BAB II
TINJUAN PUSTAKA
II.1 Virus Dengue
Virus Dengue merupakan salah satu virus yang termasuk dalam famili Flavividae. Virion Dengue merupakan partikel sferis dengan diameter nukleokapsid 30nm dan ketebalan selubung 10 mm, sehingga diameter virion kira-kira 50 nm. Genon virus Dengue terdiri dari asam ribonuleat berserat tunggal , panjangnya kira-kira 11 kilibasa. Genon terdiri dari protein structural dan protein non structural, yaitu gen C mengkode sintesa nukleokapsid (Capsid), gen M mengkode sintesa protein M (Membran) dangan E mengkode sentesa glikoprotein selubung (Envelope) (Levinson, 2000).
Virus Dengue adalah virus dengan untaian tunggal, virus RNA (famili Flaviviridae) yang muncul dengan empat serotype antigen yang berbeda. Setiap serotype secara genetik memiliki perbedaan. Meskipun infeksi secara umum (terutama infeksi primer) simtomatik sama, seluruh tipe virus ini berhubungan dengan demam Dengue, dan demam adalah gejala minor. Infeksi primer menghasilkan imunitas jangka panjang terhadap infeksi sekunder dengan serotype lainnya. Hal ini meningkatkan dalam resiko kebanyakan hasil dari reaksi silang antibodi dan sel T yang meningkatkan tingkat infeksi dan secara langsung melibatkan patifisiologi demam berdarah Dengue (Carrington et al., 2005).
Genus Flavivirus (famili Flaviviridae) terdiri dari lebih kurang mendekati 70 untaian tunggal, virus RNA. Virion berukuran mendekati 50nm dan memiliki 3 struktur protein, yang lebih besar berukuran 49 dan 16,5 kDa protein yang mengalami glikosidasi dan berhubungan dangan envelop, di mana yang lebih kecil berukuran 13 kDa protein yang berukuran 16,5 kDa lebih besar dari yang terlihat secara khusus pada Flavivirus (Carrington et al., 2006).
ІІ.2. Vektor Pnyakit
Infeksi DD/DBD dapat ditularkan pada manusia melalui gigitan vector nyamuk Aedes aegypti dan Aedes albopictus betina (Husaini, 2003).
Di Indonesia, nyamuk ini tersebar di seluruh Indonesia (terutama pada musim penghujan), kecuali di daerah pada ketinggian di atas 1000m dari permukaan laut. Nyamuk betina mengisap darah vertebrata sedangkan nyamuk jantan menghisap air madu atau air gula. Bila sudah dewasa, nyamuk mempunyai sayap berwarna hitam, badan dan kaki berbercak putih, lalu bertelur di mana saja di wadah-wadah penampungan air. Nyamuk ini mempunyai jarak terbang kira-kira 50 m dan menggigit terutama siang hari, di dalam rumah atau tempat-tempat yang tidak diterangi sinar matahari (DEPKES RI, 2004).
ΙΙ.3. Manifestasi Klinis Infeksi Virus Dengue
Infeksi virus Dengue sering salah diagnosa dengan penyakit lain seperti flu atau tifoid. Hal ini disebabkan karena infeksi virus Dengue biasa bersifat asimptomatik atau tidak jelas segalanya, dari tanpa gejala, demam ringan yang tidak spesifik, DD, atau bentuk yang lebih berat yaitu DBD dan SSD (Tumbelaka, 2004). BILA dibuat diagram, tampak sebagai berikut:
Infeksi virus Dengue
Asimptomatik Simptomatik
Undifferentiated fever Demam dengue: Tanpa perdarahan
Dengan perdarahan
Demam berdarah dengue : Tanpa Syok Dengue shock Syndrome
II 3.1 Demam Dengue
Demam dengue adalah pnyakit akut yang ditandai oleh panas 2-7 hari, disertai 2 atau lebih gejala klinik nerikut:
1) Sakit kepala 2) Nyeri retro orbital 3) Myalgia atau atralgia 4) Ruam
5) Manifestasi perdarahan, tourniquet test + dan petechiae 6) Leucopenia
Pada penderita anak-anak, demam dengue biasanya bermanifestasi ringan, sedang pada orang dewasa dapat disertai nyari berat pada tulang, persendian dan otot, serta pada masa konvalesens melalui priode prolonged fatique, kadang-kadang disertai depresi (Hadinegoro, 2004).
