PMA-stimulaation vaikutus MonoMac-solujen MMP-9- ja MMP-2-tuotantoon

PMA-STIMULAATION VAIKUTUS MONOMAC-SOLUJEN MMP-9JA MMP-2-TUOTANTOON. Timo Ojanen Syventävien opintojen kirjallinen työ Tampereen yliopisto Biolääketieteen laitos Lääketieteellinen biokemia 03.2010.

Tampereen yliopisto Lääketieteen laitos Lääketieteellisen biokemian tutkimusryhmä TIMO OJANEN: PMA-STIMULAATION VAIKUTUS MONOMAC-SOLUJEN MMP-9- ja MMP-2-TUOTANTOON Kirjallinen työ, 82 s. Ohjaaja: dos. Tiina Solakivi Maaliskuu 2010. Avainsanat: ateroskleroosi, ECM, migraatio, MMP-aktivaatio, SMC, zymografia. Tiivistelmä Ateroskleroottisessa valtimosairaudessa valtimoiden seinämän sisäkerrokseen, intimaan, kertyy lipoproteiinien mukana kolesterolia, josta vähitellen kehittyy ateroskleroosiplakkeja. Kolesterolin kertyminen on myös yhteydessä valtimon vaurioitumiseen ja tulehdusreaktioon. Verenkierrosta infiltroituu monosyyttejä valtimon seinämään, ja ne kypsyvät siellä makrofagi-syöjäsoluiksi, jotka alkavat hapettaa intimaan kertyneitä lipoproteiineja ja syödä niitä, kunnes muuttuvat lipiditäytteisiksi vaahtosoluiksi. Makrofagit ja muut soluväliaineen läpi tunkeutuvat solut erittävät matriksimetalloproteinaasientsyymejä eli MMP:ja, jotka pilkkovat soluväliaineen kollageeneja. Makrofageja ja MMP9-tyypin gelatinaasia esiintyy runsaasti kypsissä ateroskleroosiplakeissa, joilla on suuri taipumus revetä ja sen kliinisenä ilmentymänä aiheuttaa aivo- ja sydäninfarkteja. PMA-stimulaation vaikutus MonoMac-solujen MMP-9- ja MMP-2-tuotantoon -työssä tutkittiin tekijöitä, jotka vaikuttavat makrofaginkaltaisten solujen kasvuun ja gelatinaasieritykseen. MonoMac-soluja kasvatettiin RPMI- ja X-VIVO-pohjaisissa elatusnesteissä PMA:n vaikutuksessa. Solujen MMP-eritys selvitettiin mediumeista tehtävillä SDS-PAGE-zymografioilla ja solujen kasvu proteiinimäärityksillä. Tulosten perusteella kasvutekijät muuttivat merkittävästi solujen reagointia PMA:n aiheuttamaan stimulaatioon. PMA lisäsi voimakkaasti MonoMac-solujen proMMP-9:n eritystä ja gelatinaasien aktivaatiota etenkin kasvutekijöiden läsnä ollessa ja heikensi solujen kasvua, jota kasvutekijät olivat lisänneet. MMP-2 aktivoi merkittävästi MMP-9:ää. Tulokset auttavat osaltaan selittämään makrofagien kerääntymistä tulehduspesäkkeisiin ja muuttuvaa reaktiota ateroskleroosiplakin kypsyessä..

SISÄLLYS Käytetyt lyhenteet ja termit. sivu 6. 1. TEORIAKATSAUS. 7. 1.1. Arterioskleroosi ja sen patologia 1.1.1. LDL, sen kertyminen ja hapettuminen 1.1.2. Fibroottisen plakin kehittyminen 1.1.3. MMP-9:n rooli, plakin seinämän heikkeneminen ja rupturoituminen 1.2. Anatomia, sytologia ja makrofagit 1.2.1. Ekstrasellulaarimatriksi ja sen rakenneosat 1.2.2. Solukontaktien merkitys 1.2.3. Makrofagit 1.3 Matriksin metalloproteinaasit 1.4. Metalloproteinaasientsyymien säätely 1.4.1. MMP:en aktiivisuuden käynnistys 1.4.2. Aktiivisuuden säätely 1.4.3. MT-MMP-1:n rooli MMP-2:n aktivaatiossa (oligomerisaatiomalli) 1.4.4. Plasmiinin roolit ja MMP:en aktivaatio 1.4.5. Metalloproteinaasien inhibitio 1.4.6. PMA. 7 8 9 10 11 11 13 13 14 18 18 19 22 23 24 26. 2. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET. 27. 3. YLEISET METODIT. 28. 3.1. Reagenssit 3.2. Soluviljely 3.2.1. Käytetty solulinja 3.2.2. Käytetyt mediumit 3.2.3. Elatusnesteen vaihto 3.3. SDS-PAGE-zymografia 3.3.1. Mini-PROTEAN-II-elektroforeesi 3.3.2. Geelien valmistus 3.3.3. Näytteiden valmistus 3.3.4. Näytteiden ajo 3.3.5. Värjäys 3.4. Proteiinimääritys 3.4.1. Näytteiden valmistus 3.4.2. Proteiinimäärityksen suoritus. 28 28 28 29 30 31 31 32 33 34 34 35 35 36.

4. TYÖKOHTAISET METODIT. 37. 4.1. Huomioita edeltävien tutkimusten perusteella 37 4.2. Seerumilaimennossarja 38 4.2.1. Tavoite ja aineisto 38 4.2.2. Zymografia 38 4.3. PMA:n vaikutus MonoMac-6-solujen metalloproteinaasieritykseen – vertailu sileihin lihassoluihin 39 4.3.1. Tavoitteet 39 4.3.2. Soluviljely 39 4.3.3. Zymografia 39 4.4. MonoMac-solujen aktiivisuus ajan funktiona 40 4.4.1. Tavoite 40 4.4.2. Soluviljelyt 41 4.4.3. Zymografia ja proteiinimääritys 41 4.5. Elatusnesteen vaikutus ja seerumittoman mediumin testaus 42 4.5.1. Tavoitteet 42 4.5.2. soluviljely 42 4.5.3. Zymografia 43 4.5.4. Proteiinimääritys 43 4.6. PMA-konsentraation vaikutus MonoMac-6-solujen MMP-tuotantoon eri elatusnesteissä 43 4.6.1. Tavoitteet 43 4.6.2. Soluviljely 44 4.6.3. Zymografia 45 4.6.4. Proteiinimääritys 45 4.7. Tutkimuksen virhelähteiden arviointi 45. 5. TULOKSET. 47. 5.1. Seerumilaimennossarja 47 5.2. PMA:n vaikutus MonoMac-6-solujen metalloproteinaasieritykseen – vertailu sileihin lihassoluihin 48 5.3. MonoMac-solujen aktiivisuus ajan funktiona 49 5.3.1. Zymografia 49 5.3.2. Proteiinimääritys 50 5.4. Elatusnesteen vaikutus ja seerumittoman mediumin testaus 52 5.4.1. Soluviljelmien mikroskopointi 52 5.4.2. Zymografia 53 5.4.3. Proteiinimääritys 53 5.5. PMA-konsentraation vaikutus MonoMac-6-solujen MMP-tuotantoon eri elatusnesteissä 54 5.5.1. Soluviljelmien mikroskopointi 54 5.5.2. Zymografia 54 5.5.3. Proteiinimääritys 56.

6. POHDINTA. 58. 6.1. Seerumin käyttö standardina 58 6.2. SMC:en vertailu MonoMac-soluihin 58 6.3. FCS:n entsyymiaktiivisuus 59 6.4. Elatusnesteiden vaikutus MonoMac-6-solujen kasvuun ja MMPtuotantoon 60 6.5. PMA:n vaikutus MonoMac-6-solujen kasvuun ja MMP-tuotantoon 61 6.6. MMP:en eritys ja aktivaatio 65 6.7. MMP:en inaktivaatio 66 6.8. MonoMac-6-solujen käyttäytyminen muuttuvassa kasvuympäristössä 67 Kiitokset. 69. LÄHTEET. 69. LIITTEET. 71.

Käytetyt lyhenteet ja termit APMA APS COX-2 EGF FCS FGF IL-1β LDL M-CSF MMP MonoMac mRNA MT-MMP PDGF PMA proMMP RPMI SDS SMC TEMED TGF TNF-α TIMP t-PA u-PA X-VIVO. para-aminofenyylielohopea-asetaatti ammoniumpersulfaatti syklo-oksigenaasi-2-entsyymi epidermaalinen kasvutekijä sikiövasikan seerumi (käytössä myös lyhenne FBS: naudan sikiön seerumi) fibroblastikasvutekijä 1β-tyypin interleukiini, tulehdusvälittäjäaine matalan tiheyden lipoproteiini (eng. low density lipoprotein) makrofagien koloniaa stimuloiva faktori matriksin metalloproteinaasi monosyyttimakrofagi lähetti-RNA kalvotyypin matriksin metalloproteinaasi verihiutalekasvutekijä phorboli-12-myristaatti-13-asetaatti matriksin metalloproteinaasin esimuoto soluviljelyssä käytetty elatusneste, ks. luku 3.2.2. natrium-dodekyylisulfaatti (eng. sodium dodecyl sulphate) sileä lihassolu (eng. smooth muscle cell) N,N,N’ ,N’ -tetrametyylietyleenidiamiini transformoiva kasvutekijä tuumorinekroositekijä alfa (olemassa mm. tyypit α ja β) metalloproteinaasien kudosinhibiittori kudostyypin plasminogeenin aktivaattori virtsan plasminogeenin aktivaattori soluviljelyssä käytetty elatusneste, ks. luku 3.2.2.. Käytettyjä termejä:. Raita = Band (eng.) Kaista = Lane (eng.).

7. 1. TEORIAKATSAUS. 1.1. Ateroskleroosi ja sen patologia. Ateroskleroosi (ja arterioskleroosi) on monitekijäinen valtimoiden patologinen reaktio, jossa ruumiin metabolisten ja tulehduksellisten reaktioiden seurauksena valtimon seinämään kertyy valtimoa ahtauttavia repeämäherkkiä kolesterolikertymiä sisältäviä sidekudosplakkeja. Se on kertymäsairaus ja sen myötä tiiviisti kytköksissä ikääntymiseen, elintapoihin ja geneettiseen alttiuteen. Ateroskleroosi voi johtaa valtimon suonittaman kudoksen hapenpuutteeseen ja esim. kroonisiin haavoihin, valtimon trombiin, läppävikoihin, tai jopa jäsenen kuolioitumiseen. Ateroskleroosin yleinen ja pelätyin ilmentymä on sydän- tai aivoinfarkti. [1] Viime vuosien aikainen sepelvaltimotautikuolleisuuden aleneminen johtuu pääasiassa kolmen tärkeimmän riskitekijän vähentymisestä: seerumin kolesteroli, verenpaine ja tupakointi [2].. Ateroskleroosi alkaa valtimon sisäkerrokseen, intimaan kertyvistä lipoproteiinisista rasvajuosteista, joita voi esiintyä melko nuorella iällä (yli 15 vuotiailla). Verenkierron monosyytit tarttuvat näissä kohdissa endoteeliin ja tunkeutuvat intimaan. Intimassa monosyytit proliferoivat ja kypsyvät makrofageiksi. Makrofagit syövät intimaan kertyneitä lipoproteiineja kunnes ovat muuntuneet lipidipisaroiden täyttämiksi vaahtosoluiksi. Ajan mittaan vaahtosolut kuolevat ja vapauttavat sisältönsä ja syömänsä lipidit muodostuvaan nekroottiseen ytimeen. Joihinkin plakkeihin kertyy sileitä lihassoluja (SMC) verisuonen keskikerroksesta eli mediasta, ja nämä tuottavat sidekudosta plakin stabiloimiseksi. Plakki kasvaa uusien monosyyttien ja lipidien kertyessä verestä plakin reunoille sekä solujen jakautuessa ja tuottaessa lisää sidekudosta. Plakki muodostuu helpoimmin verisuonen mutkaan tai haara-alueelle, jossa veren virtaus aiheuttaa epätasaista painekuormitusta tai pyörteilee. Näillä alueilla verisuonen sisäpintaa verhoavat endoteelisolut eivät ole järjestäytyneet virtaussuunnan mukaisesti ja niiden permeabiliteetti mm. LDL:lle (low.

