KULTUR JARINGAN DAN TEORI TOTIPOTENSI

KULTUR JARINGAN DAN TEORI TOTIPOTENSI

Kultur jaringan/Kultur In Vitro/Tissue Culture adalah suatu teknik untuk mengisolasi, sel, protoplasma, jaringan, dan organ dan menumbuhkan bagian tersebut pada nutrisi yang mengandung zat pengatur tumbuh tanaman pada kondisi aseptik,sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman sempurna kembali. Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman,

khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvensional.

KEUNTUNGAN PEMANFAATAN KULTUR JARINGAN

• Pengadaan bibit tidak tergantung musim

• Bibit dapat diproduksi dalam jumlah banyakdengan waktu yang relatif lebih cepat (darisatu mata tunas yang sudah respon dalam 1tahun dapat dihasilkan minimal 10.000 planlet/bibit)

• Bibit yang dihasilkan seragam

• Bibit yang dihasilkan bebas penyakit (menggunakan organ tertentu) • Biaya pengangkutan bibit relatif lebih murahdan mudah

• Dalam proses pembibitan bebas dari gangguan hama, penyakit, dan deraan lingkungan lainnya

Landasan kultur jaringan didasarkan atas tiga kemampuan dasar dari tanaman, yaitu:

1. Totipotensi adalah potensi atau kemampuan dari sebuah sel untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman secara utuh jika distimulasi dengar benar dan sesuai. Implikasi dari totipotensi adalah bahwa semua informasi tentang pertumbuhan dan perkembangan suatu organisme terdapat di dalam sel. Walaupun secara teoritis seluruh sel bersifat totipotensi, tetapi yang mengekspresikan keberhasilan terbaik adalah sel yang meristematik.

Teori totipotensi ini dikemukakan oleh G. Heberlandt tahun 1898. Dia adalah seorang ahli fisiologi yang berasal dari Jerman. Pada tahun 1969, F.C.

Steward menguji ulang teori tersebut dengan menggunakan objek empulur wortel. Dengan mengambil satu sel empulur wartel, F.C. Steward bisa menumbuhkannya menjadi satu individu wortel. Pada tahun 1954, kultur jaringan dipopulerkan oleh Muer, Hildebrandt, dan Riker.

2. Rediferensiasi adalah kemampuan sel-sel masak (mature) kembali menjadi ke kondisi meristematik dan dan berkembang dari satu titik pertumbuhan baru yang diikuti oleh rediferensiasi yang mampu melakukan reorganisasi manjadi organ baru.

berkembang dalam satu jalur tertentu. Cantohnya embrioagenikali kompeten cel adalah kemampuan untuk berkembang menjadi embrio funsional penuh. Sebaliknya adalah non-kompeten atau morfogenetikali tidak mempunyai kemampuan.

Tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah: 1) Pembuatan media

Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf.

2) Inisiasi

Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas.

3) Sterilisasi

Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril.

4) Multiplikasi

Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan.

5) Pengakaran

Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik.

6) Aklimatisasi

Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif.

Tipe-tipe Kultur Jaringan :

Kultur jaringan (tissue culture) sampai saat ini digunakan sebagai suatu istilah umum yang meliputi pertumbuhan kultur secara aseptik dalam wadah yang umumnya tembus cahaya. Sering kali kultur aseptik disebut juga kultur in vitro yang artinya sebenarnya adalah kultur di dalam gelas.

Dalam pelaksanaannya dijumpai beberapa tipe-tipe kultur, yakni:

1. Kultur biji (seed culture), kultur yang bahan tanamnya menggunakan biji atau seedling. 2. Kultur organ (organ culture), merupakan budidaya yang bahan tanamnya menggunakan organ, seperti: ujung akar, pucuk aksilar, tangkai daun, helaian daun, bunga, buah muda,

inflorescentia, buku batang, akar dll.

3. Kultur kalus (callus culture), merupakan kultur yang menggunakan jaringan (sekumpulan sel) biasanya berupa jaringan parenkim sebagai bahan eksplannya.

4. Kultur suspensi sel (suspension culture) adalah kultur yang menggunakan media cair dengan pengocokan yang terus menerus menggunakan shaker dan menggunakan sel atau agregat sel sebagai bahan eksplannya, biasanya eksplan yang digunakan berupa kalus atau jaringan meristem.