II.3.2. Demam Berdarah Dengue
Demam berdarah dengue adalah infeksi virus dengue dengan gejala seperti di atas, disertai:
a. Manifestasi perdarahan yang lebih nyata, seperti: 1) Uji tourniquet positif
2) Petchiae, echimosis atau purpura
3) Perdarahan mukosa, epistaktis atau perdarahan gusi b.Trombositopenia (≤100.000/mm3)
c. Kebocoran plasma disebabkan karena meningkatnya permeabilitas kapiler, dengan ditandai oleh:
1) Meningkatnya hematokrit ≤ 20%
2) Efusi pleura atau asites ( Hadinegoro, 2004).
II.3.3. Sindrom Syok Dengue
Sindrom Syok Dengue adalah manifestasi klinis demam berdarah dengue yang disertai tanda-tanda kegagalan sirkulasi berupa:
1. Penyempitan tekanan nadi (≤20mmHg) 2. Frekuensi nadi cepat dan kecil
3. Hipotensi 4. Akral dingin
Beberapa karakteristik manifestasi klinis infeksi Dengue sacara umum berupa: nyeri kepala 98%, lemah badan 88%, maul-muntah 84%, nyeri epigastrium 78%, nyeri sendi/otot 69%, petechie 64%, epistaktis/perdarahan gusi 36%, bercak darah (rash) 22%, nyeri retro orbital 17%, hepatomegali 14%, hematemesis/melena 14%, faringitis 12%, dan limfadenopati 12%,(Hadinegoro, 2004).
II.4. Diagnosa DD dan DBD
Untuk menegakkan diagnosa klinis infeksi virus dengue digunakan kriteria WHO 1997 yaitu dijumpainya demam tinggi dengan onset yang akut, hemokonsentrasi (>20%), manifestasi perdarahan, hepatomegali, hipotensi dan syok. Diagnosaklinis DBD ditetapkan berdasarkan penetapan derajat tingkat keparahan penderita secara klinis dengan menggunakan kriteria WHO 1997 yang terbagi atas 4 tingkatan:
Derajat 1: Ditandai dengan adanya demam mendadak 2-7 hari, keluhan yang tidak spesifik dan uji tourniquet positif.
Derajat 2: Terdapat seluruh manifestasi DBD derajat 1 disertai perdarahan spontan pada kulit atau tempat lain.
Derajat 3: Terdapat seluruh manifestasi DBD derajat 2 disertai kegagalan sistem sirkulasi yaitu: frekuensi nadi cepat, lemah, tekanan nadi sempit (≤20mmHg) atau hipotensi,kulit teraba lembab, dingin dan penderita gelisah.
Derajat 4: Terdapat seluruh manifestasi DBD derajat 3disertai manifestasi syok, dimana tekanan darah tidak terukur dan nadi tidak teraba.
Manifestasi laboratorium dapat dilihat dari beberapa parameter seperti terjadinya leukopenia dengan jumlah neutrofil menonjol, limfosit atipikal(15%),
trombositopenia (∑ trombosit ≤ 100.00/mm3), homokonsentrasi, abnormalitas, pembekuan darah, hiponetremia, hipoalbuminemia dan peningkat kadar SGOT/SGPT (Hadinegoro, 2004).
Pemeriksaan serologi adalah salah satu alat untuk membantu membuat konfirmasi diagnosa infeksi virus Dengue. Pemeriksaan yang banyak dipakai dalam praktek adalah hemaglutinasi inibisi dan dengan menggunakan Enzime-linked Immunosorbent Assay (ELISA)(DEPKES RI, 2004).
