i IDENTIFIKASI RAGAM ALEL PADA TIGA LOKUS
DNA MIKROSATELIT AUTOSOM MASYARAKAT SOROH PANDE DI KABUPATEN GIANYAR UNTUK KEPENTINGAN FORENSIK
Skripsi
Sebagai tugas akhir untuk memenuhi syarat mencapai derajat Sarjana S-1 Program Studi Biologi FMIPA Universitas Udayana
Oleh
Gusti Ayu Putri Arnila 1208305010
PROGRAM STUDI BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA
ii SKRIPSI
IDENTIFIKASI RAGAM ALEL PADA TIGA LOKUS
DNA MIKROSATELIT AUTOSOM MASYARAKAT SOROH PANDE DI KABUPATEN GIANYAR UNTUK KEPENTINGAN FORENSIK
Oleh
Gusti Ayu Putri Arnila 1208305010
Telah dipertahankan di depan Tim Penguji dan telah dinyatakan lulus pada tanggal 13 April 2016
Menyetujui
Pembimbing I Pembimbing II
Prof. Dr. Drs. I Ketut Junitha, M.S Ir. Made Pharmawati. MSc. PhD. NIP. 19570628 198403 1 003 NIP. 196807071 199303 2 001
Mengesahkan
Ketua Program Studi Biologi FMIPA Universitas Udayana
iii KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan ke hadapan Tuhan Yang Maha Esa karena atas berkat dan rahmat-Nya skripsi yang berjudul “Identifikasi Ragam Alel Pada Tiga Lokus DNA Mikrosatelit Autosom Masyarakat Soroh Pande Di Kabupaten Gianyar Untuk Kepentingan Forensik” dapat diselesaikan pada waktunya.
Dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah mendukung dan membantu dalam penyusunan skripsi ini, diantaranya:
1. Yth. Prof. Dr. Drs. I Ketut Junitha, MS dan Ibu Ir. Made Pharmawati, MSc. PhD. selaku dosen pembimbing I dan pembimbing II dengan sabar memberikan bimbingan, dukungan, saran dan bantuan selama pelaksanaan kegiatan penyusunan usulan penelitian ini.
2. Yth. Ibu Dra. Ni Nyoman Wirasiti, M.Repro, Ibu Dra. Inna Narayani, M.Sc dan Ibu Dr. Dra. Ngurah Intan Wiratmini, M.Sc selaku dosen penguji I, penguji II dan penguji III yang telah memberikan kritik, saran, petunjuk serta koreksi yang dilakukan selama penyusunan usulan penelitian ini.
3. Yth. Ibu Dr. Dra. Ngurah Intan Wiratmini, M.Sc sebagai dosen Pembimbing Akademik yang telah memberikan bimbingan, saran, dan dukungan selama penyusunan usulan penelitian.
4. Seluruh Dosen dan staf pegawai atas bimbingan dan kemudahan selama penulis menempuh kuliah, melaksanakan penelitian dan penyusunan skripsi.
iv 6. Sahabat tersayang Ida Ayu Manik Damayanti S.Si, Eka Budi Mursafitri S.si, Ruth Ellisa Christiani, Desi Damayanti, Ni Kadek Wiwik Sinta Dewi, Dewi Yuliani, I Gusti Ayu Daivisvetha Rnaya, I Gusti Putu Ayunda Pratiska dan Rahayu Rhevy, kepada I Wayan Arya Mahardika yang telah membantu saat penelitian serta seluruh teman-teman Jurusan Biologi dan berbagai pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah membantu dalam penelitian, memberikan doa dan semangat kepada penulis.
Besar harapan penulis skripsi ini dapat menambah pengetahuan dan bermanfaat bagi pembaca.
Gianyar, Maret 2016
v INTISARI
Identifikasi Ragam Alel Pada Tiga Lokus DNA Mikrosatelit Autosom Masyarakat Soroh Pande di Kabupaten Gianyar
untuk Kepentingan Forensik
Perkembangan ilmu forensik berkaitan erat dengan penggunaan analisa DNA mikrosatelit sebagai salah satu sarana yang paling akurat untuk mengungkap identitas seseorang. Penelitian ini dilaksanakan untuk mengetahui ragam alel yang tersebar pada masyarakat soroh Pande di Kabupaten Gianyar dengan menggunakan tiga lokus DNA mikrosatelit autosom yaitu D2S1338, D13S317 dan D16S539. Berdasarkan hasil analisa ditemukan 23 ragam alel dengan rata-rata 7,3 per lokus. Rata-rata nilai heterozigositas dari tiga lokus yang digunakan adalah 0,817 ± 0,029menunjukkan bahwa secara genetik masyarakat soroh Pande sangat bervariasi. Rata-rata nilai Power of Discrimination adalah 0,893. Tingginya nilai
Power of Discrimination menunjukkan bahwa ketiga lokus ini baik digunakan untuk membedakan antar individu pada kepentingan forensik. Pengelompokan masyarakat soroh Pande pada dendogram tidak berkaitan dengan Pura Kawitan maupun lokasi tempat tinggal.
