BAB II TINJAUAN PUSTAKA

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Metil Amfetamina (MA) atau biasa disebut metamfetamina atau shabu merupakan salah satu turunan dari amfetamina. Berdasarkan Undang-Undang Republik Indonesia No. 35 Tahun 2009 Tentang Narkotika, MA termasuk kedalam golongan I karena potensi menyebabkan ketergantungan yang sangat kuat.

2.1 Metamfetamina (MA)

Metamfetamina dikenal dengan nama ICE atau shabu-shabu pada tahun 1980 yang merupakan bentuk yang sangat murni. Nama kimia dari senyawa ini yaitu (αS)-N,α-dimetilbenzenetamina dengan berat molekul 149,2. Metamfetamina dapat dibuat dari bahan baku prekursor seperti efedrin atau pseudoefedrin. Metamfetamina berbentuk kristal putih yang larut dalam air, alkohol, kloroform tetapi tidak larut dalam eter dan terasa pahit [13].

Gambar 2.1 Struktur Metamfetamina (Sumber: [17])

Metamfetamina pertama kali dikenal di Hawai pada tahun 1980-an dengan nama “ICE” yang merupakan bentuk sangat murni dari MA. Proses pembuatan metamfetamina tidak diketahui secara pasti, tetapi diketahui bahwa pusat produksi metamfetamina berada di Asia Tenggara dan sangat populer di Jepang. Penyalahgunaan MA awalnya diketahui dari Inggris [13].

2.2 Reaksi Warna

Reaksi warna memberikan hasil analisis senyawa yang terkandung dalam sediaan, tetapi hasil positif yang ditunjukkan dengan reaksi warna hanya hasil

CH3 CH3 H N                

dugaan kemungkinan adanya senyawa obat. Tes warna memiliki keuntungan salah satunya adalah hasil analisis dari reaksi warna dapat langsung ditindaklanjuti untuk analisis di laboratorium bahkan hasil analisis tersebut didapat dari seseorang yang tidak memiliki keterampilan dalam melakukan sebuah analisis [15].

2.2.1 Marquis

Pereaksi Marquis digunakan sebagai analisis sederhana untuk mengidentifikasi dugaan alkaloid serta senyawa lain. Pereaksi ini dari campuran Formaldehid dan Asam sulfat dengan perbandingan 1:40. Senyawa yang berbeda dalam suatu sediaan menghasilkan reaksi warna yang berbeda dengan pereaksi Marquis [6]. Formaldehid akan membentuk ion karbonium dan bereaksi dengan senyawa aromatik pada MA. Dalam suasana asam dari asam sulfat, ion karbonium bereaksi membentuk warna oranye pada MA [15]. Berikut adalah mekanisme reaksi Marquis:

Gambar 2.2 Reaksi Marquis pada Metamfetamina Sumber: [15]

2.2.2 Simon

Sama halnya dengan pereaksi Marquis, pereaksi Simon digunakan sebagai analisis sederhana untuk mengidentifikasi adanya suatu senyawa. Pereaksi Simon terdiri dari 2 larutan yang dikenal dengan Simon A dan Simon B. Pereaksi Simon

H3C H N CH3 H H H3C H3C H N CH3 CH3 N                

A terdiri dari Natrium Karbonat 2% dalam aquadest sedangkan Simon B terdiri dari campuran Natrium nitroprussid dalam aquadest dan asetaldehid. Warna yang terbentuk sesuai dengan senyawa yang terkandung dalam sediaan [5].

Senyawa Amina dengan asetaldehid akan menghasilkan enamina, yang kemudian bereaksi dengan natrium nitroprussid sehingga menghasilkan garam ammonium yang berwarna biru [15]. Penggunaan utama pereaksi ini adalah untuk mendeteksi adanya senyawa amina sekunder seperti MDMA dan metamfetamina sehingga digunakan setelah dilakukan pengujian dengan pereaksi Marquis. Penggunaan ini dapat dilakukan untuk membedakan antara metamfetamina atau MDMA dengan amfetamina atau MDA. Modifikasi pereaksi Simon yaitu dengan mengganti asetaldehid dengan aseton akan memberikan hasil positif adanya senyawa amina primer yaitu amfetamina atau MDA yang berwarna ungu [24].

