DAFTAR PUSTAKA
1. Ochiai RL, Acosta CJ, Danovaro-holliday MC, et al. A Study of Typhoid Fever in Five Asian Countries: Disease Burden and Implications for Controls. Bull World Health Organ. 2008;86:260-268.
2. Vollaard AM, Verspaget HW, Ali S, et al. Helicobacter Pylori Infection and Typhoid Fever in Jakarta, Indonesia. Epidemiol Infect. 2006;134:163-170.
3. Ibarra JA, Steele-mortimer O. Microreview Salmonella The Ultimate Insider: Salmonella Virulence Factors that Modulate Intracellular Survival. Cell Microbiol. 2009;11(11):1579-1586.
4. Mcsorley SJ, Cookson BT, Jenkins MK. Characterization of CD4 + T Cell Responses During Natural Infection with Salmonella typhimurium. J Immunol. 2016;164:986-993.
5. Mittru H, Kaufmann SHE. Immune Response to Infection with Salmonella typhimurium in Mice. J Leukoc Biol. 2000;67:457-463.
6. Munasir Z. Respons Imun Terhadap Infeksi Bakteri. Sari Pediatr. 2001;2(4):193-197.
7. Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Cellular and Molecular Immunology. 7th ed. Philadelphia: Elsevier Saunders. 2012.
8. Hatta M. Enteric Fever in Endemic Areas of Indonesia: An Increasing Problem of Resistance. J Infect Dev Ctry. 2008;2(4):279-282.
9. Astuti IP, Munawaroh E. Karakteristik Morfologi Daun Sirih Merah: Piper crocatum Riutz & Pav dan Piper porphyrophyllum N.E.Br. Koleksi Kebun Raya Bogor. Berk Penel Hayati Ed Khusus. 2011;7A:83-85.
10. Agromedia R. Buku Pintar Tanaman Obat: 431 Jenis Tanaman Penggempur Penyakit. Jakarta: PT Agromedia Pusstaka; 2008.
11. Lister INE, Viany RD, Nasution AN, Zein R. Antimicrobial Activities of Methanol Extract of Sirih Merah (Piper crocatum L.) lleaf. 2014;6(12):650-654.
12. Hartini YS, Wahyuono S, Widyarini S. Uji Aktivitas Fagositosis Makrofag Fraksi-fraksi dari Ekstrak Metanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) Secara In Vitro. 2013;11(2):108-115.
13. Hartini YS, Wahyuono S, Widyarini S. In vivo Immunomodulatory Effect and Histopathological Features of Mouse Liver and Kidney Treated with Neolignans Isolated from Red Betel (Piper crocatum Ruiz & Pav) Leaf. 2014;13(10):1609-1614.
14. Hermiati, Rusli, Manalu NY, Sinaga MS. Ekstrak Daun Sirih Hijau dan Merah sebagai Antioksidan pada Minyak Kelapa. J Tek Kim USU. 2013;2(1):37-43.
15. Astuti I, Munawaroh E, Rahayu E, P A, Sumanto. Heteroblastic Development in Six Species of Wild Piper. Ber Biol - J Ilmu-ilmu Hayati. 2011;10:621-625.
16. Suhermanto. Profil Flavonoid, Tanin dan Alkaloid dari Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum). Skripsi. Bogor: Institut Pertanian Bogor. 2013. 17. Alfarabi M, Bintang M, Safithri M. The Comparative Ability of
Antioxidant Activity of Piper crocatum in Inhibiting Fatty Acid Oxidation and Free Radical Scavenging. 2010;17(4):201-204.
18. Holderness J, Jackiw L, Kimmel E, et al. Select Plant Tannins Induce IL2R Up-Regulation and Augment Cell Division in T Cells. J Immunol. 2007;179:6468-6478.
19. Kumar S, Pandey AK. Chemistry and Biological Activities of Flavonoids: An Overview. Sci World J. 2013;2013.
20. Rich RR. Clinical Immunology: Principle and Practice. 4th ed. China: Elsevier Saunders; 2013.
21. Subowo. Imunobiologi. 3rd ed. Jakarta: Sagung Seto. 2014.
22. Shipkova M, Wieland E. Surface Markers of Lymphocyte Activation and Markers of Cell Proliferation. Clin Chim Acta. 2012;413(17-18):1338-1349.
23. Parslow TG, Stites DP, Terr AI, Imboden JB. Medical Immunology. 10th ed. Singapore: Mc Graw Hill. 2003.
24. Sjamsuhidajat R. Buku Ajar Ilmu Bedah. 3rd ed. Jakarta: EGC. 2010. 25. Petroianu A. Surgical Anatomy of the Spleen. In: The Spleen. Brazil:
Bentham Science Publisher. 2011:117-113.