vi ABSTRAK
Identification of Allele Diversity in Three Autosomal Microsatellites DNA Loci of Pande Clan in Gianyar Regency for Forensic Studies.
The development of forensic science is closely related to the use of microsatellite DNA analysis as one of the most accurate means to reveal the person's identity. This study was conducted to determine the range of alleles distribution in society of soroh Pande in Gianyar. Three autosomal microsatellite DNA loci were used which were D2S1338, D13S317 and D16S539. Based on the analysis there were 23 varieties of allele found with an average of 7,3 allele per locus. The average level of heterozygosity from three loci used was 0,817 ± 0,029 indicates that soroh Pande genetically very varied community. The average value of the Power of Discrimination was 0,893. The high value of the Power of Discrimination showed that the three loci were best used to distinguish between individuals in forensic studies. The groupings of soroh Pande on dendogram were not associated with Kawitan Temple or place of residence.
Keyword : Soroh Pande, Microsatellite DNA, Heterozygosity, Power of
vii DAFTAR ISI
Judul Halaman
HALAMAN JUDUL ... i
HALAMAN PENGESAHAN ... ii
KATA PENGANTAR ... iii
INTISARI ... v
ABSTRAK ... vi
DAFTAR ISI ... vi
DAFTAR TABEL ... viii
DAFTAR GAMBAR ... ix
DAFTAR LAMPIRAN ... x
I. PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang ... 1
1.2. Rumusan Masalah ... 4
1.3. Tujuan Penelitian ... 4
1.4. Manfaat Penelitian ... 4
II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Forensik ... 5
2.2. Soroh Pande ... 6
2.3. Deoxyribonucleic acid (DNA)... 7
2.4. Penanda DNA Mikrosatelit ... 8
2.5. Ekstraksi DNA ... 9
2.6. Polymerase Chain Reaction (PCR) ... 10
2.7. Elektroforesis ... 11
III. METODE PENELITIAN 3.1. Metode Pengumpulan Data ... 13
3.1.1.Waktu dan tempat penelitian ... 13
3.1.2.Teknik pengambilan sampel ... 13
3.1.3.Variabel penelitian ... 13
3.1.4.Tahapan Analisa DNA ... 14
viii
3.1.4.2. Polymerase Chain Reaction (PCR) ... 14
3.1.4.3. Elektroforesis DNA hasil PCR... 15
3.1.4.4. Visualisasi DNA hasil PCR ... 16
3.2. Metode Pengolahan Data ... 17
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil ... 18
4.2. Pembahasan ... 25
V. KESIMPULAN DAN SARAN 5.1. Kesimpulan ... 31
5.2. Saran ... 31
DAFTAR PUSTAKA ... 32
ix DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 1. Primer yang Digunakan untuk Analisa Mikrosatelit ... 15 Tabel 2. Sampel yang Berhasil Teramplifikasi dan Tidak Teramplifikasi
pada Masing-masing Lokus ... 18 Tabel 3. Frekuensi Alel Masyarakat Soroh Pande di Kabupaten
x DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Patirtan Perapen masyarakat soroh Pande ... 3
Gambar 2. Hasil visualisasi DNA ... 19
Gambar 3. Hasil visualisasi amplikon pada lokus D2S1338 ... 20
Gambar 4. Hasil visualisasi amplikon pada lokus D13S317 ... 21
Gambar 5. Hasil visualisasi amplikon pada lokus D16S539 ... 22
Gambar 6. Dendogram 28 sampel masyarakat soroh Pande hasil analisa kelompok berdasarkan panjang alel dengan metode UPGMA ... 25
Gambar 7. Semilog Plot Hutchinson ... 37
Gambar 8. Pengambilan sampel masyarakat soroh Pande ... 41
Gambar 9. Pura Kawitan masyarakat soroh Pande ... 42
xi DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Semi-log plot Hutchinson ... 37
Lampiran 2. Lembar Biodata Probandus ... 38
Lampiran 3. Lembar Informed Consent ... 40
Lampiran 4. Kegiatan Pengambilan Sampel ... 41
i I. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Ilmu forensik didasari oleh metode ilmu alam dan dikategorikan ke dalam ilmu pengetahuan alam. Ilmu pengetahuan alam menganggap sesuatu memang ilmiah apabila didasari oleh fakta (empirisme), kebenaran ilmiah yang dapat dibuktikan (positivisme), serta analisanya mampu dituangkan dengan masuk akal dan bermakna sehingga hasilnya dapat disampaikan ke masyarakat luas (Siswanto, 2010). Meningkatnya kasus kejahatan seperti pemerkosaan, bom dan mutilasi serta banyaknya bencana alam yang tidak terduga seperti tsunami, pesawat jatuh dan tanah longsor, mengakibatkan banyak korban yang tewas dan sulit dikenali secara fisik sehingga meningkatkan jumlah korban yang tidak diketahui identitasnya (Octavia, 2015; Junitha dan Alit, 2011; Wirasuta, 2008).