5. Kultur protoplasma. eksplan yang digunakan adalah sel yang telah dilepas bagian dinding selnya menggunakan bantuan enzim. Protoplas diletakkan pada media padat dibiarkan agar membelah diri dan membentuk dinding selnya kembali. Kultur protoplas biasanya untuk keperluan hibridisasi somatik atau fusi sel soma (fusi 2 protoplas baik intraspesifik maupun interspesifik).

6. Kultur haploid adalah kultur yang berasal dari bagian reproduktif tanaman, yakni: kepalasari/ anther (kultur anther/kultur mikrospora), tepungsari/ pollen (kutur pollen), ovule (kultur ovule), sehingga dapat dihasilkan tanaman haploid.

Aplikasi Teknik Kultur Jaringan dalam Bidang Agronomi a. Perbanyakan vegetatif secara cepat (Micropropagation). b. Membersihkan bahan tanaman/bibit dari virus

c. Membantu program pemuliaan tanaman (Kultur Haploid, Embryo Rescue, Seleksi In Vitro, Variasi Somaklonal, Fusiprotoplas, Transformasi Gen /Rekayasa Genetika Tanaman dll). d. Produksi metabolit sekunder.

Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Regenerasi

1. Bentuk Regenerasi dalam Kultur In Vitro : pucuk aksilar, pucuk adventif, embrio somatik, pembentukan protocorm like bodies, dll

2. Eksplan

Eksplan adalah bagian tanaman yang dipergunakan sebagai bahan awal untuk perbanyakan tanaman. Faktor eksplan yang penting adalah genotipe/varietas, umur eksplan, letak pada cabang, dan seks (jantan/betina). Bagian tanaman yang dapat digunakan sebagi eksplan adalah pucuk muda, batang muda, daun muda, kotiledon, hipokotil, endosperm, ovari muda, anther, embrio, dll.

3. Media Tumbuh

Di dalam media tumbuh mengandung komposisi garam anorganik, zat pengatur tumbuh, dan bentuk fisik media. Terdapat 13 komposisi media dalam kultur jaringan, antara lain: Murashige dan Skoog (MS), Woody Plant Medium (WPM), Knop, Knudson-C, Anderson dll. Media yang sering digunakan secara luas adalah MS.

Tabel 1. Komposisi media Murashige dan Skoog (MS)

___________________________________________________ Bahan Kimia Konsentrasi Media (mg/l)

___________________________________________________ 1. NH4NO3 1650

3. CaCL2.2H20 440 4. MgSO4.7H20 370 5. KH2PO4 170 6. FeSO4.7H20 27 7. NaEDTA 37,3 8. MnSO4.4H20 22,3 9. ZnSO4.7H2O 8,6 10. H3BO3 6,2 11. KI 0,83 12. Na2MoO4.2H20 0,25 13. CuSO4.5H20 0,025 14. CoCl2.6H20 0,025 15. Myoinositol 100 16. Niasin 0,5 17. Piridoksin-HCL 0,5 18. Tiamin -HCL 0,1 19. Glisin 2 20. Sukrosa 30.000 ____________________________________________________

4. Zat Pengatur Tumbuh Tanaman

Faktor yang perlu diperhatikan dalam penggunaan ZPT adalah konsentrasi, urutan

penggunaan dan periode masa induksi dalam kultur tertentu. Jenis yang sering digunakan adalah golongan Auksin seperti Indole Aceti Acid(IAA), Napthalene Acetic Acid (NAA), 2,4-D, CPA dan Indole Acetic Acid (IBA). Golongan Sitokinin seperti Kinetin, Benziladenin (BA), 2I-P, Zeatin, Thidiazuron, dan PBA. Golongan Gibberelin seperti GA3. Golongan zat

penghambat tumbuh seperti Ancymidol, Paclobutrazol, TIBA, dan CCC.

5. Lingkungan Tumbuh

Lingkungan tumbuh yang dapat mempengruhi regenerasi tanaman meliputi temperatur, panjang penyinaran, intensitas penyinaran, kualitas sinar, dan ukuran wadah kultur.

Perbedaan DNA mitokondria dan DNA inti

DNA Mitokondria (disingkat mtDNA) adalah materi genetik DNA yang terdapat di dalam

mitokondria. Mitokondria merupakan organel sel memiliki struktur khas dengan bentuk bulat

lonjong dalam sel. Fungsi mitokondria adalah untuk memasok energi dalam sel atau biasa

disebut tempat respirasi sel, Energi ini diperoleh dari makanan. Di dalam sel mitokondria

terdapat ratusan ribu mitokondria yanng terdapat di sitoplasma sel. Mitokondria memiliki

materi genetik sendiri yang karakteristiknya berbeda dengan materi genetik di inti sel.

