Setiawati, A., Riswanto, F. D. O., Yuliani, S. H., Istyastono, E. P., 2014,
Retrospective Validation of a Structure-Based Virtual Screening Protocol to Identify Ligands forEstrogen Receptor Alpha and Its Application to Identify the Alpha-Mangostin BindingPose, Indo. J. Chem, 14 (2), 104-
106.
Siswono. (2003), Kanker Payudara Bisa Dideteksi Sendiri,
http://www.gizi.net/cgi-bin/berita/fullnew.cgi?newsid1010552074,29807, diaksestanggal 09 Mei 2015.
Sperandio, O., Villoutreix, B.O., Miteva, M.A., 2011, In Silico Lead Discovery, BenthamScience Publishers Ltd., France, pp. 20-21.
Wadood, A., Ahmed, N., Shah, L., Ahmad, A., Hassan, H., Shams, S., 2013, In
Silico drug design: An approach whish revolutionarised the drug discovery process, OA Drug Design & Delivery, 1(1), 2.
Whitten, Patricia, L., dan Pattisaul, H. B., 2001, Cross-species dan interassay
Comparison of Phytoestrogen Action : Enviromental Helath Prespectives Supplements Volume 109, Department Anthropology and Center for
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi dengan judul “ Uji In Silico Senyawa
Genistein sebagai Ligan pada Reseptor Estrogen Alfa”
memiliki nama lengkap Aprilini Khaterin Johan. Penulis lahir di Belitung pada tanggal 21 April 1995 dari pasangan Johan dan Diana sebagai anak pertama dari dua bersaudara. Pendidikan formal yang ditempuh penulis dimulai dari TK Regina Pacis Tanjungpandan Belitung (1998-2000), SD Regina Pacis Tanjungpandan Belitung (2000-2006), SMP Regina Pacis Tanjungpandan Belitung (2006-2009), dan melanjutkan pendidikan menengah atas di SMA Negeri 1 Tanjungpandan Belitung (2009-2012).