ii delapan alel pada lokus D16S539. Penelitian lainnya adalah identifikasi alel masyarakat Dayak Kaharingan di Kota Palangka Raya dengan menggunakan tiga lokus DNA mikrosatelit autosom menunjukkan bahwa terdapat 11 alel pada lokus D2S1338 dan Sembilan alel pada lokus D13S317 dan lokus D16S539 (Octavia, 2015).
Indonesia merupakan negara multikultural yang terdiri dari berbagai suku bangsa. Keberagaman suku bangsa ditandai dengan adanya perbedaan ras, bahasa, agama, kepercayaan, adat istiadat (custom), kebiasaan (folkways), tata kelakuan
(mores) serta perbedaan bentuk sosial budaya lainnya (Nasikun, 1993).
Masyarakat Hindu di Bali membentuk kelompok-kelompok berdasarkan garis keturunan laki-laki (patrilineal) yang diyakini merupakan keturunan dari satu leluhur disebut sebagai soroh (klan) yang memiliki Pura Kawitan utama. Salah satu diantara soroh-soroh tersebut adalah soroh pande yang tersebar di Pulau Bali. Berdasarkan sejarah, masuknya masyarakat soroh Pande yang berasal dari berbagai sumber genetik sejak zaman pra sejarah dan menjadi cikal bakal soroh
Pande saat ini terjadi dalam beberapa gelombang. Perpindahan masyarakat soroh
iii menyebar ke berbagai daerah yang memerlukan mereka, sehingga masyarakat
soroh Pande tersebar hampir di seluruh Bali (Darmada dan Sutama, 2001).
Pada tahun 1975 telah berdiri sebuah organisasi yaitu Maha Semaya Warga Pande (MSWP). Organisasi ini dibentuk agar semua warga Pande diseluruh Bali bersatu tanpa memandang siapa yang paling tinggi dan tidak saling merendahkan dengan mengadakan sebuah perjanjian bahwa semua warga Pande berasal dari keturunan yang sama yaitu dari Mpu Brahma Wisesa. Keberadaan organisasi MSWP yang bertujuan mulia ini dibentuk di Provinsi, Kabupaten dan Kecamatan, sehingga keberadaan organisasi MSWP ini sangat membantu dalam memberikan informasi tentang jumlahmasyarakat soroh Pande yang ada di Bali. Salah satu ciri khas keberadaan masyarakat soroh Pande adalah adanya Patirtan Perapen
dimasing-masing rumah (Gambar 1). Patirtan Perapen merupakan sumber mata air suci untuk memohon tirta perapen bagi lelintihan pasemetonan pande dalam kegiatan keagamaan tertentu (Jiwa, 2013).
Gambar 1. Patirtan Perapen masyarakat soroh Pande
iv Berdasarkan latar belakang tersebut, maka dilakukanlah penelitian menggunakan tiga lokus DNA mikrosatelit autosom untuk mengetahui ragam alel yang tersebar pada masyarakat soroh Pande di Kabupaten Gianyar serta sebagai referensi untuk memudahkan pengungkapan identitas korban yang tidak dapat dikenali secara fisik dan bermanfaat dalam kepentingan forensik.
