69
PROFIL SITOGENETIK KROMOSOM Y PADA LAKI-LAKI NORMAL
Siti Wasilah
1
Fakultas Kedokteran Universitas Lambung Mangkurat E-mail: sitiwasilah@yahoo.com
ABSTRACT
Normal prenatal developments of male and female genitalia are very complicated. Some crucial loci on Y chromosome have a role in normal sexual development. Descriptive study about cytogenetics profile of Y chromosome presented in 30 normal male was done using G-banding and C-banding techniques to described the mean length and heterochromatin profile of y chromosome. Cytogenetics method using G-banding show 30 male with normal karyotype (46,XY) and there is no structure aberration of Y chromosome, the mean length of Y chromosome in normal male was 2,54 µm (SD 0.31). Heterochromatin profile of Y chromosome analyzed by C-banding technique show that all normal male has C-band positive.
Key words: cytogenetics profile, Y chromosome, normal male
PENDAHULUAN
Perkembangan prenatal organ genital memerlukan peran krusial dari kromosom
Y1,2. Kromosom Y adalah kromosom
terkecil pada manusia yang diperlukan untuk perkembangan seksual dan spermatogenesis karena mengandung sejumlah lokus krusial yang berperan dalam perkembangan seksual normal1. Faktor transkripsi pada lengan pendek kromosom Y (SRY), berperan
penting dalam pembentukan testis.
Sedangkan, gen-gen pada regio eukromatik lengan panjang kromosom Y (Yq11) berperan dalam spermatogenesis normal yaitu azoospermia factors yang terdiri atas AZFa, AZFb, dan AZFc3,4.
Struktur kromosom Y diduga
mempunyai pengaruh terhadap fenotip seks secara tidak langsung1,3. Beberapa laporan kasus abnormalitas kromosom Y pada individu-individu dengan anomali fenotip seks mendukung hal ini. Mutasi pada regio determinasi seksual (SRY) kromosom Y dapat menyebabkan seorang individu XY
menjadi seorang wanita dan sebaliknya seorang dengan kariotipe 45, X yang disertai insersi SRY akan berfenotip seperti seorang laki-laki. Aberasi struktural kromosom Y pada penderita ambigus genitalia yang pernah dilaporkan adalah kromosom cincin,
disentrik, isodisentrik lengan pendek
kromosom Y, dan delesi sebagian besar lengan panjang kromosom Y5,6,7. Sejumlah kasus dengan delesi kromosom Y yang pernah dilaporkan, menimbulkan dugaan bahwa kromosom ini memiliki kerentanan untuk kehilangan spontan materi genetik yang dikandungnya. Delesi kromosom dapat terjadi karena beberapa mekanisme berikut, yaitu: aberasi rekombinan antara daerah homolog atau sejumlah sekuen yang mirip antara kromosom X dan Y, aberasi
rekombinan intrakromosomal karena
pertukaran sister chromatid yang tidak seimbang, atau penyisipan pada saat replikasi DNA8.
Penelitian terdahulu pada beberapa
70
ukuran kromosom Y yang bervariasi di antara berbagai individu dan populasi etnik yang berbeda9. Secara sitogenetik, ukuran kromosom Y mendekati ukuran kromosom 22, walaupun seringkali ukuran kromosom Y lebih besar10.
Ukuran kromosom Y pada berbagai fenotip ambigus genitalia tampaknya juga bervariasi. Pada kasus ambigus genitalia dengan delesi dan duplikasi lengan panjang kromosom Y, ditemukan panjang kromosom Y dalam batas normal tetapi dengan C-band-negatif. Hal ini diduga karena adanya delesi
regio heterokromatin lengan panjang
kromosom Y sekaligus duplikasi regio eukromatin lengan pendek kromosom Y
penderita11. Preliminary study yang
dilakukan di Pusat Riset Biomedik FK
UNDIP untuk mengukur panjang kromosom
Y pada 20 orang bukan penderita ambigus genitalia, memperlihatkan panjang rata-rata 2,88µm dan simpang baku 0,53.
Sebagaimana telah diketahui bahwa pada kromosom Y terdapat faktor penentu fertilitas (gen AZFa, AZFb, dan AZFc), maka diduga laki-laki dewasa normal tidak mengalami kelainan pada gen ini sehingga memiliki kromosom Y yang normal secara struktural. Laki-laki dewasa normal yang mengandung kromosom Y normal pada sel tubuhnya dapat ditunjukkan dengan tidak adanya riwayat infertilitas primer maupun sekunder.