8. density lipoprotein) on muuta endoteelia korkeampi. LDL diffundoituu passiivisesti endoteelin läpi ja sen retentio suonen seinämässä riippuu liporoteiinien rakeneosan apoliproteiini-B:n (apoB) ja matriksin proteoglykaanien välisestä vuorovaikutuksesta. LDL:n kaltaisen lipoproteiini(a)-molekyylin on etenkin havaittu olevan aterogeeninen, sillä se vaikuttaa fibrinolyysiin ja SMC:en kasvuun. [1]. 1.1.1. LDL, sen kertyminen ja hapettuminen. Valtimon seinämään kertynyt LDL muokkautuu ajan mittaan oksidaatiossa, lipolyysissä ja proteolyysissä ja kasaantuu paikallisesti, ja tämä muokkaus vahvistaa tulehdusreaktiota. Valtimon solujen aineenvaihduntatuotteet ja hajonneiden solujen jätteet hapettavat lipoproteiineja. Tämä tuottaa minimaalisesti hapettunutta LDL:a (minimally oxidized LDL), joka kiihdyttää tulehdusreaktiota mutta ei kuitenkaan aktivoi makrofagien kerääjä(scavenger) reseptorivälitteistä soluun ottoa. Lipidejä hapettava lipo-oksygenaasientsyymi tuottaa runsaasti reaktiivisia happisidoksia sisältäviä lipidien metaboliittien välivaiheita, mikä edistää radikaalien muodostusta ja tulehdusaktivaatiota. HDL (high density lipoprotein) sen sijaan kuljettaa lipidejä pois suonen seinämästä sekä ehkäisee lipoproteiinien oksidaatiota eli toimii antioksidanttina. [1]. Hapettunut LDL ehkäisee myös typpioksidin eritystä, minkä seurauksena suonen kyky relaksoitua vähenee ja taipumus korkeaan verenpaineeseen lisääntyy. (Ateroskleroosi on itseään kiihdyttävä prosessi.) Diabeteksen arvellaan voimistavan tulehdusherkkyyttä, sillä sokeroituminen muuttaa endoteelireseptorien toimintaa. Hapettunut LDL käynnistää endoteelisolut erittämään pinnalleen monosyyttien ja lymfosyyttien kiinnittymisproteiineja ja kasvutekijöitä kuten mm. makrofagien koloniaa stimuloiva faktori (M-CSF), sekä kemotaktisia proteiineja (mm. monosyyttispesifinen MCP-1). Nämä proteiinit aktivoivat tulehdusreaktiota ja helpottavat leukosyyttien tarttumista valtimon seinämään tulehdusalueella. Endoteeliin kiinnittynyt leukosyytti kykenee sitten tunkeutumaan soluväleihin. M-CSF stimuloi monosyyttien erilaistumista makrofageiksi, proliferaatiota ja makrofagien kerääjäproteiinien ekspressiota, joka edistää lipidien soluun ottoa. [1].

9. On näyttöä, että hapettunut LDL stimuloi makrofagien matriksin metalloproteinaasi-9 (MMP-9) -tuottoa lisäämällä sen lähetti-RNA:n (mRNA) ekspressiota, proteiinisynteesiä ja proteaasin gelatinolyyttistä aktiivisuutta, ja näin mahdollisesti edistää ateroskleroosiplakin rupturoitumista [2]. Vaahtosolujen muodostuminen vaatii riittävän runsasta lipidien soluun ottoa makrofagin kerääjäreseptorin avulla, jota tapahtuu vasta kun LDL on voimakkaasti hapettunutta. Hapettumisen aiheuttavat endoteelisolujen ja makrofagien tuottamat reaktiiviset happituotteet ja radikaalit sekä entsyymit, kuten myeloperoksidaasi, sfingomyelinaasi sekä sekretorinen fosfolipaasi, joita esiintyy ateroskleroosiplakeissa.. 1.1.2. Fibroottisen plakin kehittyminen. Valtimoseinämän vaurioituessa seinämän SMC:t stimuloituvat lepotilasta proliferoimaan ja liikkumaan vaurioalueelle. SMC:en siirtyminen mediasta intimaan alkaa n. 3 vrk:ssa ja solujakautuminen johtaa verisuonen sisimmän kerroksen, intiman, hyperplasiaan. Rajallinen MMP:n eritys on solujen liikkumiselle tarpeellista, ja liikkumiseen yhdistyy ilmeisesti samanaikainen metalloproteinaasien kudosinhibiittorin (TIMP) eritys proteolyysin hallitsemiseksi. Vaskulaariset SMC:t ovat tiettävästi ainoita plakin soluja, jotka tuottavat plakin rakenteen kestävyyden kannalta tärkeitä kollageeni-I- ja -III-muotoja. Ateroskleroosiin liittyy intimahyperplasiaa, jolloin kollageenien ja elastiinin määrät ovat lisääntyneet mutta sidekudossäikeistö on huonosti järjestäytynyttä, huonosti joustavaa ja siihen kertyy rasva- ja kalsiumhiukkasia. Kasvutekijöiden erittymiseen ja kudoksen hapenpuutteeseen viittaa uudissuonten muodostus. Runsaiden rasvakertymien ympäristössä esiintyy sidekudoksen kalkkeumaa ja kudosnekroosia. [1, 3]. Kudoksen plasminogeeniaktivaattorientsyymin (t-PA) välityksellä aterogeneesissä tapahtuu plakin kehityksen alkuvaiheessa hyperfibrinolyysiä ja loppuvaiheessa hypofibrinolyysiä. Alun t-PA:n liikaeritys stimuloi SMC:en liikettä vauriokohtaan ja vaurion paikkausta solujakautumisella sekä verihyytymän hajotusta. Plakin kypsyessä lisääntyy tPA:n inhibitio ja t-PA:n eritys vähenee. Hypofibrinolyysi lisää sidekudoksen paikallista kertymistä ja hyytymistaipumusta. [3].

10. Kollageenin ja proteoglykaanien kertyminen alkaa jo ennen MMP:en laskua. Voisi olla mahdollista, että tämä johtuisi plakin SMC:en vähentymisestä ja niiden MMP:en tuottoa ylläpitävän vaikutuksen loppumisesta. Verisuonen ”haava”arpeutuu ja muuttuu fibroblastivaltaiseksi. Jos tällöin kudoksessa on vielä runsaasti makrofageja ylläpitämässä inflammaatiota, arpi ei muodostu kovin kestäväksi. Liiallinen inflammaatio hidastaa haavan paranemista ja lisää fibroosia.. 1.1.3. MMP-9:n rooli, plakin seinämän heikkeneminen ja rupturoituminen. Kypsissä plakeissa esiintyy kalkkeutumista (noin 40 %:ssa), vaahtosolukertymiä ja kolesterolisakkaumia. Plakki on histologisesti hyposellulaarinen. Koostumuksellisesti stabiilit ja epästabiilit plakit ovat hyvin samankaltaisia, ja on todennäköistä, että yksittäiset ja melko vähäiset tekijät aiheuttavat plakin epästabiloitumisen esim. elimistön tulehdusreaktion sivutuotteena. Akuutti sydänifarkti aiheutuu useimmin sepelvaltimon ateroskleroottisen plakin rupturoitumisesta, joka johtaa suonen tromboosiin ja valtimon tukkeumaan. Plakin repeämisen riskiä lisäävät sidekudosseinämän ohuus (kollageenin vähyys), valtimoperäisten SMC:en vähäinen määrä, suuri lipidikertymä tai plakin koko ja tulehdussolujen etenkin makrofagien suuri määrä. [1]. Aineenvaihdunta on runsainta plakin reunoilla, jossa on myös runsaimmin makrofageja ja erittyy eniten MMP:ja. Epästabiileissa plakeissa kehittyy tulehdusrektio ja tulehdussolut ekspressoivat runsaasti HLA-DR-antigeenia, jota ei esiinny plakin ulkopuolella. Epästabiileissa plakeissa syklo-oksygenaasi-2:n (COX-2), prostaglandiini-E-syntaasin (PGES) ja MMP-9:n ja -2:n määrä on korkeampi kuin stabiileissa, ja myös makrofagien määrä korreloi plakin oireilevuuteen. Makrofagit, mutta eivät juurikaan T-lymfosyytit tai monosyytit, aiheuttavat määräriippuvaisesti apoptoosia karotisplakin, aortan ja sepelvaltimon media-kerroksen SMC:issa. Makrofagien indusoima apoptoosi vaatii suoran solujen välisen kontaktin. Myös tulehdussolujen liukoiset sytokiinit (IL-1β, TNF-α, interferoni-gamma) indusoivat apoptoosia. SMC:en apoptoosi herkistää rupturoitumiselle..

11. Plakin repeäminen tapahtuu yleensä makrofagikertymän kohdalta, ja repeämispaikassa on usein myös T-lymfosyyttikertymiä. Näille kohdille plakissa kohdistuu myös suurin verenpaineen aiheuttama rasitus. [1, 4, 5]. Koronaaritautia sairastavien veren MMP-9-arvot ovat korkeammat kuin verrokeilla [2, 3]. MMP:lla onkin luultavasti keskeinen rooli plakin rupturoitumisessa. Vaahtosolujen tuottamat sytokiinit ja superoksidit stimuloivat MMP-1:n, -3:n ja -9:n ekspressiota ja MMP-2: ja -9:n aktivaatiota. Myös plakkialueelle migroivien ja proliferoivien SMC:en MMP-2:n, -3:n ja -9:n tuotanto on lisääntynyttä. [2]. 1.2. Anatomia, sytologia, makrofagit. 1.2.1. Ekstrasellulaarimatriksi ja sen rakenneosat. Ekstrasellulaarimatriksin eli soluväliaineen päärakenneosat ovat interstitiaalinen sidekudos ja tyvikalvo. Kollageenisäikeet muodostavat sidekudoksen verkkomaisen perusrakenteen. Iho-, jänne-, luu-, rustokudoksen ja nivelsiteiden orgaanisesta materiasta jopa 90 % on kollageenia ja sitä on runsaasti myös verisuonten seinämässä. Nisäkkään proteiineista 25 % on kollageenia. Kollageenimolekyyli muodostuu kolmesta α-ketjusta, jotka asettuvat kierteeksi. Kollageenimolekyylit muodostavat säikeitä, paksumpia kuituja, mikrofilamentteja, verkkoja ja levyjä. Säiemuodostus tapahtuu kovalenttisilla ristisidoksilla. Säikeet asettuvat yleensä rasitusvoimien suuntaisesti luomaan veto- ja puristuslujuutta kudokselle. Toistaiseksi on tunnistettu 19 eri kollageenityyppiä. Kollageeni on kestävä molekyyli ja sen hajotukseen kykenevät proteinaasientsyymeistä lähinnä kollagenaasit. Kuituisissa kollageenityypeissä on vain yksi kohta molekyylissä, johon kollagenaasi kykenee tarttumaan, mutta pilkkominen tästä kohdasta purkaa molekyylin kolmoiskierteen. Tätä osin hajonnutta kollageenia nimitetään gelatiiniksi, jota gelatinaasit ja useimmat laajakirjoiset proteinaasit kykenevät pilkkomaan..

