MEKANISME DAN REGULASI APOPTOSIS
Pengertian apoptosis
Apoptosis adalah mekanisme kematian sel yang terprogram yang penting dalam berbagai proses biologi. Berbeda dengan nekrosis, yang merupakan bentuk kematian sel sebagai akibat sel yang terluka akut, apoptosis terjadi dalam proses yang diatur sedemikian rupa yang secara umum memberi keuntungan selama siklus kehidupan suatu organisme (Gambar 1). Contohnya adalah pada diferensiasi jari manusia selama perkembangan embrio membutuhkan sel-sel di antara jari-jari untuk apoptosis sehingga jari-jari dapat terpisah.
Gambar 1. Perbedaan apoptosis dan nekrosis
Peranan apoptosis
Apoptosis memiliki peranan penting dalam fenomena biologis, proses apoptosis yang tidak sempurna dapat menyebabkan timbulnya penyakit yang sangat bervariasi. Terlalu banyak apoptosis menyebabkan sel mengalami kekacauan, sebagaimana terlalu sedikit apoptosis juga menyebabkan proliferasi sel yang tidak terkontrol (kanker). Beberapa contoh penyakit yang ditimbulkan karena apoptosis yang tidak sempurna antara lain:
a. Penyakit autoimun disebabkan karena sel T/B yang autoreaktif terus menerus. b. Neurodegeneration, seperti pada penyakit Alzheimer dan Parkinson, akibat dari
apoptosis prematur yang berlebihan pada neuron di otak. Neuron yang tersisa tidak mempunyai kemampuan untuk meregenerasi sel yang hilang.
c. Stroke iskemik, aliran darah ke bagian-bagian tertentu dari otak dibatasi sehingga dapat menyebabkan kematian sel saraf melalui peningkatan apoptosis.
d. Kanker, sel tumor kehilangan kemampuannya untuk melaksanakan apoptosis sehingga proliferasi sel meningkat.
Fungsi apoptosis
a. Sel yang rusak atau terinfeksi
Apoptosis dapat terjadi secara langsung ketika sel yang rusak tidak bisa diperbaiki lagi atau terinfeksi oleh virus. Keputusan untuk melakukan apoptosis dapat berasal dari sel itu sendiri, dari jaringan di sekitarnya, atau dari sel yang merupakan bagian sistem imun. Jika kemampuan sel untuk ber-apoptosis rusak atau jika inisiasi apotosis dihambat, sel yang rusak dapat terus membelah tanpa batas, berkembang menjadi kanker.
b. Respon terhadap stress atau kerusakan DNA
c. Homeostasis
Homeostasis adalah suatu keadaan keseimbangan dalam tubuh organisme yang dibutuhkan organisme hidup untuk menjaga keadaan internalnya dalam batas tertentu. Homeostasis tercapai saat tingkat mitosis (proliferasi) dalam jaringan seimbang dengan kematian sel. Jika keseimbangan ini terganggu dapat terjadi :
1. sel membelah lebih cepat dari sel mati. 2. sel membelah lebih lambat dari sel mati.
Mekanisme apoptosis
Mekanisme apoptosis sangat kompleks dan rumit. Secara garis besarnya apoptosis dibagi menjadi 4 tahap, yaitu :
1. Adanya signal kematian (penginduksi apoptosis).
2. Tahap integrasi atau pengaturan (transduksi signal, induksi gen apoptosis yang berhubungan, dll)
3. Tahap pelaksanaan apoptosis (degradasi DNA, pembongkaran sel, dll) 4. Fagositosis.
Signal Penginduksi Apoptosis
Apoptosis tidak memerlukan suatu proses transkripsi atau translasi. Molecular machine yang dibutuhkan untuk kematian sel dianggap mengalami dormansi dan hanya memerlukan aktivasi yang cepat. Signal yang menginduksi apoptosis bisa berasal dari ekstraseluler dan intraseluler.
Signal ekstraseluler contohnya hormon hormon. Hormon tiroksin menginduksi apoptosis pada ekor tadpole. Apoptosis juga bisa dipicu oleh kurangnya signal yang dibutuhkan sel untuk bertahan hidup seperti growth factor. Sel lain, sel berhubungan dengan sel yang berdekatan juga bisa memberikan signal untuk apoptosis.