Berdasarkan hal tersebut di atas, dalam kondisi sarana pemeriksaan sitogenetik dan molekuler yang masih terbatas, deskripsi
profil sitogenetik kromosom Y pada laki-laki normal diharapkan bisa menjadi alternatif aspek sitogenetik yang dapat dianalisa dan menjadi dasar acuan untuk menganalisa abnormalitas kromosom Y pada kasus-kasus dengan anomali fenotip seks. Berdasarkan hal ini maka dilakukan penelitian untuk mengetahui profil sitogenetik kromosom Y
pada laki-laki normal. Penelitian ini
bertujuan untuk mengetahui gambaran profil sitogenetika kromosom Y, meliputi analisa adanya aberasi struktur dan pengukuran panjang kromosom Y, serta analisa profil regio heterokromatin kromosom Y pada laki-laki normal.
METODE PENELITIAN
Penelitian dilakukan di Pusat Riset Biomedik FK UNDIP, Semarang, dari Februari 2007 sampai dengan Mei 2008. Penelitian ini menggunakan metode dekriptif
dengan sampel yang diambil secara
consecutive random samplings sebanyak 30
orang. Laki-laki normal yang datang ke Pusat Riset Biomedik FK UNDIP dan bersedia menjadi subyek penelitian diminta data status marital dan fertilitasnya.
Bahan yang digunakan yaitu darah penderita masing-masing sebanyak 5 cc dalam tabung heparin, media MEM, PHA, FBS, colcemid, thymidin, KCL 0.075M, serta larutan carnoy’s untuk proses preparasi
kromosom. Pengecatan G-banding
menggunakan reagen – reagen berikut: H2O2
30%, larutan Trypsin 1% stok dalam buffer Hanks, larutan buffer Hanks (HBSS) pH
6,8-71
7,2, dan phosphate Buffer Saline (PBS) pH 6,8. Pengecatan C-banding menggunakan reagen-reagen berikut: HCl 0,2 N, 5% Ba(OH)2 ; 5 g Ba(OH)2 dalam 100mL aqua
bidest, 2 x SSC (0.3M sodium klorid, 0.03 M sodium sitrat, pH 7.0): 17.53 g NaCl dan 8.82 sodium sitrat dalam 1 L aqua bidest, dan Cat Giemsa 2% dalam buffer fosfat pH 6.8.
Pemeriksaan sitogenetik konvensional dilakukan dengan menggunakan limfosit
darah perifer dari subyek penelitian.
Pembuatan kariotip dilakukan dengan teknik
pengecatan G-banding dan C-banding.
Kariotip dari hasil pengecatan G-banding digunakan untuk menganalisa adanya aberasi struktur dan mengukur keseluruhan panjang kromosom Y. Analisa struktur kromosom Y dilakukan pada 8 metafase dan menghitung 20 metafase, jika ditemukan mosaic maka
penghitungan dilanjutkan hingga 40
metafase.
Ukuran panjang kromosom Y adalah
keseluruhan panjang kromosom yang
meliputi lengan panjang dan lengan pendek kromosom Y, dinyatakan dalam satuan mikrometer (µm). Pengukuran dilakukan
dengan menggunakan program Leica
CW4000 pada 3 metafase berbeda hasil pengecatan G-banding yang memenuhi kriteria banding level 550 berdasarkan indikator kualitas banding ISCN, yaitu: 12 - Pada lengan panjang kromosom 18 (18q)
terdapat 4 pita gelap
- Pada kromosom 10 terdapat split antara 10q21, 10q23, dan 10q25
- Pada kromosom 7, 7q33 dan 7q35 terlihat dengan jelas
- Pada kromosom 22, 22q13.2 dapat terlihat. Analisa profil regio heterokromatin kromosom Y dilakukan pada metafase hasil
pengecatan C-banding dengan cara
mengamati bagian bawah lengan panjang kromosom Y yang berwarna gelap. Ada atau tidaknya bagian bawah lengan panjang
kromosom Y yang berwarna gelap
dinyatakan sebgai C-band positive atau
c-band negative.
Data penelitian ini disajikan secara deskriptif, meliputi hasil kariotipe dan analisa struktur kromosom Y. Data ukuran panjang kromosom Y dari seluruh sampel dihitung reratanya, selanjutnya ditampilkan dalam tabel distribusi frekuensi meliputi kariotipe, rerata panjang kromosom Y dan profil regio heterokromatin kromosom Y.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil kariotip dan ukuran panjang
kromosom Y pada subyek penelitian
ditampilkan pada Tabel 1. Pengukuran panjang kromosom Y dilakukan pada metafase yang memenuhi kriteria banding
level 550. Contoh kariotipe dari hasil
pewarnaan G-banding yang memenuhi
kriteria banding level 550 disajikan pada Gambar 1.