12. Kollageenisäikeiden väleissä on amorfinen geelimäinen massa, joka koostuu pääosin glykosamino- ja proteoglykaaneista, jotka ovat sitoneet itseensä vesimolekyylejä. Tyvikalvot erottavat parenkymaalisia, epiteliaalisia ja endoteliaalisia solukerroksia alla olevasta sidekudosstroomasta. Tyvikalvo muodostaa päällään olevan solukon tuki- ja kiinnittymispinnan, säilyttää kudosrakennetta ja valikoivasti päästää lävitseen eri molekyylejä. Tyvikalvo koostuu pääosin IV-tyypin kollageenista, laminiinista, entaktiinista, SPARC-proteiineista ja proteoglykaaneista.. Yksittäinen kollageeni-IV-molekyyli on joustava sauva, jonka α-ketjut (rakenne α1(IV)2α2(IV)) ovat rinnakkain ja kolmoiskierre katkonainen. Ne muodostavat verkon joko neljän molekyylin sitoutuessa yhteen tetrameeriksi aminopäästään ja toisiin molekyyleihin karboksipäistään tai molekyylin varren rikki- tai ristisidoksilla, joiden avulla muodostuu epäsäännöllinen kolmiulotteinen verkko. Tyvikalvon laminiiniproteiinit toimivat solujen kiinnittymiskohtina tyvikalvoon. Suuri osa ekstrasellulaarimatriksin kollageenirakenteista, esim. säikeet ja epäsäännöllinen verkko, muodostuu itsestään kollageenimolekyylien sitoutumistaipumusten mukaisesti, mutta esim. tyvikalvon muodostuminen vaatii solukontaktin. Valmiin lepotilaisen terveen kudoksen kiinteiden rakenneosien muokkautuminen on hidasta; kollageenin puoliintumisaika on useita kuukausia ja elastiinin vuosia, mutta proteoglykaanien vaihto on jatkuvaa ja kestää päivistä viikkoihin. [6, 7]. Ekstrasellulaarimatriksin rakenneosia tuottavat fibroblastit erittävät jatkuvasti MMP-2entsyymin esimuotoa (proMMP-2), joka sitoutuu ja varastoituu ekstrasellulaarimatriksiin. Näin ekstrasellulaarimatriksi sisältää jatkuvasti valmiuden pilkkoa itse itseään, jos jokin ulkoinen tekijä, esim. eritetty tai tunkeutuvan solun pintamolekyyli, aktivoi metalloproteinaasin. Matriksin koostumus vaikuttaa siinä olevien solujen reaktiivisuuteen. Ekstrasellulaarimatriksi sitoo mm. kasvutekijöitä, mikä estää niiden leviämistä kudoksessa. Kasvutekijä voi olla aktiivinen sitoutuneena, mutta osa vapautuu vasta matriksia pilkottaessa. Näin kasvutekijää sisältävä kudos voi toimia invasoivalle solulle paikallisena kemotaksina, sillä kasvutekijä edistää matriksiin sitoutuvan solun tunkeutumista syvemmälle. Kullakin solutyypillä on erilainen tarttumis- ja leviämiskyky eli kollageenityyppeihin, ja kollageeni, proteoglykaanit tai matriksiin sitoutuneet molekyylit voivat toimia jollekin solutyypille kuten kasvutekijäsignaali. [8].

13. 1.2.2. Solukontaktien merkitys. Solujen toiminnan kannalta niiden solujenväliset kontaktit ja mahdollisuus kiinnittyä tai ankkuroitua kudoksen tukirakenteisiin, yleensä ekstrasellulaarimatriksin kollageeniin tai tyvikalvoon, on tärkeää. Ilman solujen välistä kontaktia tai soluja ylläpitävää kemiallista signaalia solut päätyvät apoptoosiin eli ohjelmoituun solukuolemaan. Ilman kiinnittymispintaa tai pintareseptorien stimulaatiota solut menettävät rakenteelliset ominaisuutensa. Kiinnittymispisteiden puuttuessa solun mikrotubulustukirakenneverkko purkaantuu, solu pyöristyy ja inaktivoituu ja saattaa menettää jopa erikoistumisensa ja normaalin reagointinsa kasvutekijöiden herätteeseen. Tämä on huomioitava seikka soluviljelmissä, joissa solujen luontaiset tukipinnat yleensä puuttuvat. Integriinit (transmembraaninen glykoproteiini) ovat tärkeitä solukalvon adheesioreseptoreita. Tekijöillä, joilla on vaikutus tukirakenneverkkoon, kuten MMP:llä, on suuri merkitys kudoksen solujen rakenteelle, toiminnalle ja proliferaatiolle. Tätä kautta MMP:illa on kyky periaatteessa missä tahansa kudoksessa paikallisesti muuttaa ja jopa ehkäistä mutta myös mahdollistaa solujen normaali toiminta.. 1.2.3. Makrofagit. Makrofagit ovat mononukleaarisia valkosoluja ja osa elimistön immuunipuolustusta. Makrofagit toimivat joko kudosmakrofageina, jolloin ne ovat paikallaan kudoksen seinämässä ja siivilöivät ohi virtaavasta kudosnesteestä tai verestä elimistölle vieraaksi tunnistamiaan partikkeleita ja mikrobeja, tai ne kiertävät veressä monosyytteinä, jolloin joutuessaan tekemisiin tulehdusvälittäjäaineiden kanssa ne tunkeutuvat kudokseen, jossa ne jakautuvat ja kypsyvät makrofageiksi. Makrofagit ovat suurikokoisia syöjäsoluja, jotka fagosytoosin avulla kurovat sisäänsä vierasesineitä, myrkkyjä, mikrobeja, hajonneiden solujen kappaleita ja soluvälitilaan kertyvää jätettä. Makrofagi hajottaa syömänsä kappaleet lysosomiensa hydrolyyttisillä entsyymeillä ja happiradikaaleilla tai varastoi hajoamattomat kappaleet sisäänsä pysyvästi. Makrofagit ovat yksi tärkeimmistä solutyypeistä kroonisen tulehdusreaktion käynnistymisessä ja ylläpidossa..

14. Ekstrasellulaarimatriksin proteolyyttinen hajotus on osa useita fysiologisia prosesseja, esim. kudoksen muokkaus, haavan paraneminen, solujen liikkuminen ja invaasio, tulehdukset jne. Makrofageilla on kyky hajottaa ekstrasellulaarimatriksin kaikkia makromolekulaarisia rakenneosia erittämiensä proteolyyttisten entsyymien avulla, joista tärkeimpiä ovat metalloproteinaasit. Makrofagien eniten tuottamia proteinaaseja ovat interstitiaalinen kollagenaasi, 92 kDa-gelatinaasi (MMP-9) sekä stromelysiini, ja osin myös 72 kDa-gelatinaasi (MMP-2). Pääosin solut erittävät välittömästi valmistamansa MMP:n, mutta jossain määrin neutrofiilit ja makrofagit kykenevät myös varastoimaan MMP:a solunsisäisesti [3, 9]. Ne eivät varastoi MMP-9:ää, jolloin intrasellulaarisesti havaittu metalloproteinaasi tai MMP-9:n mRNA:n esiintyminen viittaa aina synteesiin [5]. Makrofagien MMP-9:n ja -2:n erityksen käynnistys tapahtuu solussa prostaglandiini-E2:n ja syklisen adenosiinimonofosfaatin (cAMP) välityksellä. COX-2:n induktio monosyyteissä lisää niiden prostaglandiini-E:n ja siten myös MMP:en tuottoa. [10]. 1.3. Matriksin metalloproteinaasit. Matriksin metalloproteinaasit ja niitä säätelevät kudosinhibiittorit (TIMP:t) vaikuttavat ekstrasellulaarimatriksin määrään ja kierrätykseen sekä lisäksi kontaktissa olevien solujen elossa säilymiseen, erilaistumiseen, adheesioon ja liikkumiseen. Soluväliaineen määrä on herkässä tasapainotilassa, jossa liiallinen hajotus johtaa kudostuhoon ja liian vähäinen hajotus erilaisiin paikallisiin plakkeihin, arpiin ja kertymäsairauksiin. Solun liikkumiseen on tarpeen vain kollageenisäikeiden hajotus solun itsensä viereisestä perisellulaaritilasta ilman laajaa kudosrakenteen vaurioittamista. Ekstrasellulaarimatriksi toimii myös kasvutekijöiden varastona. Kasvutekijät vapautuvat matriksin proteolyysissä ja aktivoivat solut korjaamaan vauriota. Elimistössä useat solut käyttävät MMP:ja. MMP:en tuotanto on tärkeä osa haavan paranemista, ja niitä erittävät keratinosyytit, fibroblastit sekä endoteelisolut. MMP:en liikatuotanto liittyy joihinkin patologisiin tiloihin, kuten nivelreumaan kroonisiin haavoihin ja ientulehdukseen. [6].

15. Solun liikkumiseen ja invaasioon tarvitaan kolme vaihetta: tarttuminen, paikallinen proteolyysi ja migraatio. Invaasio vaatii kykyä ylittää tai ohittaa rakenteellisia esteitä kuten tyvikalvo, soluvälitilan strooma ja solujen väliset liitokset. Elimistön normaalit solut käyttävät invaasiota fysiologisena tunkeutumismuotona kudokseen esim. angiogeneesissä, trofoblasti-invaasiossa sekä neutrofiilien ja makrofagien liikkuessa kudoksessa. MMP:en toiminta on välttämätöntä kasvainsolujen sekä oletettavasti myös normaalien solujen tunkeutumiselle soluväliaineen halki [7].. Rakenteeltaan matriksin metalloproteinaasit ovat Ca2+:n aktivoimia sinkkiendopeptidaaseja [3]. Kaikkien metalloproteinaasien rakenne on melko samankaltainen. Molekyylin aminopäässä on hydrofobinen signaalijakso MMP-17:aa lukuunottamatta kaikilla, ja tämän vieressä n. 10 kDa:n kokoinen globulaarinen propeptidialue (-domain), joka irtoaa molekyylin aktivaatiossa. Sen vieressä on molekyylin ydinosassa katalyyttinen osa, jossa on sinkki-ionin ja kalsiumionien sitoutumispaikat. MMP-2:n ja MMP-9:n katalyttisessä osassa on vastaavat kolmoistoistojaksot kuin fibronektiinin II-tyypin kollageenin sitomisosassa, joiden avulla ne kykenevät sitoutumaan kollageniin ja gelatiiniin, ja se mahdollistaa myös elastiinin pilkkomisen. Katalyyttisen osan vieressä on lyhyt proliinipitoinen sarana-alue, joka on suurin MMP-9:llä (rakenne on vastaava kuin kollageeni-V:n α2-ketju). Sarana liittää molekyyliin hemopeksiinin tai vitronektiinin kaltaisen alueen, joka määrää MMP:n substraattispesifisyyden ja TIMP:ien sitoutumiskyvyn MMP:iin. Hemopeksiinin kaltainen alue sijaitsee molekyylin hiilipäässä. Siinä on neljä neljästä käänteisrinnakkaisesta -nauhasta ja yhdestä α-kierteestä koostuvaa lapaa. Hemopeksiinialue on välttämätön, jotta MMP kykenee pilkkomaan kolmoiskierteistä interstitiaalikollageenia. Kalvotyypin MMP:en (MT-MMP) hiilipäissä on vielä noin kahdenkymmenen hydrofobisen aminohapon transmembraanialue ja 24 aminohapon intrasellulaarialue. [6, 9, 11] Kaikissa MMP:issa alue, joka ympäröi proosassa kysteiiniä (proteiinirakenne (K)PRCGV/NPD(V)) sekä katalyyttisen alueen sinkkiä sitova jakso (HEXGHXXGXXH), eli pro-osan ns. kysteiinikytkin ja entsyymin aktiivikohta, ovat MMP:en välillä lähes samat [12]..