1.2. Rumusan Masalah
1. Berapakah ragam alel, keragaman genetik serta Power of Discrimination yang ditemukan pada masing-masing lokus DNA mikrosatelit autosom pada masyarakat soroh Pande di Kabupaten Gianyar ?
2. Bagaimanakah pengelompokan sampel masyarakat soroh Pande di Kabupaten Gianyar berdasarkan tiga lokus DNA mikrosatelit autosom yang digunakan ?
1.3. Tujuan
1. Untuk mengetahui ragam alel, keragaman genetik serta Power of
Discrimination yang ditemukan pada masing-masing lokus DNA
mikrosatelit autosom pada masyarakat soroh Pande di Kabupaten Gianyar.
2. Untuk mengetahui pengelompokan sampel masyarakat soroh Pande di Kabupaten Gianyar berdasarkan tiga lokus DNA mikrosatelit autosom yang digunakan.
I.4. Manfaat
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai ragam alel, keragaman genetik serta Power of Discrimination pada masing-masing lokus D2S1338, D13S317 dan D16S539 pada masyarakat soroh Pande di Kabupaten Gianyar. Data yang dihasilkan dapat digunakan untuk melengkapi
DNA database suku-suku yang ada di Indonesia dan bermanfaat dalam
5 II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Forensik
Forensik berasal dari Bahasa Latin yaitu forum yang berarti tempat untuk melakukan transaksi. Ilmu forensik merupakan ilmu yang menerapkan dan memanfaatkan ilmu pengetahuan dalam mengungkap suatu kasus tindak pidana dengan cara menyusun kembali (rekonstruksi) tindak pidana tersebut bisa terjadi berdasarkan pada bukti-bukti yang ada. Ilmu forensik berdasarkan metode ilmu pengetahuan alam akan menganggap sesuatu memang ilmiah apabila didasari oleh fakta (empirisme), kebenaran ilmiah harus dapat dibuktikan (positivisme), serta analisanya mampu dituangkan dengan masuk akal dan bermakna sehingga hasilnya dapat disampaikan ke masyarakat luas (Siswanto, 2010).
Crime Science Investigation (CSI) merupakan suatu metode pendekatan penyidikan berbasis ilmu pengetahuan alam untuk mengungkap suatu kasus yang terjadi. Metode CSI melakukan analisa yang melibatkan ilmu pengetahuan untuk membuat barang bukti dan tempat kejadian perkara (TKP) “berbicara” tentang suatu tindak kejahatan yang sudah terjadi sebagai pokok bahasan di bidang Forensik (Siswanto, 2010). Penggunaan metode CSI dalam mengungkap kasus pidana dapat mempermudah penyidik untuk membuat terang kasus pidana dengan tindakan olah TKP sehingga meminimalisir kesalahan serta mendukung penegakan hukum di Negara ini (Wahyuni, 2013).
Prinsip dasar Ilmu Forensik yang telah digagas oleh Dr. Edmond Locard adalah Locard Exchange Principle menyatakan bahwa ketika seseorang masuk ke TKP maka orang tersebut akan meninggalkan jejak dirinya dan membawa jejak TKP ketika dia pergi. Berdasarkan hal tersebut terjadilah pertukaran materi secara fisik yang dapat dijadikan sebagai barang bukti untuk mengungkap kasus tindak pidana tersebut (Octavia 2015; Kirk, 1953).
6 sering digunakan hingga saat ini. DNA merupakan barang bukti primer yang berdiri sendiri tanpa diperkuat dengan bukti lainnya. Melalui pembuktian secara ilmiah ini, diharapkan polisi, jaksa dan hakim dapat memanfaatkan bukti-bukti ini untuk menegakkan kebenaran dari sebuah kasus dalam sebuah peradilan, disamping hanya mengandalkan pengakuan dari tersangka ataupun saksi yang mungkin saja bisa memberikan keterangan yang tidak sebenarnya (Wirasuta, 2008).