Tabel 1. Hasil Kariotipe dan ukuran panjang kromosom Y sampel penelitian Kariotip Panjang kromosom Y (µm)
46,XY Minimum Maksimum Rata-rata SD
72
Gambaran contoh kromosom Y pada laki-laki normal dalam beberapa ukuran berbeda ditampilkan pada Gambar 2. Analisa regio heterokromatin kromosom Y sampel penelitian, menunjukkan semua kromosom Y memiliki C-band positive (Gambar 3).
Tabel 1 memperlihatkan hasil
pemeriksaan kromosom pada 30 orang sampel penelitian adalah normal, yaitu semua memiliki kariotip 46XY dan pada sampel tidak ditemukan aberasi struktur kromosom Y.
Hal ini menunjukkan kesesuaian data
riwayat fertilitas yang menjadi dasar
pengambilan sampel. Sebagaimana dipahami, perkembangan prenatal organ genital
laki-laki dan perempuan dan perempuan
memerlukan peran krusial dari kromosom Y (Gambar 4).
Gambar 1. Contoh kariotipe dari hasil pewarnaan G-banding yang memenuhi
kriteria banding level 550
Gambar 3. Kromosom Y pada laki-laki normal dalam ukuran berbeda
Gambar 3. Metafase dengan pewarnaan C-banding, tanda panah menunjukkan kromosom Y dengan C-band positive
73
Kromosom Y adalah kromosom terkecil pada manusia yang diperlukan untuk perkembangan seksual dan spermatogenesis
14
. Kromosom Y sangat sedikit mengandung gen aktif dan sebagian besar strukturnya terdiri atas heterokromatin3,14. Kromosom Y merupakan penentu kelamin pada manusia yang mengandung 58 juta pasang basa dan merupakan 0,38% dari total DNA dalam sel3,14.
Sebuah penelitian pada beberapa kelompok ras9 melaporkan tentang ukuran kromosom Y yang bervariasi di antara berbagai individu dan populasi etnik yang
berbeda. Secara sitogenetik, ukuran
Penelitian profil kromosom Y pada laki-laki normal perlu dilakukan dengan membatasi populasi berdasarkan etnis agar dapat
mengetahui adanya perbedaan panjang
kromosom Y antar populasi etnis di Indonesia.
Kromosom Y mendekati ukuran
kromosom 22, walaupun seringkali ukuran kromosom Y lebih besar 3,14. Beberapa literatur menyebutkan estimasi rata-rata ukuran kromosom Y adalah ~60 mbp 13,14,15.
Berdasarkan penelitian terdahulu, telah diketahui bahwa ukuran panjang kromosom Y berbeda di antara berbagai populasi. Sedangkan, sampel dalam penelitian ini tidak ditentukan secara khusus berdasarkan suku atau populasinya, hanya mewakili populasi laki-laki normal. Berdasarkan hal ini perlu dilakukan penelitian dengan sampel yang dibatasi berdasarkan etnis, sehingga dapat diketahui ada atau tidaknya perbedaan ini di antara populasi yang berbeda.
Analisa struktur kromosom Y
dilakukan dengan teknik pewarnaan
C-banding yang merupakan teknik primer
untuk mengidentifikasi variasi polimorfisme kromosom, seperti untuk memeriksa adanya penambahan atau pengurangan panjang regio
heterokromatin pada kromosom 1qh,
9qh,16qh, dan Yqh12. Regio heterokromatin sebuah kromosom adalah regio yang tercat
gelap (heteropiknosis positif) pada
pemeriksaan sitogenetika12,14.
Hetero-kromatin terdiri atas dua tipe, yaitu heterokromatin fakultatif dan konstitutif 12. Heterokromatin konstitutif kaya dengan DNA repetitif yang mengandung sangat sedikit gen-gen struktural dan bersifat sangat polimorfik. Regio ini dapat dilihat secara sitogenetik dengan teknik pengecatan
C-banding atau disebut sebagai C-bands positive 12.
Hasil penelitian ini menunjukkan kromosom Y pada seluruh sampel memiliki
c-band positive. Sebagaimana telah diketahui
bahwa kromosom Y pada individu normal
memperlihatkan setengah dari lengan
Gambar 4. Bagan pengaruh kromosom Y pada diferensiasi gonad
74
panjangnya bersifat C-band positive. Pada manusia regio ini bersifat sangat polimorfik
15,16
. Gambar 5 memperlihatkan gambaran
skematik regio eukromatik dan
heterokromatik pada kromosom Y.