16. Rakenteensa ja substraattinsa perusteella MMP:t luokitellaan neljään luokkaan: (interstitiaaliset) kollagenaasit, gelatinaasit, stromelysiinit ja kalvotyypin MMP:t. Fibroblastikollagenaasia erittyy lähes kaikista solukoista. Kollagenaasit (MMP-1, -8 ja -13) kykenevät pilkkomaan säikeistä kollageenia α-ketjujen spesifistä kohdasta (Gly775 – Ile/Leu776). Ne pilkkovat ketjun ¾ N-päästä ja ¼ C-päästä kokoisiksi paloiksi. Nämä denaturoituvat spontaanisti gelatiiniksi 37 °C:ssa ja ovat sitten alttiita gelatinaasien vaikutukselle. On havaintoja, että myös MMP-2 ja MT-MMP:t kykenevät pilkkomaan säikeistä kollageenia ¾- ja ¼- paloiksi. [12]. Tässä työssä keskityttiin vain gelatinaasien, eli MMP-9:n ja MMP-2:n tarkasteluun. Gelatinaasit, eli 72-kDa:n kokoinen tyypin IV kollagenaasi (MMP-2) sekä 92-kDa:n tyypin IV kollagenaasi (MMP-9) hajottavat denaturoituja kollageeneja eli gelatiineja, perusmuotoisia kollageeneja tyyppiä II, IV, V, VII, X ja XI, fibronektiinia, vitronektiinia, elastiinia ja aggrekaania.. Taulukko 1: Gelatinaasityypit Gelatinaasit / Tyypin IV kollagenaasit Entsyymi MMP Massa (kDa) Substraatit (matriksikomponentit) 72-kDa gelatinaasi MMP-2 72 gelatiinit, kollageenit (I), IV, V, VII X ja XI, elastiini, fibronektiini, PGyp 92-kDa gelatinaasi MMP-9 80. (92) gelatiinit, kollageenit IV ja V, elastiini, PGyp. Substraatit (muut) proMMP-1*, -2*, (-9)*, -13*, plasminogeeni, a2M, proTNF-alfa, proIL1-beta plasminogeeni, a2M, proTNF-alfa, proIL1-beta. Muokattu lähteistä [6, 9, 12]. (Suluissa eritettyjen glykosyloituneiden MMP:en molekyylipainot.). Käytetyt lyhenteet: PGyp = proteoglykaanin ydinproteiini, a2M = α2-makroglobuliini. *= seurauksena kollagenaasi- ja gelatinaasiaktivaatio. Taulukko 2: Gelatinaaseja erittävät kudokset Gelatinaasit / Tyyppi IV kollagenaasit MMP Erittävä kudos/solukko MMP-2 fibroblastit, kondrosyytit, endoteeli, keratinosyyti, monosyytit, muuntuneet solut MMP-9 keuhkoalveolien makrofagit, granulosyytit, osteoklastit, keratinosyytit, trofoblastit, syöpäsolut (mutta ei fibroblastit). Muokattu lähteestä [6]..

17. MMP-9: MMP-9 on tyypin IV kollagenaasi (gelatinaasi-B). ProMMP-9 on hyvin stabiilia. Se säilyttää proteolyyttisen aktiivisuutensa toistuvien jäädytysten ja sulatusten jälkeen ja kestää säilytystä pitkiä aikoja –20 °C:ssa ilman heikkenemistä tai autoaktivaatiota [13]. Tavallisimmat MMP-9:ää erittävät solut ovat (alveolaariset) makrofagit, granulosyytit, osteoklastit, keratinosyytit, invasoivat trofoblastisolut, sekä kasvainperäiset solut. Normaalioloissa fibroblastit eivät eritä MMP-9:ää. MMP-9 eritetään glykosylodussa 92 kDa pro-muodossa, ja pilkkoutunut aktiivimuoto on n. 84 kDa:n kokoinen [6]. MMP-9:n aktivaatio voi tapahtua plasmiinin avulla, fibroblastien välittämänä ja MMP-3:n ja MMP13:n avulla [3]. [6, 14, 15]. MMP-2: Myös MMP-2 on IV-tyypin kollagenaasi (gelatinaasi-A). Kollageeni IV on keskeinen tyvikalvon rakenneosa. Endoteelisolut ja fibroblastit ovat MMP-2:n päätuottajia. Fibroblastit varastoivat MMP-2:a perisellulaarimatriksiinsa. Myös sileät lihassolut tuottavat runsaasti MMP-2:a [15]. MMP-2:n eritys on tyypillistä myös maligneille soluille ja se korreloi näiden invasiivisuuden ja metastaasitaipumuksen kanssa. Alun perin MMP-2 löydettiinkin juuri syöpäsoluista. MMP-2:n hemopeksiinin kaltainen alue tarvitaan, jotta MTMMP-1 kykenee aktivoimaan proMMP-2:n solukalvolla [11]. MMP-2:n aktivaatio tapahtuu kaksivaiheisesti ensin MT-MMP:n pilkkoessa proentsyymin 64 kDa:n kokoiseksi välimuodoksi, joka pilkkoutuu autoprotolyyttisesti 62 kDa:n aktiivimuotoon. Plasminogeeni tehostaa MMP-2:n välimuodon pilkkomista. [3]. On havaintoja, että fibroblastien tuottama tyypin IV kollagenaasi (MMP-2) poikkeaa rakenteeltaan ja immunologisesti makrofagien ja granulosyyttien erittämästä MMP-2:sta, ja näiden molekyylipainot ovat 66–72 kDa sekä 94–97 kDa kullakin. Niiden substraattispesifisyydet ovat kuitenkin identtiset. Vastaavaa aktiivisuutta on havaittu 130 kDa:n ja 225 kDa:n molekyyleillä. [16].

18. Gelatinaasien esiintyminen verenkierrossa: Ihmisen veressä esiintyy fysiologisesti 72 kDa:n (fibroblastiperäinen) ja 92-, 130-, sekä 225 kDa:n (neutrofiiliperäisiä) gelatinaaseja (suuret gelatinaasikomplekseja) [17]. Tavallisesti veressä kiertävä MMP-2 ja MMP-9 esiintyvät pro-muodossaan, mutta (tutkimuksessa paksusuolen-) syöpäpotilailla veressä ilmeni myös aktiivimuotoa ja etenkin proMMP-9:n määrä oli koholla [14]. Kudoksen paikallinen MMP-9:n määrä ja aktivoituminen lisääntyvät tulehduksellisissa prosesseissa, valtimoaneurysmissa sekä solukon muuttuessa pahanlaatuiseksi [9, 14]. MMP-9:n määrää verenkierrossa voidaan käyttää epäspesifinä tulehdusmerkkiaineena [2].. 1.4. Metalloproteinaasientsyymien säätely. 1.4.1. MMP:en aktiivisuuden käynnistys. Solut erittävät MMP:t latentissa pro-muodossa, joka on n. 10 kDa suurempi kuin aktiivimuoto. Myös pro-muodolla on vähäinen proteolyyttinen aktiivisuus ja jo aktivoitunut entsyymi voi pilkkoa omaa esimuotoaan. Autoaktivaatiossa metalloproteinaasissa tapahtuu muodonmuutos ja pro-osa pilkkoutuu itsestään. Metalloproteinaasin aktiivisessa kohdassa on sinkki-ioni. Rakenteellisesti pro-osa estää metalloproteinaasin aktiivisuuden kysteiini-Zn2+-sidoksella (pro-osan parittomalla kysteiinipäällä) joka taivuttaa pro-osan molekyylin aktiivikohdan päälle. Sidoksen muodostus vapauttaa vesimolekyylin ja sellainen tarvitaankin molekyylin aktivoimiseksi jälleen, eli prosessi vaatii vesiympäristön. Tätä ”kysteiinikytkintä”muistuttavat rakenteet jotka sitoutuvat Zn-ioniin tai kytkimen sulkijat voivat toimia metalloproteinaasi-inhibiittoreina. Kysteiini-Zn2+-sidoksen avaaminen kemiallisesti tai fysikaalisesti (jodiasetaatit, reaktiiviset suolat esim. kaliumjodidi ja natriumsyanidi, elohopeayhdisteet, rikkivedyt, detergentit, APMA, SDS, urea, hapettimet, hapan pH, lämpökäsittely) tai kysteiinipään pilkkoontuminen (mm. trypsiini ja plasmiini) johtaa metalloproteinaasin autolyyttiseen aktivoitumiseen. Elimistön fysiologiset aktivaattorit, mm. plasmiini ja stromelysiini, pilkkovat proteolyyttisesti pro-osan, jolloin aktivaatio on pysyvä. Tulehdusreaktiossa vapautuvat ja mm. neutrofiilien ja makrofagien.

19. erittämät happiradikaalit voivat reagoida MMP:en kanssa ja aktivoida ne. Aktivaattorin vaikutus kuhunkin MMP:iin vaihtelee molekyylin mukaan. Interstitiaalikollagenaasit, stromelysiinit ja MMP-9 aktivoituvat herkimmin liukoisten entsyymien, kuten plasmiinin, neutrofiilielastaasin ja kymaasin avulla. [6, 9]. Metalloproteinaasit osallistuvat myös toistensa aktivaatioon keskinäisen proteolyysin tai autolyysin (itsepilkkominen) kautta. Stromelysiini ja matrilysiini kykenevät aktivoimaan prokollagenaasin ja MMP-9:n ja -2:n progelatinaasit. Stromelysiinin aktivoima kollagenaasi on 4–7 kertaa aktiivisempaa kuin autolyyttisesti APMA:n tai plasmiinin aktivoimana muodostunut (”superaktivaatio”), eli pilkkoutumistavalla ja -kohdalla on suuri vaikutus. Stromelysiini (MMP-3) tuottaa voimakkaimman toistaiseksi tunnetun kollagenaasin aktiivisuuden [9]. Esim. urokinaasin kaltainen plasminogeeniaktivaattori (u-PA) muodostaa aktivaatioketjun, jossa sen plasminogeenista aktivoitu plasmiini pilkkoo sekä prokollagenaasia että prostromelysiiniä, jolloin stromelysiini suoraan alkaa superaktivoida kollagenaasia. Trypsiiniaktivoitu fibroblastikollagenaasi voi aktivoida proMMP-2:n, ja näin aktivoitu MMP-2 pilkkoo kollagenaasin superaktiiviseen muotoonsa. MMP-2 kykenee aktivoimaan proMMP-9:n. Korkeilla pitoisuuksilla käynnistyy myös proMMP-2:n autolyyttinen aktivoituminen. Myös makrofagien erittämä stromelysiini aktivoi proteolyyttisen kaskadin tapaan MMP-9:ää (pro-osan pilkkoutuminen). MMP-9 kykenee hajottamaan kollageeni IV-, V- ja XI-tyyppejä, gelatiinia (denaturoitu kollageeni), proteoglykaaneja ja elastiinia. Proteoglykaanit ja elastiini ovat stromelysiinin ja interstitiaalisen kollagenaasin hajoitusvaikutukselle resistettejä.. 1.4.2. Aktiivisuuden säätely. MMP:en aktiivisuuden säätely tapahtuu useaa kanavaa: geenitranskription, mRNA:n stabiliteetin, erityksen, proentsyymin aktivaation ja inhibiton kautta. Fibroblastikollagenaasin, stromelysiinin ja MMP-9:n määrän ja aktiivisuuden säätely tapahtuu enimmäkseen geeniekspression säätelyn avulla. Kasvutekijöillä on suora vaikutus solun geeniekspression määrään. Neutrofiilien sekretorisiin granuloihin varastoituneen ja jo aiemmin syntetoidun MMP-8:n ja -9:n erityksen säätely tapahtuu.