II.4.1. Hemaglutinasi Inhibisi
Sampai saat ini uji hemaglutinasi inhibihi (HI) masih menjadi patokan baku WHO untuk mengkonfirmasi dan klarifikasi jenis virus Dengue. Pemeriksaan ini dilakukan berdasarkan cara Clark & Cassal, dimana menemukan sepasang serum yang diambil saat akut (pada waktu penderita datang) dan saat konvalesens (2-3
minggu dari saat sakit), dengan interval minimal 1 minggu dari pengambilan pertama. Prinsip metode ini adalah mengukur kadar Immunuglobulin(Ig), yaitu IgM dan IgG melalui prinsip adanya kemampuan antibodi antidengue menghambat reaksi hemaglutinasi darah angsa. Pemeriksaan IgM dan IgG dapat untuk menetukan jenis infeksi virus dengue apakah primer atau sekunder. Pada anak diatas 1 tahun infeksi primer biasanya terkait dengan penampilan klinis ringan, sedang infeksi sekunder dapat tampil dengan penampilan klinis berat.
II.4.2. Uji ELISA anti Dengue
Dikatakan uji Enzime-linked immunusorbent Assay (ELISA) anti dengue ini mempunyai sensivitas yang sama dengan uji hemaglutinasi inhibit. Prinsip mtode ini adalah mendeteksi adanya IgM dan IgG dalam serum penderita dengan cara menangkap antibodi yang beredar dalam darah penderita. Uji ELISA ini tidak mengadakan reaksi silang dengan golongan flavivirus lain, sehingga metode ini lebih spesifik dibandingkan metode hemaglutinasi inhibit.
II.5. RT-PCR
Polymerase Chain Reaction (RCI)adalah suatu metode biologi molekuler untuk mengamplifikasi (membuat banyak kopian) Deoxyribo Nucleic Acid (DNA) tanpa menggunakan organisme hidup. PCR biasanya digunakan dalam penelitian di laboratorium biologi dan kedokteran, seperti mendeteksi penyakit herediter, dignosis penyakit infeksi, cloning jen dan uji paternitas.
II.5.1. Sejarah RT-PCR
PCR ditemukan pertama kali oleh Kary Mulis pada tahun 1985, suatu prosedur yang efektif untuk pelipatgandaan sekuen DNA target dan dapat memperoleh 106 - 10 9 kali jumlah DNA target awal. Proses pelipatgandaan ini dikenal dalam istilah biologi molekuler sebagai amplifikasi DNA.
RT-PCR merupakan modifikasi dari PCR , dimana yang diamplifikasi berupa m-RNA. Mula-mula RNA diubah dulu menjadi DNA dengan menggunakan reverse trnscriptase yang dapat mensistensis DNA dengan cetakan RNA dan menghasilkan DNA yang dikenal dengan nama Cdna (Complement DNA). Hanya enzim jenis ini yang dapat mensistensis DNA dengan cetakan RNA karena polymerase DNA hanya dapat mensistensi dengan menggunakan cetakan DNA. Setelah DNA terbentuk, maka DNA itu dapat diamplifikasi seperti umumnya proses pada PCR. Jadi, RT-PCR digunakan untuk mengamplifikasi RNA yang kestabilannya jauh lebih rendah dibandingkan DNA (Sudjadi, 2008).
II.5.2. Pengunaan PCR
PCR digunakan untuk mengamplifikasi ranati pendek pada bagian tertentu dari rantai DNA. Proses PCR biasanya hanya dapat mengkopi hingga 10 kb (kb = kilo basa, 1 kb = 1000 pasang basa). Metode PCR tertentu dapat meng-copy hingga 40 kb,yang mana masih sangat kurang dibandingkan dengan kromosom DNA sel eukariotik, contohnya sel manusia berisi kira-kira 3 milyar pasang basa.
1) DNA cetakan, merupakan bagian fragmen DNA yang akan diamplifikasi. 2) Primer, merupakan bagian tertentu untuk memulai dan mengakhiri fragmen
yang akan diamplifikasi.
3) DNA polimerase merupakan enzim yang digunakan untuk mengkopi DNA. 4) Nukleotida dimana DNA polimerase membangun DNA baru.
5) Buffer, yang membarikan lingkungan kimia yang cocok untuk DNA polimerase. Reaksi PCR dilaksanakan dalam thermocycler, dimana mesin PCR memanaskan dan mendinginkan tabung-tabung reaksi yang ada di dalamnya pada suhu tertentu yang dibutuhkan untuk setiap tahap reaksi.