Pengukuran panjang regio
heterokromatin lengan panjang kromosom Y tidak dilakukan pada penelitian ini, karena
keterbatasan sarana untuk melakukan
pengukuran tersebut. Laporan sejumlah penelitian terdahulu menyebutkan bahwa panjang regio heterokromatin lengan panjang kromosom Y di antara berbagai populasi berbeda-beda. Panjang regio heterokromatin ini dinyatakan sebagai Yqh + (positif) atau Yqh – (negatif) atau band positive dan
C-band negative. Sebuah laporan penelitian
juga menyebutkan adanya satu individu dengan panjang regio heterokromatin yang berbeda dalam 2 populasi selnya, yaitu Yqh
positive dan Yqh negative. Hasil ini
diperoleh dengan memeriksa kromosom pada 30 metafase berbeda dari 2 media kultur yang berbeda. Pada penelitian ini, analisis
struktur kromosom Y dilakukan pada 8 metafase berbeda, tetapi secara kualitatif tidak ditemukan perbedaan panjang regio heterokromatin kromosom Y antar metafase yang berbeda.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan gambaran profil sitogenetik kromosom Y pada laki-laki normal adalah: - Tidak ada aberasi struktur kromosom Y - Rerata panjang kromosom Y adalah 2,54
µm (SD 0.31)
- Regio heterokromatin pada bagian bawah lengan panjang kromosom Y tercat gelap (C-band positive).
DAFTAR PUSTAKA
1. MacLaughlin DT and Donahoe PK. Sex
Determination and Differentiation. Review article in N Engl J Med 2004; 350:367-378
2. Berkovitz GD, Seeherunvong T.
Abnormalities of gonadal differentiation. Bailliere’s clinical endocrinology and metabolism 1998; 12 (1) : 133-142
3. Jobling MA and Smith CT. The Human Y
Chromosome: An Evolution marker Comes of Age. Review Article in Nature 2003; available
on www.nature.com
75
4. Passarge E. Color Atlas of Genetics 3rdEdition. Thieme Stuttgart, New York 2007:
200-204
5. Ferlin A, Moro E, Rossi A, Dallapiccola and Foresta. The human Y chromosome’s azoospermia factor b (AZFb) region: sequence, structure, and deletion analysis in infertile men. J Med Genet 2003; 40: 18-24
6. Mundhofir FEP, Winarni TI, Juniarto AZ, Faradz SMH. Ring Chromosome Y in a boy
with genital anomaly, a case report. Publish
in PAAI, Semarang 2006
7. Kim S, Jung S, Kim H. Chromosome
Abnormalities in a referred Population for Suspected Chromosomal Aberrations: A Report of 4117 Cases. J Korean Med Sci
1999; 14: 373-376
8. Göllü G, Yildiz RV, Bingol KM, Yagmurlu A,Senyu¨ cel, Tanju A, Go¨kcora H, Dindar H. Ambiguous Genitalia: An Overview of 17
years Experience. J Ped Surg, 2007; 42:
840-844
9. Barbosa AAL, Cavalli IJ, Abel K, Santos M and Azevêdo ES. Family names and the
length of the Y chromosome in Brazilian blacks. Braz. J. Genet 1997; vol. 20(1)
10. Liow SL, Yong EL, and Ng SC. Prognostic
value of Y Deletion Analysis. Hum. Reprod.
2001; 16 (1): 9-12
11. Thangaraj K, Subramanian S, Reddy AG, Singh L. Unique Case of Deletion and
Duplication in the Long Arm of the Y Chromosome in an Individual With Ambiguous Genitalia. Research Letter in Am
J Med Gen 2003;116A: 205–207
12. Barch MJ. The AGT Cytogenetics Laboratory
Manual. Lippincot-Raven Publisher, Philadelpia, New York 1991; 10-11; 180-183
13. Sadler TW. Langman’s Medical Embriology.
9th ed. Pennsylvania: Lippincott Williams & Wilkins 2000: 319-339
14. Jobling MA, et al. Structural variation on the short arm of the human Y chromosome: recurrent multigene deletions encompassing Amelogenin Y. Human Mol Gen 2007;16
3:307-316
15. Duell T, et al. Interstitial and terminal
deletion of chromosome Y in a male individual with cryptozoospermia. Molecular
Human Reproduction 1998;4: 325–331 16. Jakubowski L, et al. Molecular analysis of Y
chromosome long arm structural instability in patients with gonadal dysfunction. Clin Genet 2000: 57: 291–295