20. lähiympäristön kemiallisten stimulusten vaikutuksesta (transkriptiolla ei ole vaikutusta) kohdekudoksessa.. Transkription säätely: Kasvutekijät, kuten EGF, bFGF sekä PDGF, ja tulehdussytokiinit, kuten TNF-α sekä IL-1 ja PMA, voivat kiihdyttää transkriptiosäätelylle herkkien MMP:en (fibroblastikollagenaasi, stromelysiini-1 sekä joissain tapauksissa MMP-7, -9, -10 ja -11) mRNA-tuotannon 20–50-kertaiseksi. Näiden MMP:en geenien promoottorialueella on yhteinen välittäjäaineen sitoutumiskohta ns. TPA-responsiivinen elementti (TRE, reagoi 12-O-tetradekanoyyliphorboli-13-asetaattiin, eli PMA:an), joka sitoo AP-1 transkriptiotekijäkompleksin. Transkription määrään vaikuttavat transkriptiotekijöiden määrät, niiden muodostus ja hajotus, muodonmuutokset, vaikutukset geenien laskostumiseen ja keskinäiset vuorovaikutukset ja kompleksinmuodostus. [6]. Lueteltuna MMP-9:n ja -2:n geenien promoottorialueiden rakenne koostuu seuraavasti 5’ ketjusta luettuna. MMP-9:n transkription aloituskohta +1:ssä, TATA-box –29:ssä, GT-box – 68:ssa, TRE –79:ssä, CACA-alue –90:sta –131:een, TIE –474:ssä, TRE –533:ssa, GCbox –563:ssa, NFκB –600:ssa, TRE –1651:ssa, promoottorin päätös –2170:ssä. MMP2:lla +157:ssä AP-2-alue, transkription aloituskohta +10:ssä ja +1:ssä, GC-box –69:ssä ja –89:ssä, hiljennysjaksot (silencer) –1600:ssa ja –1620:ssa, AP-2-alue –1650:ssa, promoottorin päätös –2400:ssa. TATA-box on geeniluennan alotukseen liittyvä merkkialue. GT- ja GC-box:it ovat guaniini- tymiini- ja sytosiini-emäksiä vuorotellen sisältäviä toistojaksoalueita, jotka voivat toimia aktivaattorin tai inhibiittorin sitoutumispaikkoina. CACA-alue on 42 emäsparin sytosiini-adeniinitoistoalue. NFκB ja AP:t ovat aktivaattorispesifejä sitoutumispisteitä. NFκB ja GC-box (Sp-1-alue) ovat MMP-9:n promoottorissa PMA:n ja TNF-α:n vaikutuksen induktiokohtia. [6]. Kasvutekijät ja sytokiinit vaikuttavat lisäksi pidentämällä mRNA:n puoliintumisaikaa. Edellä mainittujen kasvutekijöiden lisäksi KGF ja TGF-β lisäävät metalloproteinaasitranskriptiota. Myös hormonit, onkogeenit, tuumoripromoottorit, hepariini sekä kontakti ekstrasellulaarimatriksiin voivat voimistaa tai heikentää transkriptiota. Useiden MMP:en.

21. tuotannon perustaso määräytyy geneettisesti promoottorialueella sijaitsevien kaksialleelisten yksittäisten nukleotidien polymorfismin kautta. Nämä polymorfismit voivat mutaatioissa johtaa sairauksiin, ja esim. kasvaimissa niiden esiintyminen on yleistä. MMP9:n ja MMP-12:n promoottorin polymorfismin on havaittu liittyvän sepelvaltimotaudin vakavuuteen ja MMP-9:n tapauksessa komplisoituneiden plakkileesioiden esiintymiseen sepelvaltimoissa, vaikka vaikutus transkriptioon onkin vaatimaton. Viimeaikaisten havaintojen perusteella useiden MMP:en transkriptio aktivoituu solujenvälisten reseptorikontaktien sekä solun ja matriksin kontaktien kautta. Tekijät, jotka vaikuttavat (fibroblasti-) solujen muotoon ja vaikuttavat solun aktiinisäikeiseen tukirankaan, lisäävät herkästi solujen MMP-ekspressiota [9]. [2]. Aktivaatiovälitteinen säätely: MMP-2:n säätely tapahtuu pääosin proentsyymin aktivaation määrän avulla, sillä tuotto ja eritys on tasaista. MMP-2 pilkkoutuu eri seriiniproteaasien kuten urokinaasin kaltaisen plasminogeeniaktivaattorin (u-PA), plasmiinin, trombiinin ja mast-soluperäisten proteinaasien tryptaasin ja kymaasin vaikutuksesta 62-kDa:n aktiivimuotoon. Reaktio on varsin herkkä ympäristötekijöille ja riippuu paljon solukalvoihin sitoutuneista aktivaattoreista. Aktivaatio estyy seriiniproteaasiinhibiittoreilla, muttei metalloproteinaasi-inhibiittoreilla, joten metalloproteinaasit eivät ilmeisesti osallistu MMP-2:n pilkkomiseen.. On havaintoja proMMP-2:n sitoutumisesta erityksen jälkeen solukalvoon, jossa mm. phorboliesterit, konkavaliini-A, vasta-aineet ym. voivat aktivoida sen [12]. Proentsyymiaktivaatio tapahtuu ilmeisesti pääosin perisellulaaritilassa erityspaikassa tai suoraan solukalvolla. TNF-α, PMA (phorboliesterit) ja lesitiini konkanavaliini-A lisäsivät fibrosarkoomasolulinjan MMP-2:n perisellulaarista aktivaatiota, ja ensin mainitut lisäsivät MMP-9:n eritystä. Fibroblastien ja fibrosarkoomasolujen käsittely PMA:lla nosti MMP-2:n mRNA:n tuotannon 2–3-kertaiseksi. Toisaalta on havaintoja, että fibroblasteilla PMA vähensi hieman MMP-2-ekspressiota (ei siis aktivaatiota) ja TNF-β lisää sen 2–4kertaiseksi. Osin MMP-2:n säätely tapahtuu siis myös transkriptiovälitteisesti. [18].

22. 1.4.3. MT-MMP-1:n rooli MMP-2:n aktivaatiossa (oligomerisaatiomalli). MT-MMP-1 on tärkeä MMP-2:n aktivaation säätelijä, jonka avulla solu kykenee käynnistämään perisellulaarisen proteolyysin. MMP-2:a erittyy jatkuvasti ”varastoon”. Eritys voi tulla samasta solusta tai viereisestä solusta. Solut säätelevät MT-MMP-1:n avulla MMP-2:n aktivoitumista ja siten perisellulaarista proteolyysiä. Molekyylien oligomerisoituminen vähentää inhibitorisia TIMP-2:ja ja tehostaa MMP-2:n toimintaa. Gelatinaasien rypästäminen solukalvolle lisää molekyylikontaktien ja autolyysin määrää. Solut voivat myös vähentää ympäristönsä gelatinolyysiä endosytoimalla MT-MMP-1:a kalvoltaan ja varastoimalla sen intrasellulaarisiin rakkuloihin. [12]. Oligomerisaatiomallin mukaan MT-MMP-1:n, TIMP-2:n ja MMP-2:n muodostamalla kompleksilla on tärkeä rooli MMP-2:n aktivaatiossa ja paikallisessa superaktivaatiossa. Solukalvoon sitoutuneet MT-MMP-1:t sitoutuvat aktiivisella kohdallaan TIMP-2-molekyylin inhibitoriseen N-päähän ja TIMP-2:n C-pää reagoi proMMP-2:n C-pään kanssa (hemopeksiini-domain), jolloin muodostuu solukalvossa kiinni oleva trimolekulaarikompleksi. Tällaisen kompleksin MMP-2:n aktiivikohta ei konformaatiomuutoksen seurauksena enää sido TIMP-2:a, jolloin TIMP-2:n inhibitiovaikutus estyy [6]. Kompleksimuodostukseen vaaditaan edeltävästi siis MT-MMP1:n aktivaatio. Tämän jälkeen viereiset solukalvoon sitoutuneet yksittäiset MT-MMP-1:t pilkkovat sitoutuneen proMMP-2:n 64 kDa:n välimuotoon, ja kaksi välimuotoista MMP-2:a pilkkoo toisensa intermolekulaarisessa autokatalyysissä aktiiviseen 62 kDa:n muotoon. Solukalvon yksittäiset MT-MMP-1:t pilkkovat samalla toisiaan autokatalyysissä 43 kDa:n inaktiivimuotoon. Malli myös selittää, miksi vähäisillä TIMP-2 pitoisuuksilla se lisää MMP2:n aktivaatiota (lisää proMMP-2:n sitoutumista MT-MMP-1:een ja vapaat MT-MMP-1:t pilkkovat pro-osan), mutta korkeilla pitoisuuksilla toimii inhibiittorina (solukalvolla ei ole enää vapaita MT-MMP-1:ä jotka aktivoisivat proMMP-2:a ja ylimääräiset TIMP-2:t sitovat proMMP-2:n). ProMMP-2:n aktivaation lisäämiseksi MT-MMP-1:n ja TIMP-2:n tulee esiintyä suunnilleen molaarisissa suhteissa 3:1 – 3:2. [12].