26. Paul WE. Fundamental Immunology. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, A Wolter Kluwer Bussiness. 2013.
27. Gartner LP, Hiatt JL. Concise Histology. China: Elsevier Saunders. 2011. 28. Elliott T, Worthington T, Osman H, Gill M. Mikrobiologi Kedokteran &
Infeksi. 4th ed. Jakarta: EGC. 2013.
29. Santos RL, Zhang S, Tsolis RM, Kingsley RA. Animal Models of Salmonella Infections: Enteritis Versus Typhoid Fever. Microbes Infect. 2001;3:1335-1344.
30. Brenner FW, Villar RG, Angulo FJ, Tauxe R, Swaminathan B. Salmonella Nomenclature. J Clin Microbiol. 2000;38(7):2465-2467.
31. Kaur J, Jain SK. Role of Antigens and Virulence Factors of Salmonella enterica serovar Typhi in Its Pathogenesis. Microbiol Res. 2012;167(4):199-210.
32. Zenewicz LA, Shen H. Innate and Adaptive Immune Responses to Listeria monocytogenes: A Short Overview. Microbes Infect. 2008;9(10):1208-1215.
33. Badovinac VP, Harty JT. Adaptive Immunity and Enhanced CD8 + T Cell Response to Listeria monocytogenes in the Absence of Perforin and IFN- γ. J Immunol. 2000;164:6444-6452.
34. Sulistini RP. Pengaruh Ekstrak Lompong Mentah ( Colocasia Esculenta L Schoot ) Terhadap Aktivitas Fagositosis Dan Kadar NO ( Nitrit Oksida ) Mencit Balb / C Sebelum Dan Sesudah Terinfeksi Listeria Monocytogenes. Skripsi. Semarang: Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro. 2015. 35. Jiao Y, Wen J, Yu X, Zhang D. Influence of Flavonoid of Astragalus
Membranaceus’s Stem and Leaves on The Function of Cell Mediated Immunity in Mice. Chinese J Integr Tradit West Med. 2001;7(2):117-120. 36. Ridwan E. Etika Pemanfaatan Hewan Percobaan dalam Penelitian
37. WHO. Research Guidelines for Evaluating the Safety and Efficacy of Herbal Medicines. Manila: WHO Regional Office for the Western Pacific. 1993.
LAMPIRAN 1. CARA PEMBUATAN EKSTRAK DAUN Piper crocatum (METODE MASERASI)
A. Alat :
1. Erlen meyer 1 liter 2. Cawan porselin 3. Pipet tetes 4. Beker glass 5. Gelas ukur 6. Neraca analitik 7. Water bath 8. Corong
9. Kertas saring/kain flannel B. Bahan :
1. Daun Piper crocatum (sirih merah) 2. Pelarut etanol 70%
3. Aquadest C. Cara kerja :
1. Daun sirih merah dicuci bersih hingga hilang kotorannya kemudian dirajang-rajang, lalu dikeringkan dibawah sinar matahari tetapi tidak terkena langsung sinarnya (diatasnya ditutup kain/kertas)
Sinar langsung pada proses pengeringan akan merusak zat aktif yang ada dalam sampel, karena pengaruh ultraviolet. Tujuan pengeringan
adalah untuk mengurangi/menghilangkan kandungan air yang ada dalam sirih merah).
2. Timbang seksama sampel Daun sirih merah yang telah kering masing-masing : sampel (I) +/- 62,25 gr, sampel (II) +/- 60,15 gr, sampel (III) +/- 60,5 gr, sampel (IV) +/- 59,86 gr dan samper (V) +/- 50,83 gr. 3. Masukkan kelimanya dalam empat Erlenmeyer ukuran 1 liter.
4. Tambahkan kelimanya pelarut etanol 70% sampai sampel terendam semua.
5. Tutup dan gojok rendaman, simpan ditempat gelap dan biarkan rendaman tersebut selama 24 jam.
6. Setelah 24 jam, saring rendaman tersebut dengan kertas saring/kain flannel dan tuangkan dalam cawan porselin.
7. Uapkan diatas water bath dengan suhu 60-70° atau diangin-anginkan sampai air dan pelarutnya hilang dan didapat ekstraknya.
8. Sisa rendaman ditambah pelarut dengan volume yang lebih kecil dari yang pertama dan dilakukan percobaan yang sama.
9. Proses rendaman dilakukan 3 kali atau lebih dengan penambahan volume pelarut yang semakin kecil.
10.Timbang ekstrak yang diperoleh.