2.2. Soroh Pande
Masyarakat Hindu di Bali sangat meyakini Panca Srada sebagai dasar dalam menjalankan hidup di dunia. Salah satu srada yang masih dipercaya hingga saat ini adalah keyakinan akan adanya leluhur. Istilah “memande” merupakan salah satu profesi leluhur yang diyakini oleh keturunannya dan hingga kini disebut klan atau soroh Pande. Arti dari kata “memande” merupakan suatu pekerjaan yang menghasilkan alat-alat berbahan dasar logam yang sangat berguna bagi seluruh lapisan masyarakat seperti alat-alat pertanian yaitu sabit dan pacul, peralatan rumah tangga yaitu pisau, kapak dan gembok, senjata seperti keris, tombak dan trisula, alat-alat keagamaan antara lain kendi, bokor dan canting, alat-alat kesenian yaitu gong, atribut penari dan perhiasan serta peralatan lainnya yang berhubungan dengan bara dan logam (Darmada dkk., 2007). Masyarakat soroh Pande yang memiliki keahlian dalam bidang pembuatan senjata dan alat-alat dari besi disebut pande besi, yang pandai dalam membuat busana dan perhiasan yang terbuat dari logam mulia seperti emas, perak kuningan dan lainnya disebut pande emas. Soroh
Pande yang ahli dalam membuat alat-alat tetabuhan seperti gong, terompong, kempul gangsa dan kelengkapannya disebut pande gong serta beberapa keahlian lainnya yang sulit dapat dikerjakan oleh masyarakat soroh lainnya (Jiwa, 2013).
7 didirikanlah Puri di Desa Bengkel (Desa Beng) yang akhirnya Puri tersebut dipindah ke Gianyar (Griya Anyar). Beliau disertai oleh Pande Tusan dari Taman Bali yang hingga saat ini masih menetap di Desa Bengkel (Desa Beng) atau bahkan sudah ada yang berpindah ke tempat baru bila belum ada masyarakat
soroh pandenya di daerah tersebut. Demikian seterusnya hingga akhirnya
pertalian antara masyarakat soroh Pande sulit dibedakan karena perbedaan masa kedatangannya ke Pulau Bali (Darmada dan Sutama, 2001).
Hingga saat ini keberadaan masyarakat soroh Pande sudah tersebar hampir di seluruh Bali dan salah satunya adalah di Kabupaten Gianyar. Terdapat 15 Dadia yang tersebar di Kabupaten Gianyar yaitu Dadia Pande di Beng (Bengkel), Serongga, Abian Base, Sidan, Blahbatuh, Sukawati, Celuk, Tampak Siring, Kedisan, Peliatan, Juga, Singakerta, Kelusa, Semita dan Lod Tunduh (Darmada dan Sutama, 2001). Menurut Tokoh masyarakat di Desa Beng, Mangku Tapakan menyatakan bahwa sampai saat ini jumlah masyarakat soroh Pande di Desa Beng sebanyak 285 Kepala Keluarga dan beberapa diantaranya masih “memande”, walaupun tidak semua menggeluti profesi “memande” dan sudah beralih pada profesi lain seperti pengelola hotel, artshop, guru dan sebagainya mereka dibebaskan untuk memilih profesi apa yang ingin dilakoni semasa hidupnya, namun tetap ingat dan berbakti kepada leluhur (Mangku Made Tapakan, Desa Beng Gianyar, 2015, kom.pri).
2.3. Deoxyribonucleic acid (DNA)
Deoxyribonucleic acid (DNA) adalah asam nukleat yang membawa
8 Susunan kimiawi DNA yang kompleks terdiri dari tiga macam molekul yaitu, gula pentosa (deoksiribosa), asam fosfat dan basa nitrogen. Basa nitrogen dibedakan atas dua tipe yaitu kelompok pirimidin (sitosin dan timin) merupakan jenis basa nitrogen yang memiliki satu cincin organik serta kelompok purin (adenine dan guanin) merupakan jenis basa nitrogen yang terdiri atas dua cincin organik (Suryo, 2010). Molekul DNA merupakan molekul-molekul linear yang terdiri dari sebuah polimer panjang polinukleotida. Gugus fosfat menyambung residu deoksiribosa pada 5’-C dengan nukleotida berikutnya pada 3’-C, sehingga ikatan-ikatan fosfodiester ini mengikat nukleotida-nukleotida kompleks menjadi satu membentuk tulang punggung DNA (Gunarso, 1988). Untaian-untaian polinukleotida ini akan membentuk struktur double helix dan akan dipegang oleh ikatan hidrogen yang dibentuk oleh satu basa purin yang telah berpasangan dengan satu basa pirimidin (Faatih, 2009).