23. PMA lisää lievästi MT-MMP:n ekspressiota ja siten taipumusta MMP-2:n aktivaatioon. MMP-2:n aktivoitumiseen liittyy MT-MMP-1:n pilkkoutuminen 43 kDa:n muotoon [18]. PMA-stimuloiduissa fibrosarkoomasoluissa proMMP-2:n aktivaatio korreloi MT-MMP-1:n pilkkoutumisen määrään kalvoon sitoutuneeksi 43 kDa:n ja liukoiseksi 20 kDa:n muodoiksi. (Reaktiossa MT-MMP inaktivoituu autokatalyyttisesti. MT-MMP:n 60 kDa:n muoto on aktiivinen entsyymi, 43 kDa:n muoto inaktiivi.) MT-MMP-1:n oligomerisaation esto häiritsemällä joko sytoplasmisen tai hemopeksiinialueen toimintaa, esti sekä proMMP-2:n aktivaatiota että MT-MMP-1:n autokatalyyttistä inaktivaatiota. Solun erittämän MT-MMP-1:n endosytoosin esto lisäsi proMMP-2:n aktivaatiota. MT-MMP-1:n puutos geenimuunnelluissa hiirissä johtaa heikentyneeseen proMMP-2:n aktivoitumiseen. [12]. 1.4.4. Plasmiinin roolit ja MMP:en aktivaatio. Ekstrasellulaarimatriksin hajotukseen osallistuu laaja proteaasien aktivaatioketju. Tässä plasmiinilla on tärkeä rooli. Plasmiini pilkkoo esimuotoisen MMP-1:n, -3:n, -9:n, -10:n ja 13:n aktiivimuotoonsa, ja stromelysiini (MMP-3) taas aktivoi kollagenaasia (MMP-1) ja MMP-9:ää. Kudos- ja urokinaasityyppiset plasminogeeniaktivaattorit (t-PA ja u-PA) pilkkovat plasminogeenia aktiiviseksi plasmiiniksi. U-PA:n sitoutuminen solun reseptoriin johtaa perisellulaariseen plasminogeeniaktivaatioon, joka plasmiinin kautta aktivoi MMP:a (stromelysiinit ja kollgenaasit), ja perisellulaariseen proteolyysiin, joka on välttämätöntä SMC:en liikkumiselle. U-PA osallistuukin keskeisesti solumigraatioon, mutta sillä ei ilmeisesti ole vaikutusta proliferaatioon. Valtimon vaurioituessa ja ateroskleroosissa erittyy runsaaasti t-PA:a ja u-PA:a. [3, 19, 20]. U-PA-käsittelyllä (tutkimuksessa u-PA-konsentraatio oli 40–160 nM) 72 kDa:n proMMP-2 pilkkoutuu aktiiviseen 62 kDa:n muotoonsa [6]. U-PA-vasta-aineet estävät tämän reaktion, mutta plasmiini-inhibiittorit eivät, joten ilmeisesti aktivaatio ei tapahdu plasmiinin välityksellä. T-PA ei kyennyt MMP-2:n aktivaatioon. MMP-2:n aktivaation epäillään tapahtuvan lähinnä aivan perisellulaaritilassa. ProMMP-2:n pilkkomiseen vaadittavan liukoisen u-PA:n pitoisuuden täytyy olla melko korkea reaktion tapahtumiseksi, mutta in vivo u-PA esiintyy paikallisesti solukalvoilla sitoutuneena reseptoriproteiineihin ja.

24. kiinnittymisalueisiin (adhesion site), joissa sitä esiintyy paikallisesti suurina konsentraatioina. Näin luonnossa MMP-2:n aktivaatio on paikallista ja voimakasta. Verattuna liukoiseen u-PA:iin, reseptoriin sitoutuneen u-PA:n kyky hajottaa proMMP-2:a on myös kohonnut merkittävästi, sillä sopivaan reseptoriin sitoutuneena entsyymi tarjoutuu aktiivipaikka edellä ja mahdollisuus substraattimolekyylin kohtaamiseen oikeassa asennossa kasvaa. Solukalvoon sitoutunut entsyymi on myös paremmin suojautunut itseensä kohdistuvalta hajotukselta, jolloin molekyylin vaikutusaika pitenee. [6]. 1.4.5. Metalloproteinaasien inhibitio. Gelatinaasin aktiivisuus ja toiminta vaativat vapaata Ca2+:a ympäristössä. Solunsisäisen kalsiumin määrän lisääminen vähentää MMP-9:n ekspressiota ja MMP-2:n aktivaatiota ja alentaa siten gelatinolyysiä. Malignisoituneet solut menettävät kyvyn reagoida solunsisäiseen kalsiumiin. [16, 17]. Kalsiumionoforit mm. ionomysiini lisäävät solukalvojen kalsiumläpäisevyyttä, mikä lisää solujen kalsiumpitoisuutta. Metallikelaattorit, kuten EDTA ja 1,10-fenantroliini, ehkäisevät metalloproteinaasien aktiivisuutta (eksogeenisiä inhibiittoreita) reagoimalla aktiivikohdan Zn2+-ionin kanssa tai poistamalla sen. Nämä ovat epäselektiivisiä ja epäsfysiologisia aineita, eikä elimistössä tunneta niiden tapaan toimivaa fysiologista inhibiittoria. [6, 12]. Seerumin α2-makroglobuliini on tehokas proteinaasien ja MMP:en inhibiittori. Se toimii vangitsemalla sisäänsä syöttialuetta pilkkovan proteinaasin. α2-makroglobuliini on yleinen plasmaproteiini (pitoisuus veressä on 3 µM) ja on keskeinen MMP-inhibiittori kudosnesteissä. Tulehduksen aikana sen pitoisuus soluvälitilassa lähestyy plasmapitoisuutta, jolloin se on 100–1000-kertainen TIMP-pitoisuuteen verrattuna. [2, 6].

25. Metalloproteinaaseilla on endogeeniset kudosinhibiittorinsa: TIMP-1, -2 ja -3 (tissue inhibitor of metalloproteinases). Ne rajoittavat metalloproteinaasien vaikutusta kudoksessa. Tavallisesti kudoksessa vallitsee selvä TIMP:en ylimäärä verratuna ekstrasellulaarimatriksia hajottaviin metalloproteinaaseihin, jolloin kudoksen rakenne säilyy. Paikallinen kudoksen hajotusvaikutus saadaan aikaan konsentroimalla metalloproteinaasia hajotuskohtaan yli kudosinhibiittorien määrän tai estämällä TIMP:en pääsy vaikutusalueelle. Yksittäinen inhibiittorimolekyyli voi sitoutua tiiviisti irreversiibelisti mihin tahansa aktiiviseen metalloproteinaasimolekyyliin 1:1-suhteessa (harvoin voi 1:2 tai 2:2). TIMP:t sitoutuvat pääasiassa aktivoituihin MMP:eihin, mutta TIMP-2 sitoutuu lisäksi proMMP-2:een ja TIMP-1 proMMP-9:ään. TIMP-1:llä on korkea affiniteetti etenkin MMP1:een, MMP-2:een, MMP-9:ään ja MMP-3:een. [6, 9]. TIMP:t sitoutuvat voimakkaasti MMP-molekyylin aktiivisiin kohtiin ja estävät siten MMP:n toiminnan. TIMP:t myös aktivoivat MMP:ja. Esim. TIMP-2 sitoutuu kalvotyypin 1-MMP:iin ja muodostunut kompleksi sitoutuu MMP-2:een ja lisää MMP-2:n aktiivisuutta. (ks. oligomerisaatiomalli) MMP-2 ei kykene sitoutumaan solun pintaan ilman TIMP-2:a. Itsenäisenä TIMP-2 inhiboi spesifisti MMP-2:a. MMP-2-TIMP-2-kompleksin proteolyyttinen teho on n. 10 % MMP-2:n aktiivisuudesta. Sitoutuminen TIMP-2:een vähentää MMP-2:n itsehajotusta ja pidentää molekyylin ikää. Samoin TIMP-1 sitoutuessaan stabiloi MMP-9:ää hajotusta (esim. stromelysiinin) vastaan. TIMP-1 ja TIMP-2 ovat liukoisia. [6, 12] TIMP-3 sitoutuu suurella affiniteetilla ekstrasellulaarimatriksiin muodostaen liukenemattoman kompleksin ja näin mahdollisesti suojaa sidekudosta MMP:en vaikutuksilta [3].. Verisuonen SMC:t erittävät jatkuvasti MMP-2:a ja lisäksi TIMP-1:ä, TIMP-2:a ja TIMP-3:a. TIMP-2 erittyy liukoisena kompleksina MMP-2:n kanssa. TIMP-2:n eritys on tasaista ja jatkuvaa, mutta TIMP-1 ja TIMP-3 eritys stimuloituu kasvutekijöiden (PDGF:n, TGF-β:n, sekä EGF:n) ja PMA:n, eli samojen tekijöiden vaikutuksesta, jotka stimuloivat myös MMP:en eritystä. [12].

26. TIMP:en lisäksi trombospondiinit kykenevät inhiboimaan MMP-2:a ja MMP-9:ää, ja trombospondiinit lisäävät niiden poistumista kudoksesta lisäämällä kerääjäreseptorivälitteistä (scavenger) endosytoosia. [12]. 1.4.6. PMA. PMA (eli phorboli-12-myristaatti-13-asetaatti, tetradekanoyyliphorboliasetaatti) on tehokas tuumoripromoottori, ja se stimuloi RNA- ja DNA-synteesiä. Se toimii proteiinikinaasi-C:n aktivaattorina. On arveltu mahdolliseksi, että proteiinikinaasi-C on karsinogeenisten phorboliestereiden reseptoriproteiini. Proteiinikinaasi-C osallistuu useisiin monosyyttien toimintoihin, mm. fagosytoosiin, ja PMA stimuloi sen kuljetusta solukalvolle. Stromelysiinillä, MMP-9:llä ja mm. t-PA:lla on geeninsä 5’ -ketjun säätelyalueella PMAherkkä phorboliesterivasteyksikkö (TRE), joka välittää PMA:n kollagenaasituotannon induktiota. (ks. Transkription säätely) Alue puuttuu MMP-2:n geenistä. Esim. SMC:issa PMA lisää kollagenaasin, MMP-9:n ja stromelysiinin mRNA:n ja proteiinisynteesin määrää, mutta SMC:en MMP-2 -tuotantoon sillä ei ole vaikutusta. [19]. Fibrosarkoomasoluissa lusiferaasilla leimatun MMP-9:n määrä 2–3-kertaistui PMAkäsittelyllä. Maksimieritys saatiin kuuden tunnin kuluttua käsittelyn alusta, jonka jälkeen eritys laski vähitellen ja oli kolmenkymmenen tunnin kuluttua normaalitasolla [16]. Inkuboitaessa fibroblasteja PMA:ssa maksimaalinen MMP-9-ekspressio saavutetaan 12 h:ssa [6]. PMA:n kiihdyttävä vaikutus ekspressioon on ohimenevä, sillä tämän jälkeen ei MMP-9:n mRNA:n määrä solussa lisäänny. Pitkäaikainen korkea-annoksinen PMAinkubaatio alentaa solujen vastetta PMA:lle.. PMA lisää u-PA:n ja u-PA-reseptorin ekspressiota useissa solutyypeissä. PMA:n gelatinaasien aktivaattorimekanismiksi on ehdotettu myös, että se siirtää solukalvolla MTMMP-1:n ja MMP-2:n vierekkäisille alueille, jolloin ne aktivoivat toisiaan, paikallinen gelatinaasikonsentraatio kasvaa, ja muodostuvien reseptorikompleksien affiniteetti substraateille on korkeampi. [6].

27. 2. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET. Suoritettujen tutkimusten yleisenä tavoitteena oli tehdä peruskartoitusta monosyyttimakrofagien käyttäytymisestä eri olosuhteissa, missä olosuhteissa solut saadaan kasvamaan, ja onnistua mittaamaan MMP-9:n aktiivisuutta lineaarisessa tai logaritmisessa suhteessa. Tätä varten ajetuista geeleistä pyrittiin densitometrisesti mittaamaan raitojen kirkkaus, mutta tutkimuksen aikana menetelmästä ei saatu vielä riittävän luotettavaa ja vertailukelpoista..