Signal intraseluler misalnya radiasi ionisasi, kerusakan karena oksidasi radikal bebas, dan gangguan pada siklus sel.
Regulator Molekuler dari Apoptosis
Signal kematian dihubungkan dengan pelaksanaan apoptosis oleh tahap integrasi atau pengaturan. Pada tahap ini terdapat molekul regulator positif atau negatif yang dapat menghambat, memacu, mencegah apoptosis sehingga menentukan apakah sel tetap hidup atau mengalami apoptosis (mati).
Apoptosis diperantarai oleh famili protease yang disebut caspase, yang diaktifkan melalui proteolisis dari bentuk prekursor inaktifnya (zymogen). Caspase merupakan endoprotease yang memiliki sisi aktif Cys (C) dan membelah pada terminal C pada residu Asp, oleh karena itu dikenal sebagai Caspases (Cys containing Asp specific protease).
Saat ini telah ditemukan 13 anggota famili caspases pada manusia. Beberapa anggota famili caspase yang terlibat dalam apoptosis dibedakan menjadi 2 golongan. Golongan yang pertama terdiri dari caspase 8, 9,10 yang mengandung prodomain yang panjang pada terminal N, fungsinya sebagai inisiator dalam proses kematian sel. Golongan yang kedua terdiri dari caspase 3, 6, 7 yang mengandung prodomain yang pendek dan berfungsi sebagai efektor, membelah berbagai substrat yang mati yang pada akhirnya menyebabkan perubahan morfologi dan biokimia yang tampak pada sel yang mengalami apoptosis. Molekul efektor lain dalam apoptosis adalah Apaf-1 (apoptotic protease activating factor) bersama sitokrom c mengambil caspase 9 di ATP-dependent manner, dan menstimulasi proses perubahan pro-caspase 9 menjadi pro-caspase 9.
Gambar 2. Anggota famili bcl-2
ICE (Interleukin Converting Enzim) secara normal tidak terlibat dalam apoptosis, tetapi aktivasi tiruannya dalam sel mamalia, dapat mendorong ke arah tersebut. Masing-masing caspase mempunyai urutan yang sama, dirancang untuk membelah, maka menjadi jelas caspase membelah satu sama lain dalam suatu jalur mekanisme pengaktifan.
Dua rangkaian caspase saling melibatkan. Yang satunya menginisiasi proses aktivasi caspase lainnya. Pertanyaannya siapa yang mengaktifkan caspase yang pertama? Tampak meragukan, sampai peneliti menemukan bahwa caspase dapat diaktifkan jika mereka mengumpul pada konsentrasi kritik. Ini bisa terjadi oleh ikatan molekul signal bunuh diri di permukaan sel. Perubahan konformasi reseptor dapat mendorong ke arah agregasi dari molekul reseptor permukaan dengan serentak dengan agregasi caspases intraseluler reseptor agregasi.
Target Caspase Apoptosis melibatkan:
1. memadatkan inti sel
2. memadatkan dan membagi-bagi sitoplasma ke dalam selaput ikat badan apoptotis
3. rusaknya kromosom ke dalam fragmen yang berisi berbagai nukleosom
membelah actin filamen di dalam sel. Protein yang lain diperlukan untuk membentuk badan apopotic: suatu kinase yang disebut p21-activated kinase 2 (PAK-2). Kinase ini diaktifkan oleh caspase-3 dengan proteolisis terbatas.
Tahap Pelaksanaan Apoptosis
Sinyal apoptosis bisa terjadi secara intraseluler dan ekstraseluler. Jalur ekstrinsik (ekstraseluler) diinisiasi melalui stimulasi dari reseptor kematian (death receptor) sedangkan jalur intrinsik diinisiasi melalui pelepasan faktor signal dari mitokondria dalam sel.
Peristiwa apoptosis jalur ekstrinsik dimulai dari adanya pelepasan molekul signal yang disebut ligan oleh sel lain tetapi bukan berasal dari sel yang akan mengalami apoptosis. Ligan tersebut berikatan dengan death receptor yang terletak pada transmembran sel target yang menginduksi apoptosis. Death receptor yang terletak di permukaan sel adalah famili reseptor TNF (Tumor Necrosis Factor), yang meliputi TNF-R1, CD 95 (Fas), dan TNF-Related Apoptosis Inducing Ligan (TRAIL)-R1 dan R2.