2.4. Penanda DNA Mikrosatelit
Analisa DNA mikrosatelit merupakan salah satu ciri genetik yang sudah diaplikasikan secara meluas untuk mempelajari sistem perkawinan, struktur populasi, pautan (linkage), pemetaan kromosom dan analisa populasi. Hal ini dikarenakan DNA mikrosatelit sangat polimorfik dan jumlahnya banyak dalam DNA genom (Sumantri dkk., 2008). DNA mikrosatelit dapat digunakan untuk membandingkan genotip dari individu yang mempunyai hubungan kekerabatan yang dekat. Mikrosatelit juga bersifat kodominan, karenanya memiliki kemampuan mendeteksi yang tinggi terhadap keragaman alel dan tidak terlalu mahal untuk dianalisa dengan menggunakan PCR (Haryati, 2011).
9 basa yang bervariasi disebut sebagai polimorfisme serta daerah yang teramplifikasi oleh primer dinyatakan sebagai lokus dengan variasi panjang produk PCR sebagai alel (Chaerani dkk., 2009).
Penanda molekuler dapat digunakan sebagai alat bantu seleksi pada generasi awal dengan tingkat ketelitian yang lebih tinggi yaitu dengan menentukan penanda yang terpaut dengan suatu sifat yang diinginkan. Identifikasi fragmen spesifik dapat dilakukan dengan analisa dan pemetaan Quantitative Trait Loci
(QTL) (Roberdi dkk., 2010). Penelitian lain yang menggunakan DNA mikrosatelit adalah variasi genetik masyarakat Bali Mula di Desa Sembiran Buleleng dengan penanda DNA mikrosatelit menggunakan empat lokus yaitu D2S1338, D3S1358, D5S818 dan D13S317 yang menunjukkan bahwa ditemukannya 19 ragam alel pada lokus D13S317 sebanyak enam alel pada lokus D2S1338, pada lokus D3S1358 sebanyak lima alel dan sebanyak tiga alel pada lokus D5S818 (Dwitiari, 2012).
Masing-masing lokus DNA mikrosatelit memberikan ragam alel yang akan mempengaruhi tinggi rendahnya nilai heterozigositas dan nilai kekuatan pembeda
(Power of Discrimination). Penentuan dalam penggunaan lokus DNA mikrosatelit
yang baik digunakan dalam analisa DNA didasarkan pada tingginya nilai heterozigositas dan Power of Discrimination yang dihasilkan (Octavia, 2015; Rudin and Crim, 2002).
2.5. Ekstraksi DNA
Analisa DNA diawali dengan ekstraksi atau isolasi DNA yang merupakan teknik dasar untuk mempelajari teknik biologi molekuler. Ekstraksi DNA bertujuan untuk memisahkan asam nukleat dari komponen sel lain yang tidak diperlukan seperti protein, karbohidrat, lemak dan lainnya (Davis et al., 1993). Proses ekstraksi dilakukan secara bertahap meliputi, isolasi dari jaringan, pelisisan dinding dan membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi serta presipitasi atau pemadatan (Wulandari dkk., 2014; Jehuda, 2011).
10 Salah satu metode yang paling umum digunakan adalah metode fenol-kloroform (Toha, 2001). Prinsip utama dari metode fenol-kloroform adalah memisahkan protein dan DNA dari sel oleh fenol-kloroform dilanjutkan dengan presipitasi DNA menggunakan alkohol. Proses sentrifugasi juga sangat berperan penting dalam isolasi DNA, sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya dengan memberikan gaya sentrifugal pada kecepatan tertentu. Hasil sentrifugasi akan menunjukan dua fraksi terpisah, yaitu molekul ringan akan berada pada bagian atas dan molekul berat berada di bagian dasar tabung (Sambrook and Russel, 2001).
2.6. Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi berantai polimerase
merupakan suatu metode enzimatis untuk memperbanyak sekuen nukleotida tertentu secara in vitro. Kelebihan metode PCR ini adalah dapat memperbanyak molekul DNA dan memisahkan gen-gen tertentu, juga mampu bekerja dengan komponen yang jumlahnya sedikit. Teknik PCR ini pertama kali dikembangkan oleh seorang peneliti dari CETUS Corporation yaitu Kary Mullis pada tahun 1985 (Novel dkk., 2011).