28. 3. YLEISET METODIT. 3.1. Reagenssit. FCS hankittiin Biochrom AG:lta. LowMM standard hankittiin BioRad:lta. L-glutamiini, NEFA, RPMI 1640 ja X-VIVO hankittiin BioWhittakerilta. Coomassien sininen (Coomassie blue G250) hankittiin ICN Biomedicals:ilta. Natriumhydroksidi (NaOH) hankittiin JT. Bakerilta. TEMED hankittiin Kodak (Eastman company):lta. 2-propanoli, ammoniumpersulfaatti (APS), bromifenolin sininen, etikkahappo, Folin-Ciocaltean fenolireagenssi, glyseroli, glysiini, kaliumnatriumtartraatti (K-Na-tartraatti), kalsiumkloridi (CaCl2), kuparisulfaatti (CuSO4), natriumkarbonaatti (Na2CO3) ja sinkkikloridi (ZnCl2) hankittiin Merck:lta. Akryyliamidi, bisakryyliamidi, natriumdodekyylisulfaatti (SDS) hankittiin Servalta. Albumiinistandardi, gelatiini, Hepes 25 mM, Opi Media Supplement, PMA, pyruvaatti, Tris-HCl, TritonX-100 hankittiin Sigma (Sigma Chemical CO):lta.. 3.2. Soluviljely. 3.2.1. Käytetty solulinja. Tutkimuksissa tutkittiin metalloproteinaasien eritystä Mono-Mac-6-solulinjan avulla. Solut ovat ihmisen akuutin monosyyttileukemian soluja ja peräisin 64-vuotiaasta miehestä, jolla on uusinut akuutti monosyyttileukemia. Solut on eristetty potilaan ääreisverestä vuonna 1985 myeloidisen metaplasian havaitsemisen yhteydessä. Solulinjaa säilyttää ja ylläpitää Dr. H.W:L. Ziegler-Heitbrock Saksassa Münchenin Immunologian Instituutissa. Mono-Mac-solut ovat rakenteeltaan yksittäisiä pyöreitä tai monimuotoisia soluja, jotka voivat esiintyä pienininä rypästyminä ja ajoittain löyhästi tarttua alustaansa. 1–5 % soluista kehittyy jättiläissoluiksi. Suositeltu kasvatusliuos on 90 %:nen RPMI 1640 ja 10 %:nen.

29. FCS-liuos, jossa on 2 mM L-glutamiinia ja ei-essentiellejä aminohappoja, 1 mM natriumpyruvaattia, sekä 9 µg/ml naudan insuliinia. Suositeltu solujen kasvatustiheys on 0,3–1,0 x 106 solua/ml. Lipopolysakkaridikontaminaatio johtaa solujen rypästymiseen, kypsymiseen ja kasvun hidastumiseen. Suositusinkubaatio on 37 °C:ssa 5 % CO2pitoisuudessa. Solujen määrä kaksinkertaistuu noin kuudessakymmenessä tunnissa. Solujen pitkäaikaissäilytys tapahtuu jäädytettynä nestetypessä (–196 °C), liuoksessa, jossa 70 % on mediumia, 20 % FCS:a ja 10 % DMSO:a noin viisi miljoonaa solua per ampulli. [21, 22] Tutkimuksessa käytetään syöpäsoluja, koska niillä on käytännössä rajaton jakautumiskyky, sillä niiden DNA:n telomeerit eivät lyhene solujakautumisessa. Tämän seurauksena soluviljelmän elinikä ei ole rajattu eikä solujen toiminta heikkene ”ikääntymisen”myötä. Syöpäsolulinja on vakioitu ja siten paremmin vertailukelpoinen muihin solulinjoihin. Solulinjojen välistä geneettistä vaihtelua ja siitä seuraavia eroja solujen reaktiivisuudessa ei esiinny, kun solut ovat lähtöisin samasta alkuperästä.. MonoMac-solujen kasvatusliuoksen kaava on Liitteessä 1.. 3.2.2. Käytetyt mediumit. RPMI + FCS: RPMI on tunnettu vakioitu kasvatusliuos, jota usein käytetään 10 % seerumilisäyksen (sikiövasikan seerumi) kanssa.. RPMI: Aiemmin pidettiin yhtä MonoMac-linjaa pelkässä RPMI:ssä. Tätä käytettiin vertailukasvatuslinjana ja apuna optimaalisen kasvuympäristön löytämiseksi. Solut kasvoivat selvästi paremmin FCS:a sisältävässä liuoksessa. Ilman FCS:a oli jatkuvasti havaittavissa solujen hajoamisen merkkejä ja solut lisääntyivät muutenkin selvästi hitaammin. Kasvatuslinja lopetettiin 11.6.02..

30. X-VIVO 15: Yhtenä tutkimuksen kasvatusliuoksena käytettiin X-VIVO 15:ta. Se on BioWhittakerin seerumiton solujen ravitsemusliuos. Siinä ei ole eksogeenisia kasvutekijöitä, keinotekoisia kasvun stimulaattoreita tai määrittelemättömiä lisäaineita. Liuoksessa ei ole proteiinikinaasi-C:n stimulaattoreita. Liuos sisältää ihmisen albumiinia, rekombinanttista ihmisen insuliinia ja pastöroitua ihmisen transferriinia. X-VIVO 15 on optimoitu kasvaimen infiltroivien lymfosyyttien kasvatukseen ja tukee immunologisesti CD3-positiivisten solujen kasvua, ja sopii myös monosyyttien ja makrofagien kasvatukseen. X-VIVO:n tarkempi koostumus on valmistavan yrityksen yrityssalaisuus.. Soluviljelyssä vaaditaan hyvää steriliteettiä kontaminaatioiden estämiseksi. Tärkein kontaminaatio on elatusnesteissä hyvin kasvava aspergillus-home.. Solujen viljelyyn kuuluu tärkeänä osana säännöllisesti suoritettu elatusnesteen vaihto. Nesteen vaihto tuo soluille uusia ravintoaineita ja poistaa elatusnesteeseen eritetyt jäteaineet, viesti- ja välittäjäaineet sekä hajonneista soluista vapautuneet yhdisteet. Näin kasvuympäristö pysyy vakaana, eikä sinne kerry solujen kasvua häiritseviä tai niiden toimintaa muuttavia aineita.. 3.2.3. Elatusnesteen vaihto:. 1.. Soluviljelypullossa olevat MonoMac-solut suspendoidaan elatusnesteeseen ja suspensiota kaadetaan n. 15 ml koeputkiin. Loput vanhasta elatusnesteestä (soluineen) kaadetaan jäteastiaan.. 2.. Koeputkia sentrifugoidaan (10 min 230 x g).. 3.. Koeputkista kaadetaan vanha elatusneste jäteastiaan ja lisätään 5–10 ml uutta elatusnestettä.. 4.. Pyöristetään liekillä lasipipetin kärki ja purskutetaan koeputkissa elatusneste ja solut sekaisin niin, ettei jää solupaakkuja.. 5.. Pipetoidaan koeputkista solususpensiot soluviljelypulloihin (vanha tai uusi elatuspullo) ja lisätään elatusnestettä niin, että lopputilavuus on 20 ml..

31. Lämpökaapin asetukset: T = 38,1 °C, CO2 = 8–4 % (Kun CO2 laskee 4 %:iin n. 2 min aikana, tulee CO2-lisäys, joka nostaa pitoisuuden 7 %:n yli.). 3.3. SDS-PAGE zymografia. Zymografia on elektroforeesiin perustuva menetelmä, jolla molekyylit erotetaan koon ja sähköisen varauksen perusteella, ja jolla tunnistetaan pelkistämättömässä ympäristössä polyakryyliamidigeeliin erotettujen entsyymien proteolyyttinen aktiivisuus. Zymografia on arvioitu kvantitatiiviseksi menetelmäksi, sillä gelatiinin syöpyminen on suoraan verrannollinen gelatinaasin määrään 10–20-kertaisella asteikkovälillä (10–120 pg:n entsyymimäärällä lineaarinen). Lineaarinen alue riippuu entsyymin lastauksesta (loading) ja inkubointiajasta. Zymografialla on onnistuttu havaitsemaan luotettavasti 20 pg ja alimmillaan 2 pg entsyymikompleksin määriä tai 1 nM:n konsentraatioita. Aktiivinen ja latentti gelatinaasi ovat gelatiinisyövyttävyydeltään saman tehoiset, kun gelatinaasin määrä säilyy alle 120 pg, jolloin zymografiaa voidaan käyttää molempien määrän laskemiseen ja vertailuun. Vasta yli 300 pg:n määrillä aktiivimuoto toimii tehokkaammin. [13, 23]. 3.3.1. Mini-PROTEAN II-elektroforeesi:. SDS-PAGE-elektroforeesigeelit valmistetaan ns. Laemmlin menetelmällä [24, 25]. Kaksikerroksisessa elektroforeesigeelissä on analyyttinen alaosa ja ns. stacking-yläosa. Stacking-geeli konsentroi näytteen. Siinä oleva SDS varaa proteiinien aminohapot negatiivisiksi, jolloin proteiinit laskostuvat ja denaturoituvat ja menettävät entsymaattiset ominaisuutensa. Stacking-geelin ansiosta saadaan parempi proteiininauhojen (band) resoluutio. SDS vähentää proteiinien keskinäistä reagointia ja tarttumista, koska kaikki.

32. proteiinit ovat samassa varaustilassa. Analyyttinen geeliosa toimii väliaineena, johon proteiinit levittäytyvät kokonsa mukaan erotettuna.. Zymografiassa geeliin on valettu kollageenin hajoamistuotetta, gelatiinia. Näytteissä olevat gelatiinia hajottavat gelatinaasit pääsevät vaikuttamaan geelissä vain proteiinin lopullisessa kulkeutumispisteessä elektroforeesin valmistuttua. Kun SDS poistetaan (yl. TritonX-100:lla), gelatinaasit laskostuvat jälleen aktiiviseen muotoonsa, ja hajottavat gelatiinin siitä kohdasta, johon ovat edenneet. Coomassien sininen-väriaine värjää gelatiinin violetiksi, jolloin gelatinaasien hajottaman gelatiinin kohdalle jää vaalea raita. [13, 23]. SDS-PAGE-akryyliamidigeelissä akryyliamidi muodostaa yhtenäistä ketjua ja luo geelin pohjarakenteen. Bisakryyliamidi on haarakkeista. Se tekee poikittaisia sidoksia akryyliamidiketjujen välille, ja muodostaa siten verkon. Akryyliamidin ja bisakryyliamidin määrä ja suhde vaikuttavat nopeuteen, jolla proteiinit kulkeutuvat elektroforeesissa niiden muodostaman verkon läpi, ja mitä tiheämpää ja haarakkeisempaa verkko on, sitä hitaammin proteiinit kulkeutuvat geelin läpi. SDS-PAGE-geelistä käytetty prosenttiosuus tarkoittaa akryyliamidin osuutta geelissä. Tässä työssä se oli noin 7,5 % (7,43 %) ja bisakryyliamidiosuus 2,0 %. Stacking-geelissä osuudet olivat 5,0 % ja 0,13 %.. Geelien valmistuskaava on Liitteessä 3.. 3.3.2. Geelin valmistus:. Tarvittavat välineet: Bio Radin MiniProtean II-elektroforeesilaite sekä virtalähde [26].. SDS-PAGE-zymografian reagenssit luetellaan Liitteessä 2..