Ligan yang berikatan dengan reseptor tersebut akan mengakibatkan caspase inisiator 8 setelah membentuk trimer dengan adaptor FADD (Fas Associeted Death Domain). Kompleks yang terbentuk antara ligan-reseptor dan FADD disebut DISC (Death Inducing Signaling Complex). CD 95, TRAIL-R1 dan R2 terikat dengan FADD, sedangkan TNF-R1 terikat secara tidak langsung melalui molekul adaptor lain, yaitu : TNF-Reseptor Associeted Death Domain protein (TRADD).
Stress mitokondria yang menginduksi apoptosis jalur intrinsik disebabkan oleh senyawa kimia atau kehilangan faktor pertumbuhan, sehingga menyebabkan gangguan pada mitokondria dan terjadi pelepasan sitokrom c dari intermembran mitokondria. Protein capcase-8 akan memotong anggota famili Bcl-2 yaitu Bid. Kemudian Bid yang terpotong pada bagian ujungnya akan menginduksi insersi Bax dalam membran mitokondria dan melepaskan molekul proapoptotik seperti sitokrom c, Samc/Diablo, Apoptosis Inducing Factor (AIF), dan omi/Htr2. dengan adanya dATP akan terbentuk kompleks antara sitokrom c, APAF1 dan caspase 9 yang disebut apoptosom. Selanjutnya, capcase 9 akan mengaktifkan downstream procaspase-3.
3 juga mempunyai kemampuan untuk mengaktifkan caspese lainnya, seperti procaspase-6 dan procaspase-7 yang memberikan amplifikasi terhadap kerusakan seluler.
Adanya seluler stres meningkatkan ekspresi dari protein p53 yang mengakibatkan terjadinya GI arrest atau apoptosis. Anggota dari apoptosis Stimulating Protein p53 (ASPP) yaitu ASPP 1 dan ASPP 2 secara spesifik menstimulasi fungsi transsktivasi p53 pada promotor gen proapoptotik seperti Bax dan p53 Inducible Gene 3 (PIG 3), tapi tidak pada promotor gen yang menyebabkan cell cycle arrest, yaitu p21 dan MDM2.
Tahapan apoptosis jalur ekstrinsik/deatch receptor pathway
Jalur ini khas pada sistem imun dan digunakan untuk menghilangkan sel T yang aktif pada akhir dari respon imun. Jalur ini terutama diperantarai oleh perforin / granzyme. Tahap-tahap apoptosis dalam death receptor pathway :
i. Ikatan antara FasL, suatu TNF (Tumor Necrosis Factor) dengan reseptornya.
ii. Ikatan FasL dengan Fas menginduksi reseptor untuk mengelompok (trimerisasi)
Gambar Ikatan FasL dengan Fas menyebabkan trimerisasi reseptor
Mitocondrial Pathway
Riset mengindikasi keterlibatan mitokondria dalam jalur apoptotis. Sitokrom c, suatu heme protein yang bertindak sebagai suatu pembawa elektron dalam fosforilasi oksidasi mitokondria, pemberhenti elektron cytochrome C oxidase atau kompleks IV, keluar intermembran dan mengikat protein sitoplasmik yang disebut Apaf-1. Yang kemudian mengaktikan suatu inisiator caspase-9 di sitoplasma.
Protein ini keluar mitokondria setelah perubahan potensiasi eletrokimia di membran. Perubahan potensial menyebabkan terbukanya suatu kanal yang non-spesifik dalam membran yang permeabel, terdiri atas dua protein selaput bagian dalam (adenine nucleotide translocator-ANT) dan suatu protein bagian luar (porin,
iii. Pengikatan FADD (Fas associated death domain protein) pada domain kematian (death domain).
iv. DED (death effector domain) dari FADD mengikat pro-caspase 8. Kompleks yang terbentuk disebut DISC (death-inducing signaling complex), kompleks ini mengaktivasi pro-caspase 8.
yang voltage-gated-kanal anion VDAC). Protein ini bertindak bersama-sama, kemungkinan pada sisi luar dan sisi dalam terjadi kontak. Saluran ini dapat dilewati zat yang memiliki bobot molekular kurang dari 1500. Perubahan gradien proton menyebabkan oksidasi dan foforilasi di mitokondria perubahan kekuatan ion menyebabkan pembekakan matriks. Karena sisi bagian dalam sangat kusut dan memilki luas permukaan jauh lebih besar dibanding selaput yang luar, bengkak pada matriks mengarah rusaknya sisi luar, sehingga sitokrom c dan Apaf-1 keluar masuk sitoplasma.