PCR merupakan suatu teknik yang melibatkan beberapa tahapan berulang (siklus) dan tiap siklusnya terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Prinsip kerja PCR terbagi menjadi beberapa tahapan utama yaitu; Tahap I Pra-denaturasi templat yaitu proses penyesuaian suhu mesin. Tahap II Denaturasi DNA templat yang terjadi pada suhu sekitar 94-96oC, merupakan proses pemisahan untaian DNA double helix dengan perlakuan suhu yang tinggi. Tahap III Annealing yaitu proses penempelan primer pada templat dengan suhu sekitar 45-60oC. Tahap IV Extension adalah pemanjangan primer dengan bantuan enzim Taq-polimerase pada rentang suhu sekitar 72-76oC. Tahap denaturasi, annealing
11 peningkatan jumlah produk non-target. Tahapan terakhir adalah Tahap V
Post-extension yaitu pemantapan (Danuz, 2014; Handoyo dan Rudiretra, 2000).
Pelaksanaan PCR sangat memerlukan beberapa komponen penting, seperti templat DNA yang berfungsi sebagai cetakan untuk membentuk molekul DNA baru yang sama. Primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyiapkan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan pada proses extension. dNTPs (deoxynucleotide triphosphates) merupakan suatu campuran yang terdiri dari dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat), dCTP (deoksisitidin trifosfat), dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat), dimana dalam proses PCR dNTPs berfungsi sebagai
building block DNA yang diperlukan dalam proses extension. Bufer untuk menjamin pH medium dan MgCl2 bertindak sebagai kofaktor untuk menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Kemudian, enzim polimerase DNA berfungsi sebagai katalis untuk reaksi polimerasi DNA (Handoyo dan Rudiretra, 2000).
2.7. Elektroforesis
Elektroforesis merupakan teknik pemisahan molekul bermuatan didasarkan pada perbedaan tingkat migrasi DNA dengan menggunakan matriks gel yang berfungsi sebagai medan listrik tempat terjadinya migrasi molekul-molekul organik. Elektroforesis sangat berperan penting digunakan pada penelitian dalam proses pemisahan dan mempurifikasi makromolekul seperti protein dan asam nukleat yang memiliki perbedaan ukuran, kadar ion, dan molekul penyusunnya. Elektroforesis sangat sensitif terhadap perbedaan muatan dan berat molekul yang cukup kecil (Bachrudin, 1999). Tujuan pemisahan molekul adalah untuk mengetahui ukuran atau jumlah basa serta ukuran basa nukleotida (Danuz, 2014).
12 yang kecil yang diperlukan agar pemisahan lebih efektif dan bertindak sebagai saringan molekul yang meningkatkan pemisahan serta berperan dalam menjaga molekul yang sudah terpisah agar tidak berdifusi terlalu cepat kedalam fase cair (Arif, 2013).
Elektroforesis merupakan salah satu cara yang digunakan untuk memvisualisasikan hasil PCR berupa fragmen-fragmen DNA yang sudah diamplifikasi. Pada proses elektroforesis diperlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi oleh timbulnya panas dari aliran listrik yang digunakan. Beberapa matriks penyangga seperti gel agarose dan gel poliakrilamid banyak digunakan untuk separasi protein dan asam nukleat (Arif, 2013). Elektroforesis gel agarose digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berukuran lebih besar dari 100 bp yang dijalankan secara horizontal dan elektroforesis gel poliakrilamid memiliki pori-pori yang lebih kecil dibandingkan dengan gel agarosa, sehingga dapat memisahkan pita DNA yang berukuran relatif kecil (5-500 bp) dan dijalankan secara vertikal. Kecepatan gerak molekul sangat bergantung pada rasio muatan terhadap massa dan bentuk molekulnya. Keunggulan penggunaan gel poliakrilamid dalam elektroforesis adalah tidak membentuk matriks dengan sampel dan tidak bereaksi dengan sampel, sehingga tidak menghambat pergerakan sampel yang memungkinkan pemisahan protein secara sempurna (Syam dkk., 2012).
Komponen penting yang membentuk gel poliakrilamid adalah akrilamida, bis-akrilamida, Amonium Peroksida Sulfat (APS), dan Tetramethylenediamine
(Temed). Akrilamida sebagai senyawa utama penyusun gel yang bersifat karsinogenik. Bis-akrilamida sebagai cross-linking agen yang membentuk kisi-kisi sebagai saringan molekul. Amonium Persulphate (APS) berfungsi sebagai inisiator yang mengaktifkan akrilamida agar bereaksi dengan molekul akrilamida lainnya sehingga membentuk polimer panjang, serta temed sebagai katalisator reaksi polimerisasi akrilamid menjadi gel poliakrilamid sehingga dapat digunakan sebagai pemisahan molekul (Arif, 2013).