33. 1. Aseta kaivomuottikampa paikalleen lasilevyjen väliin muovisten tiivistelevyjen varaan. Merkitse 1–0,5 cm kamman kärkien alapuolelle lasiin merkki ja poista kampa. 2. Sekoita analyyttinen geelin reagenssit ja lisää lopuksi vasta APS ja TEMED ennen lasilevyjen väliin kaatoa. 3. Pipetoi analyyttinen geeli lasin merkkiin asti lasilevyjen väliin tasaiseksi kerrokseksi. 4. Peitä heti geeli vedellä (tai vesikylläisellä isobutanolilla tai t-amyylialkoholilla) varovasti ruiskuttaen. Pyri saamaan pinta mahdollisimman tasaiseksi. 5. Anna geelin polymerisoitua 45–60 min. Poista geeliä peittävä neste ja huuhtele tarvittaessa puskurilla. 6. Valmista stacking-geeli. Lisää APS ja TEMED lopuksi ennen käyttöä. 7. Kuivaa geelin yläpinta suodatinpaperilla. 8. Aseta kampa lasilevyjen yläosaan n. 10 ° vinossa kulmassa, jotta ilmakuplia ei jää geeliin kaivojen alle. 9. Pipetoi stacking-geeli lasilevyjen väliin kunnes kamman alakärjet ovat peitossa. Aseta kampa tiivistelevyjen varaan ja lisää stacking-geeliä matalamman lasilevyn yläpintaan asti. Kamman kärkien alle jääneitä ilmakuplia voi yrittää poistaa imemällä ja lisäämällä geeliä kammanpiikkien väleistä, sekä liikuttelemalla kampaa. 10. Anna geelin polymerisoitua 30–45 min. Vedä kampa varovasti ylös. 11. Huuhtele kaivot tislatulla vedellä tai ajopuskurilla pipetoimalla.. 3.3.3. Näytteiden valmistus:. 10 l näytemediumia sekoitetaan 30 l:n näytepuskuriin (ks. Liite 2), ja inkuboidaan (annetaan huoneen lämmössä proteiinin peittyä SDS:llä) 30 min. Kiehutusta ja pelkistimiä ei käytetä, sillä ne muuttavat gelatinaasin laskostumista. Näytettä pipetoidaan geelin kaivoihin 20 tai 25 l. Joka ajossa tulee olla mukana gelatinaasistandardi tai molekyylipainomarkkeri..

34. 3.3.4. Näytteiden ajo:. Geelit on pidettävä kylmänä ajon aikana käyttämällä paljon ajopuskuria tai suorittamalla ajo kylmähuoneessa. 1. Valmista 300 ml ajopuskuria sekoittamalla 30 ml 10x ajopuskuria 270 ml:aan tislattua vettä (tai 60 ml 5x puskuria 240 ml:aan). 2. Aseta sisempi jäähdytinrunko (jossa geelit ovat) alempaan puskurikammioon. Lisää n. 115 ml puskuria geelilasien väliseen jäähdytinrungon yläpuoliseen yläkammioon pidemmän lasilevyn puoliväliin asti. (Älä täytä liikaa, sillä ajon aikana muodostuu kuplia ja yläkammiosta ulos valuva ajopuskuri pilaa ajon.) 3. Kaada loput ajopuskurista alempaan kammioon niin, että vähintään 1 cm geelin alareunasta on puskurin pinnan alla. Tasaisen sähkökontaktin saamiseksi on tarkkailtava, että geelin alle ei jää ilmakuplia. 4. Pipetoi näytteet stacking-geelin kaivoihin Hamilton-ruiskulla ruiskun kärjen ollessa 1–2 mm kaivon pohjasta. Pipetointi on suoritettava varovasti ruiskun kärjestä valuttamalla, jotta näytettä ei purskahda kaivosta ulos. 5. Aseta kansi puskurialtaan päälle oikeat navat yläkammion värien mukaan. Liitä elektrodit jännitelähteeseen ja kytke virta. Aluksi näytteitä ajetaan 10 min 150 V jännitteellä ja sitten 50 min 200 V jännitteellä. Tarkkaile, että yläkammiossa on tarpeeksi puskuria eikä virta ala laskea tai puskuri kuohu yli.. 3.3.5. Värjäys:. Kun elektroforeesi on valmis, geelit erotetaan lasilevyistä ja pestään petrimaljalla (10 x 12 cm) 100 ml:ssa 0,25 % TritonX-100:aa kaksi kertaa 15 min. Pesu, inkubointi ja värjäys suoritetaan kevyellä sekoituksella Dubnoff-sekoittimessa tai rotaattorissa, jolla saadaan SDS irtoamaan geelistä ja proteiineista. Geelejä inkuboidaan yön yli 16 tuntia inkubointipuskurissa (ks. Liite 2) 37 °C:ssa. Tämän jälkeen puskuri poistetaan, ja geelit värjätään 0,1 % Coomassien sinisellä 40 % 2propanolissa vähintään yksi tunti. Gelatinaasien aktiivisuutta kuvaavat vaaleat raidat.

35. paljastetaan poistamalla ylimääräinen väri 7 % etikkahapossa. Värinpoiston jälkeen geelit säilötään 7 % etikkahappoon, jossa on 10 % glyserolia.. 3.4. Proteiinimääritys. Proteiinimääritys mittaa solujen määrää, jakaantumista ja hyvinvointia. Se auttaa selvittämään ovatko eri solukot keskenään vertailukelpoisia. Proteiinimäärityksessä selvitetään kaikkien solususpension proteiinien määrää. Tulos muodostuu pääasiassa soluihin itseensä sitoutuneista proteiineista, eikä mm. DNA:n tai RNA:n lisääntyminen aktiivisen proteiinituotannon aikana juurikaan vaikuta tulokseen. Toimenpiteessä solut hajotetaan ja liuotetaan, jolloin saadaan proteiinipitoinen suspensio.. Proteiinimääritys toteutettiin Lowryn menetelmällä [27] käyttäen SDS-NaOH:iin liuotettuja näytteitä. Vakiona oli naudan albumiini (ks. liite). Kontrollina oli laimennettu humaaniseerumi.. Proteiinimäärityksen reagenssit luetellaan Liitteessä 4.. 3.4.1. Näytteiden valmistus:. Näytteet käsiteltiin eri tavoin seuraavasti: 1. Standardit -. Albumiinistandardin laimennoksista pipetoidaan 100 µl ja lisätään 100 µl 10 % SDS:a vastaamaan näytteiden pitoisuutta.. -. Standardisarjaan tulee nollakokeeksi 100 µl 0,9 % NaCl..

36. 2. Solunäytteet -. Solut liuotetaan sopivaan määrään (0,5–1,0 ml) 5 % SDS – 0,5 M NaOH:a huoneenlämmössä välillä sekoittaen (vorteks, sonikaattori).. -. Liukenemisen pitäisi tapahtua muutamassa tunnissa. Tarvittaessa näytteet voi jättää yön yli huoneenlämpöön. Jos on tarpeen, näytteet on sentrifugoitava (5 min noin 1 900 x g) ennen pipetointia.. -. Määritykseen pipetoidaan näytteestä 200 µl tai 100 µl näytteen konsentraation mukaan.. 3. Kontrollinäyte valmistetaan kuten standardi, mutta ilman laimennusta.. 3.4.2. Proteiinimäärityksen suoritus:. 1. a) Kohdan 1 ja 3 mukaisiin näytteisiin lisätään 1,0 ml reagenssia C, vorteksoidaan. b) Kohdan 2 mukaisiin näytteisiin lisätään 1,0 ml reagenssia D, vorteksoidaan. 2. Lisätään 100 µl reagenssia E. Lisäyksen ajan vorteksoidaan voimakkaasti. 3. Putkien annetaan seistä vähintään 30 min (< 2 h). 4. Mitataan absorbanssit nollakoetta (0,9 % NaCl) vastaan 750 nm:n aallonpituudella.. Näytteistä ja standardeista tehdään rinnakkaismääritykset, jolloin kone laskee näistä keskiarvon. Ennen tutkittavia näytteitä ajetaan kontrollinäyte, jonka pitoisuus on tunnettu. Spektrofotometri Cary:n ohjelma WinUV laskee kaavasta näytteiden konsentraation, vaikka arvo olisi standardien ulkopuolella (tietyissä rajoissa).. Huom! Jos näytteen tummuus on silmämäärin liian suuri, vähennä näytettä, ja korvaa puuttuva osa SDS-NaOH:lla..

37. 4. TYÖKOHTAISET METODIT. Suoritetut työt: Esityö 1: Seerumilaimennossarja Esityö 2: PMA:n vaikutus MonoMac-6-solujen metalloproteinaasieritykseen – vertailu sileihin lihassoluihin Koe 1 ja 2: MonoMac-solujen aktiivisuus ajan funktiona Koe 3: Elatusnesteen vaikutus ja seerumittoman mediumin testaus Koe 4: PMA-konsentraation vaikutus MonoMac-6-solujen MMP-tuotantoon eri elatusnesteissä. 4.1. Huomioita edeltävien tutkimusten perusteella. Ennen tässä mainittujen töiden suoritusta oli toteutettu aiempia töitä. Edeltävien töiden tavoitteena oli käyttökelpoisen geelin tuottaminen myöhempiä zymografisia kokeita varten. Alkujaan valmistetut geelit olivat suurikokoisempia kuin myöhemmät, ja geelien valmistuskaavassa on ajan mittaan tapahtunut joitakin muutoksia. Geelien valmistaminen on haastavaa, ja se vaatii rutiinia ja tarkkuutta, eikä edes toimivalla kaavalla työtään aloitteleva tutkija saa välttämättä onnistunutta lopputulosta. Epäonnistuneen geelin syy on joskus arvoitus ja tilanne saattaa korjautua jo pienillä metodologisilla tai koostumuksen muutoksilla..

38. 4.2. Seerumilaimennossarja. 4.2.1. Tavoite ja aineisto. Työn (”esityö 1”) pääasiallisena tavoitteena oli löytää sopiva seerumikonsentraatio käytettäväksi muiden töiden seerumistandardina niin, että seerumin raidat näkyisivät sopivalla ja vertailukelpoisella kirkkaudella. Seeruminäyte valmistettiin vapaehtoisen koehenkilön verestä ja varastoitiin pakkaseen –70 °C:een. Seerumista zymografiassa muodostuvat raidat tunnetaan ja tiedetään, että seerumin proMMP-9-pitoisuus on n. 50 g/l (50,6 +/– 23,1) [28]. Jokaisessa geelissä olevaa seeruminäytettä on näin ollen mahdollista käyttää myös densitometrisissä mittauksissa kalibrointiin mitattaessa geelin raitojen gelatinaasikonsentraatiota.. 4.2.2. Zymografia. SDS-PAGE-geeli valmistettiin perusohjeen mukaisesti. Seeruminäytteestä valmistettiin aluksi kaksi laimennosta, 1:10 ja 1:100 laimennos ajopuskuriin, ja nämä laimennettiin edelleen niin, että seerumin pitoisuus vaihteli välillä 9,0–0,1 %. Molekyylistandardina toimi 10 l BioRad LowMM-standardi, joka on jo valmiiksi käsitelty ja värjätty, eikä tarvitse näytepuskuria..