Jalur ini biasa diaktifkan dalam respon stimulus letal yang lain seperti pengrusakan DNA, stress oksidatif, dan hipoksia. Mitokondria mengandung faktor pro-apoptosis seperti sitokrom c dan AIF (pro-apoptosis inducing factors). Keduanya merupakan substrat yang berbahaya, akan tetapi tersimpan aman dalam mitokondria. Saat keduanya dilepaskan ke sitoplasma dapat mengaktifkan jalur aktivasi caspase. Pelepasannya diatur oleh famili Bcl-2 yang terikat dengan mitokondria, yaitu Bax dan Bad.
Caspase memecah protein menyebabkan inti sel pecah. Protein yang merupakan target caspase biasanya terikat dengan protein lain, yaitu sebuah DNA endonuklease. Saat protein pecah, DNase bebas bermigrasi ke nukleus dan memecahnya. Perubahan membran terjadi saat caspase 3 memecah gelsolin, suatu protein yang terlibat dalam pemeliharaan morfologi sel. Gelsolin yang terpecah akan membelah filamen aktin di dalam sel. Caspase 3 juga mengaktivasi kinase yang disebut p21-activated kinase 2 (PAK 2) melalui proteolisis. PAK2 termasuk protein yang dibutuhkan dalam membentuk apoptotic body.
Selama apoptosis mitokondria mengalami perubahan yang disebabkan oleh : a. Gangguan oksidasi-fosforilasi dan transport elektron karena radiasi dan
adanya second messenger tertentu seperti ceramide.
b. Perubahan dalam potensial redoks sel dan turunan Reactive Oxygen Species (ROS).
c. Kerusakan DNA.
d. Kerusakan DNA memacu ekspresi protein yang dikenal sebagai p53. protein ini menyebabkan penghambatan pembelahan sel atau apoptosis, dimana keduanya akan mnjaga sel dari menjadi sel tumor. Oleh karena itu gen p53 adalah gen tumor suppressor.
Death Receptor Pathway dan Mitocondrial Pathway bertemu saat caspase inisiator (caspase 8, 9, 10) menghasilkan aktivasi caspase efektor (caspase 3, 6, 7).
Gambar Pertemuan Death ReceptorPathway dan Mitocondrial Pathway
Tahap Fagositosis
Sel yang terfragmentasi menjadi apoptotic body mengeluarkan signal “eat me” yang dikenali oleh fagosit. Ada 2 macam fagosit, yaitu :
• Fagosit professional, contohnya sel makrofag.
• Fagosit semiprofesional, sel tetangga dari sel yang mengalani apoptosis. Adanya sel-sel fagosit ini dapat menjamin tidak timbulnya respon inflamasi setelah terjadinya apoptosis.
Gambar 3. Transduksi signal apoptosis secara garis besar
Penginduksi apoptosis dikategorikan dalam 3 grup, yaitu faktor kematian, obat anti-kanker yang genotoksik, factor deprivation. Fas ligan, salah satu contoh faktor kematian, berikatan dengan reseptor Fas, menyebabkan trimerisasi. Domain kematian yang mengalami trimerisasi dalam sitoplasma mengikat pro-caspase 8 melalui FADD/MORT1 membentuk DISC. Pro-caspase 8 mengalami autoaktivasi pada DISC menjadi bentuk enzim yang aktif. Ada 2 jalur aktivasi caspase 3 melalui caspase 8 :
1) Caspase 8 secara langsung mengubah pro-caspase 3 menjadi caspase 3. Caspase 3 membelah berbagai protein sel termasuk ICAD sehingga CAD dilepaskan dari ICAD, lalu mendegradasi kromosom DNA.
Obat anti-kanker yang genotoksik seperti etoposida dan radiasi γ menyebabkan kerusakan kromosom DNA. Signal tersebut ditransfer ke mitokondria oleh p53 melalui mekanisme yang belum diketahui. Hal ini dapat menyebabkan pelepasan sitokrom c dari mitokondria dan mengaktifkan caspase 9 seperti dijelaskan di atas.