Perbedaan DNA mitokondria dan DNA inti sebagai berikut :

1. Letak

DNA mitokondria terletak di dalam mitokondria, mitokondria adalah organel sel. Sedangkan

DNA inti sel terletak di dalam inti sel. mtDNA terletak di matriks mitokondria berdekatan

dengan membran dalam mitokondria, tempat berlangsungnya reaksi fosforilasi oksidatif

yang menghasilkan radikal oksigen sebagai produk samping (Richter, 1988).

2. Laju Mutasi lebih cepat

Laju mutasi DNA mitokondria lebih tinggi sekitar 10-17 kali dibandingkan DNA inti. Karena

mtDNA tidak memiliki mekanisme reparasi yang efisien (Bogenhagen, 1999). DNA

polimerase yang dimiliki oleh mitokondria adalah DNA polimerase γ yang tidak mempunyai

aktivitas proofreading (suatu proses perbaikan dan pengakuratan dalam replikasi DNA).

Tidak adanya aktivitas ini menyebabkan mtDNA tidak memiliki sistem perbaikan yang dapat

menghilangkan kesalahan replikasi. Replikasi mtDNA yang tidak akurat ini akan

menyebabkan mutasi mudah terjadi.

3. Tidak memiliki protein histon.

Pada DNA inti, disusun dalam bentuk yang khas, dengan adanya beberapa macam protein

histon sehingga bentuknya seperti berpilin-pilin.

DNA mitokondria mempunyai jumlah lebih banyak jika dibandingkan DNA inti, karena

jumlah mitokondria banyak di dalam sel. Dari segi ukuran genom, genom DNA mitokondria

relatif lebih kecil.

5. Hanya diwariskan dari Ibu

DNA mitokondria diwariskan hanya dari ibu, sedangkan DNA inti dari kedua orang tua (dari

DNA ayah dan ibu). Pada saat pembuahan sel, sel sperma hanya berpusi materi DNA

saja, sedangkan sedangkan bagian-bagian sel sperma lain tidak. Sehingga DNA

mitokondria pada anak hanya dari ibu.

6. Bentuknya Lingkaran dan sirkuler

DNA mitokondria berbentuk lingkaran, berpilin ganda, sirkular, dan tidak terlindungi

membran (prokariotik). Sedangkan bentuk DNA inti panjang tidak sirkuler, duble helik,

pada saat akan pembelahan sel berbentuk kromosom.

7. Tidak memiliki intron

DNA mitokondria tidak memiliki intron dan semua gen pengkode terletak

berdampingan,sedangkan pada DNA inti terdapat ekson dan intron, pada saat sintesis

protein terjadi pemotongan intron yaitu pada pemerosesan mRNA.

8. Haploid (2n)

DNA mitokondria bersifat haploid karena hanya berasal dari ibu.

9. Stop kodonnya berbeda

Salah satu bentuk keunikan lainnya dari mitokondria adalah perbedaan kode genetik

mitokondria menunjukkan perbedaan dalam hal pengenalan kodon universal. UGA tidak

dibaca sebagai “berhenti” (stop) melainkan sebagai tryptofan, AGA dan AGG tidak dibaca

sebagai arginin melainkan sebagai “berhenti”, AUA dibaca sebagai methionin (Anderson et

al., 1981).

10. DNA mitokondria mempunyai daerah yang tidak mengode dari mtDNA. Daerah ini

mengandung daerah yang memiliki variasi tinggi yang disebut displacement loop (D-loop).

D-loop merupakan daerah beruntai tiga (tripple stranded) untai ketiga lebih dikenal sebagai

7S DNA. D-loop memiliki dua daerah dengan laju polymorphism yang tinggi sehingga

urutannya sangat bervariasi antar individu, yaitu Hypervariable I (HVSI) dan Hypervariable

II (HVSII). Daerah non-coding juga mengandung daerah pengontrol karena mempunyai

origin of replication untuk untai H (OH) dan promoter transkripsi untuk untai H dan L (PL

dan PH) (Anderson et al., 1981). Selain itu, daerah non-coding juga mengandung tiga

daerah lestari yang disebut dengan conserved sequence block (CSB) I, II, III. Daerah yang

lestari ini diduga memiliki peranan penting dalam replikasi mtDNA.