Keterangan :
Berat sampel keseluruhan : 293,6 gr Pelarut yang dibutuhkan : 6,3 liter Ekstrak yang diperoleh : 43,17 g
LAMPIRAN 2. PERHITUNGAN DOSIS EKSTRAK DAUN Piper crocatum
Dosis Piper crocatum (z) sebagai imunostimulan13
- Senyawa aktif : neolignans (crocatidin dan deacetyl crocatidin) - Diperoleh dari fraksi ekstrak metanol (ekstraksi bertingkat)
- 8,26 kg daun basah dikeringkan menjadi 1,9 kg (23%) kemudian diekstrak metanol mendapat 224,03g (= 11,79%). Dari 2,12g ekstrak tadi dilakukan fraksinasi didapatkan neolignan 24mg (=1,13%)
- Telah dilakukan penelitian menggunakan neolignan dosis 2.5; 5 dan 10mg/kgBB
Pada Dosis 5mg/kgBB neolignan
= 5 / 1,13% = 442,5 mg/kgBB ekstrak metanol (= 8,85mg/mencit) = 442,5 / 11,79% = 3753 mg/kgBB daun kering (= 75mg/mencit) = 3753 / 23% = 16317 mg/kgBB daun basah (= 3263mg/mencit) Dosis perlakuan:
Dosis 1 : Ekstrak etanol 10 mg/mencit (setara 3846mg/kgBB) Dosis 2 : Ekstrak etanol 30 mg/mencit (=antilog ½ dosis 1) Dosis 3 : Ekstrak etanol 100 mg/mencit (=antilog 1 dosis 1)
LAMPIRAN 3. PROSEDUR ISOLASI DAN KULTUR LIMFOSIT LIMPA MENCIT (Mahardika, 2003)
Alat :
1. Gunting dan pinset
2. Spuit 10 mL steril dengan jarum ukuran 18 atau 20 gauge 3. Tabung sentrifus 50 mL steril
4. Cawan Petri 5. Pipet Pasteur steril 6. Tabung berlapis silicon 7. Inkubator CO2 8. Hemacytometer 9. Refrigerated centrifuge Bahan : 1. Ether 2. Alkohol 70%
3. Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (GIBCO) 4. Tris Buffered Ammonium Chlorid
5. Fetal Bovine Serum, FBS Cara kerja :
1. Mencit dianesthesia dengan ether selanjutnya mencit diterminasi dengan disklokasi cervical mencit.
2. Selubung peritoneum dibuka, kemudian limpa diangkat dan diletakkan pada cawan petri steril diameter 50 mm yang telah diisi 5 mL medium RPMI 1640.
3. Medium disemprotkan ke dalam limpa untuk mendapatkan suspensi sel tunggal. Setelah itu, dimasukkan ke dalam tabung sentrifus 10 mL untuk disentrifus pada 1200 rpm 4°C selama 10 menit.
4. Pellet yang didapat, diresuspensikan dalam 2 mL Tris Buffered Ammonium Chlorid untuk melisiskan eritrosit.
5. Sel dicampur menggunakan pipet dan dikocok, kemudian didiamkan pada suhu ruangan selama 2 menit.
6. Tambahkan 1 mL Fetal Bovine Serum pada dasar tabung menggunakan pipet. 7. Suspensi tersebut disentrifus pada 1200 rpm 4°C selama 5 menit, dan
supernatannya dibuang.
8. Pellet dicuci dua kali dengan RPMI dengan cara dipipet berulang-ulang dan disentrifus pada 1200 rpm 4°C selama 5 menit.
9. Supernatan dibuang dan pellet yang didapat diresuspensikan pada 4 mL medium komplet.
10.Suspensi sel dikultur pada cawan petri diameter 50 mm dalam inkubator CO2
5%, 37°C selama 2 jam.
11.Supernatan yang berisi sel-sel limfosit diambil dengan menggunakan pipet dan ditampung dalam tabung sentrifus.
12.Supernatan kemudian disentrifus pada 1200 rpm 4°C selama 5 menit. Supernatannya dibuang dan limfosit diresuspensikan dengan 1 mL medium komplet.
13.Hitung sel menggunakan hemositometer dan ditentukan viabilitasnya dengan trypan blue sehingga didapat suspensi sel dengan kepadatan 106 sel/mL.