II.5.3. Prosedur
Proses PCR berisi satu sel yang terdir 20-30 siklus.Setiap siklus terdiri dari 3 tahap. Pertama, rantai ganda DNA harus dipanaskan hingga 96°C untuk memisahkan rantai. Langkah ini disebut melting : dimana ikatan hidrogen yang menghubungkan dua rantai DNA dipecahkan. Sebelum langkah pertama ini, lama pemanasan sering diperpanjang untuk memastikan bahwa DNA cetakan dan primer telah terpisa sempurna masing-masing menjadi rantai tunggal.
Setelah rantai DNA terpisah, temperatur diturunkan sehingga primer dapat menempelkan rantainya pada rantai tunggal DNA. Langkah ini disebut annealing. Temperatur pada langkah ini tergantung pada primer dan biasanya 5°C di bawah temperatur melting. Temperatur yang salah waktu langkah annealing dapat
menyebabkan primer tidak semuanya terikat pada DNA cetakan atau terikat tidak teratur.
Akhirnya DNA polimerase harus mengisi rantai yang hilang. Ini dimulai pada primer dan terus sepanjang rantai DNA. Langkah ini disebut elongation. Temperatur elongation tergantun DNA polimerase. Waktu untuk langkah ini tergantung pada DNA polimerase dan panjang rantai DNA yang diamplifikasi.
Proses PCR terdiri dari langkah-kangkah berikut: Langkah 1 : Initialization
Pemanasan campuran pada temperatur 92°C selama 3 menit untuk memastikan rantai DNA dan primers terurai. DNA polimerase dapat diberikan pada tahap ini atau ditambahkan setelahnya.
Langkah 2 : Melting
Pemanasan pada temperatur 92°C selama 30 detik. Untuk setiap siklus, waktu tersebut biasanya cukup untuk menguraikan DNA.
Langkah 3 : Annealing
Pemanasan pada temperatur 53°C selama 30 detik. Langkah 4 : Elongation
Pemanasan pada temperatur 72°C selama 1 menit. Langkah 5 : Step 2-5 diulang 40 kali.
Ini berguna bila PCR dimulai pada sore hari sebelum meninggalkan laboratorium, sehingga dapat berproses spanjang malam. DNA tidak akan rusak pada temperatur 7°C setelah semalaman.
Hasil PCR dapat diidentifikasikan dengan menggunakan agarose gel electroforesis. Agarose gel electroforesis adalah suatu prosedur yang terdiri dari pengisian DNA dalam agar agarose dan kemudian menghubungkan arus listrik pada agar terrsebut. Sebagai hasilnya, rantai DNA yang lebih kecil bergerak lebih cepat dari pada rantai yang lebih besar melalui agar menuju arus positif. Ukuran dari hasil PCR ditentukan dengan membandingkannya dengan suatu “ tangga DNA” yang ukurannya sudah diketahui yang dimasukkan juga ke dalam agar.
II.5.4. Reverse Transcription
Reverse transcription adalah mengubah suatu molekul RNA menjadi DNA komlementnya. Proses ini membutuhkan suatu enzim yang disebut : reverse transcriptase, yang diambil dari suatu retrovirus seperti : AMV (Avian Myeloblastosis Virus). Enzim yang biasanya secara bersama berhubungan dengan enzim reverse transciptase adalah enzim RNA-dependent DNA polymerase dan enzim DNA-dependent DNA polrmerase, yang bekerja sama membentuk transcriptase dengan arah yang berlawanan dengan arah stndar. Reverse transciptase adalh enzim yang dihasilkan oleh semua retrovirus untk mentranskrip informasi genetik virus dari RNA menjadi DNA, sehingga dapat berintegrasi ked alam genom host. (Sopian, 2006)
Dalam penelitian, reverse transcriptase menyebabkan data yang dikode pada rantai RNA dapat diubah menjadi bentuk DNA dan digunakan dalam PCR, sebab PCR tidak dapat mereplikasi molekul RNA secara langsung. Kombinasi proses reverse transcriptase dan PCR disebut RT-PCR (Sudjadi,2008).