Apoptosis yang diinduksi oleh factor deprivation dapat dipelajari dengan baik menggunakan IL-3 dependent myeloid cell lines. Dengan keberadaan IL-3, signal dari reseptor IL-3 menyebabkan fosforilasi Bad, molekul pro-apoptosis famili Bcl-2. Bad yang terfosforilasi tertangkap oleh adaptor 14-3-3. Bila IL-3 sudah tidak ada lagi maka Bad yang tak terfosforilasi dilepaskan dari 14-3-3, lalu ditranslokasikan ke mitokondria untuk melepaskan sitokrom c untuk mengaktifkan caspase 9.
Pengendalian Apoptosis
Sejauh ini 15 anggota keluarga ini (ced-9 yang dihubungkan dengan C. elegans) telah ditemukan di manusia. Bcl-2 dapat juga mengikat Apaf-1 dan menghalangi pengaktifan inisiasi caspase 9. Bcl-2 diatur oleh perubahan ekspresi gen Bcl-2, dengan post-translational fosforilasi oleh kinase, atau oleh pecahnya caspase. Kelebihan ekpresi Bcl-2 dapat menyebabkan suatu sel menjadi suatu sel tumor. Anggota lain keluarga, BAX dan BAD yang mengikat mitokondria dan memfasilitasi apoptosis dengan menstimulasi pelepasan sitokrom C. Sebagai tambahan, protein lain yang disebut IAPS (inhibitor of apoptosis) dapat menghalangi caspase atau protein apoptotis lainnya.
Tabel 1. Beberapa molekul regulator yang berperan dalam apoptosis :
Casp 8 MACH + 2q33
MCH5
FLICE
Casp 9 APAF3 + ?
MCH6
ICE-LAP6
Casp 10 MCH4 + 2q33
DAP-3 + 1q21
DFFB + ?
FADD MORT-1 + 11q13
Fas APT1 + 10q24
CD95
Apo-1
Fas1
TNFRSF6
granzyme B GZMB + 14q11
CTLA1
CSPB
CCPB1
CGL-1
CSP-B
NOL3 + ?
Parp + 1q42
UBL1 PIC1 + 2q32
GMP1
SMT3C
SUMO-1
SMT3H3
Mengenali sel yang apoptosis
Sel yang mengalami apoptosis dapat diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya maupun mikroskop elektron melalui ciri-ciri morfologis yang ditampakkan. Ciri-ciri tersebut antara lain :
a. Sel menjadi bulat (sirkuler). Ini terjadi karena struktur protein yang menyusun sitoskeleton dicerna oleh enzim peptidase spesifik yang disebut caspaspse yang telah diaktifkan di dalam sel.
b. Kromatin (DNA dan protein-protein yang terbungkus di dalam inti sel) mulai mengalami degradasi dan kondensasi.
c. Kromatin mengalami kondensasi lebih lanjut, menjadi semakin memadat. Pada tahap ini, membran yang mengelilingi inti sel masih tampak utuh, walaupun caspase tertentu telah melakukan degradasi protein pori inti sel dan mulai mendegradasi lamin yang terletak dalam lingkungan inti sel.
d. Lingkungan dalam inti sel tampak terputus dan DNA di dalamnya terfragmentasi (proses ini dikenal dengan karyorrhexis). Inti sel pecah melepaskan berbagai bentuk kromatin atau unit nukleosom karena disebabkan degradasi DNA.
e. Plasma membran mengalami blebbing.
f. Sel tersebut kemudian di’makan’ atau pecah menjadi gelembung-gelembung yang disebut apoptotic bodies dan kemudian di’makan’.
Sel yang mengalami apoptosis juga dapat dikenali dengan :
a. Penandaan inti yang mengalami kondensasi dengan pewarna fluorescence Hoechst atau DAPI.
b. Sel yang mengalami apoptosis mengeluarkan PS (Phosphatidil Serin) pada permukaan ekstraselulernya, sehingga dapat ditandai dengan annexin V yang dilabeli fluorescence. PS secara normal terdapat pada cytosolic surface dari membran plasma (di bagian dalam membran plasma), tetapi diredistribusikan ke permukaan ekstraseluler selama apoptosis oleh protein hipotetik yang dikenal sebagai scramblase.