LAMPIRAN 4. PROSEDUR UJI PROLIFERASI LIMFOSIT LIMPA DENGAN METODE MTT ASSAY (Chapdelaine, 2001)
Alat &Bahan : 1. Limfosit 2. Phytohaemaglutinin 3. Microplate 96 well 4. Inkubator CO2 5. MTT 6. HCl isopropanol 7. ELISA reader Cara Kerja :
1. Limfosit dikultur pada mikroplate 96 dengan volume 100 μL/sumuran. 2. Tiap-tiap kelompok dengan replikasi tiga kali.
3. Ditambahkan phytohaemaglutinin dengan konsentrasi akhir 50 μg/mL sebanyak 10 μL/sumuran,
4. Kemudian diinkubasi pada 37°C, CO2 5% selama 72 jam.
5. Selanjutnya ditambahkan MTT ( 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) pada masing-masing sumuran dengan konsentrasi 5 mg/mL sebanyak 10 μL, dan diinkubasi pada 37°C, CO2 5%, dilanjutkan selama 4 jam.
6. Reaksi dihentikan dengan menambah HCl-isopropanol 0,04 M sebanyak 100 μL/sumuran.
LAMPIRAN 7. SURAT KETERANGAN TELAH MELAKSANAKAN PENELITIAN
LAMPIRAN 8. HASIL PEMBACAAN PROLIFERASI LIMFOSIT LIMPA METODE MTT ASSAY
LAMPIRAN 9. DATA SPSS
Tabel Uji Deskriptif
Case Summariesa K1 K2 P1 P2 P3 Total N 5 5 5 5 5 Mean .0620 .0785 .1090 .1168 .1274 Std. Deviation .01617 .02760 .02292 .01171 .01644 Median .0600 .0765 .1020 .1165 .1274 Minimum .04 .04 .09 .11 .11 Maximum .09 .12 .15 .13 .15
Tabel Uji Normalitas
Tests of Normality KELOMPOK Shapiro-Wilk PROLIFERASI LIMFOSIT K1 .991 5 .984 K2 .990 5 .979 P1 .880 5 .311 P2 .883 5 .324 P3 .880 5 .309
Tabel Uji Homogenitas
Test of Homogeneity of Variances PROLIFERASI LIMFOSIT
Levene Statistic df1 df2 Sig.
.592 4 20 .673
Tabel Uji One Way Anova
ANOVA PROLIFERASI LIMFOSIT Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups .015 4 .004 9.620 .000 Within Groups .008 20 .000 Total .023 24
Tabel Uji Post Hoc
Multiple Comparisons Dependent Variable: PROLIFERASI LIMFOSIT LSD (I) KELOMPOK (J) KELOMPOK Mean Difference (I-J) Std. Error Sig. 95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound K1 K2 -.01650 .01251 .202 -.0426 .0096 P1 -.04700* .01251 .001 -.0731 -.0209 P2 -.05480* .01251 .000 -.0809 -.0287 P3 -.06537* .01251 .000 -.0915 -.0393 K2 K1 .01650 .01251 .202 -.0096 .0426 P1 -.03050* .01251 .024 -.0566 -.0044 P2 -.03830* .01251 .006 -.0644 -.0122 P3 -.04888* .01251 .001 -.0750 -.0228 P1 K1 .04700* .01251 .001 .0209 .0731 K2 .03050* .01251 .024 .0044 .0566 P2 -.00780 .01251 .540 -.0339 .0183 P3 -.01838 .01251 .157 -.0445 .0077 P2 K1 .05480* .01251 .000 .0287 .0809 K2 .03830* .01251 .006 .0122 .0644 P1 .00780 .01251 .540 -.0183 .0339 P3 -.01058 .01251 .408 -.0367 .0155 P3 K1 .06537* .01251 .000 .0393 .0915 K2 .04888* .01251 .001 .0228 .0750 P1 .01838 .01251 .157 -.0077 .0445 P2 .01058 .01251 .408 -.0155 .0367 *. The mean difference is significant at the 0.05 level.
LAMPIRAN 10. DOKUMENTASI PENELITIAN
Mencit balb/c dibagi menjadi 5 kelompok Ekstrak daun sirih merah
Infeksi Salmonella typhimurium
Proliferasi limfosit limpa metode MTT Assay
LAMPIRAN 11. BIODATA MAHASISWA
Identitas
Nama : Lisana Himmatul Ulya NIM : 22010112130187
Tempat/ tanggal lahir : Kudus, 27 September 1995
Alamat : Jl. Kutilang Raya No. 64 Ungaran, Kab. Semarang Nomor HP : 085712534500
Email : lisanahu@gmail.com
Riwayat Pendidikan
1. SD Negeri Ungaran 03 Lulus Tahun: 2006 2. SMP Negeri 1 Ungaran Lulus Tahun: 2009 3. SMA Negeri 3 Semarang Lulus Tahun: 2012 4. Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro Masuk Tahun: 2012
Keanggotaan Organisasi