Gambar 2.3 Reaksi Simon pada Metamfetamina (Sumber: [15]) H2O 2- R R CH N -H2O +CH3CHO R N H CH3 R CH2 N CH3 +[ONFe(CN)5] 2-CH2 NOFe(CN)5 R R NH2 + O CH CH2 NOFe(CN)5 3-                

2.3 Argentometri

Titrasi argentometri adalah suatu analisa volumetri yang didasarkan pada reaksi pengendapan dengan AgNO3 sebagai larutan standar. Penentuan klor dan

brom dapat dilakukan dengan mentitrasi halogenida dengan AgNO3 menggunakan

indikator kalium kromat dimana ion kromat akan bereaksi dengan ion perak bila seluruh Cl- _{telah diendapkan secara kuantitatif oleh ion Ag}+ _{sehingga titik}

akhir titrasi ditandainya dengan terbentuknya endapan merah dari Ag2CrO4 [21].

Reaksi yang terjadi adalah :

Ag+_{+ Cl}- _{→ AgCl}

Ag+_{+ CrO}

42- → Ag2CrO4

Cara Mohr hanya dapat digunakan untuk suasana asam atau sedikit basa (pH 7 ± 10,5) dan ia tidak dapat dipergunakan untuk menentukan iodida dan tiosianat sedangkan cara Volhard dilakukan dengan penambahan AgNO3 terukur dan

berlebih pada larutan halogenida yang akan ditentukan, kemudian kelebihan halogenida dititrasi kembali dengan larutan CNS- _{dengan memakai indikator Fe}3+

[21].

Ag+ + Cl- → AgCl Ag+ + CNS- → AgCNS Fe3+ + CNS- → Ag(CNS)2+

AgCNS lebih sukar larut dari AgCl, maka dipisahkan dari filtrat secara kuantitatif, kemudian baru dititrasi sampai titik akhir (merah). Cara ini dapat dipakai dalam suasana asam serta dapat pula untuk penentuan iodida dan tiosianat [21].

Titrasi pengendapan adalah golongan titrasi dimana hasil tirasinya merupakan endapan atau garam yang sukar larut. Prinsip dasarnya adalah reaksi pengendapan yang cepat mencapai kesetimbangan. Pada setiap penambahan titrasi tidak ada pengotor yang mengganggu dan diperlukan indikator untuk melihat titik akhir titrasi [21].                

2.4 Validasi Metode Analisis

Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis [11].

Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem analisis, karenanya suatu metode analisis harus divalidasi, ketika:

1. Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis tertentu; 2. Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan atau

karena munculnya suatu problem yang mengarahkan bahwa metode baku tersebut harus direvisi;

3. Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah seiring dengan berjalannya waktu;

4. Metode baku digunakan di laboratorium yang berbeda, dikerjakan oleh analis yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda;

5. Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antar 2 metode, seperti antara metode baru dan metode baku [11].

Menurut ICH (International Conference on Harmanization) membagi karateristik validasi metode menjadi 9 langkah yaitu:

1. Akurasi

Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya, atau nilai rujukan. Akurasi diukur sebagai banyaknya analit yang diperoleh kembali pada suatu pengukuran dengan melakukan spiking pada suatu sampel. Untuk pengujian senyawa obat, akurasi diperoleh dengan membandingkan hasil pengukuran dengan bahan rujukan standar (Standard Reference Material, SRM) [11].

Untuk mendokumentasikan akurasi, ICH merekomendasikan pengumpulan data 9 kali penetapan kadar dengan 3 konsentrasi yang berbeda (misal 3 konsentrasi dengan 3 kali replikasi). Data harus dilaporkan sebagai persentase perolehan kembali [11].                

2. Presisi

Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya diekspresikan sebagai simpangan baku relatif dari sejumlah sampel yang berbeda signifikan secara statistik [11]. Sesuai dengan ICH, presisi harus dilakukan pada 3 tingkatan yang berbeda yaitu;

a. Keterulangan (repeability), yaitu ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang sama (berulang) baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun waktunya;

b. Presisi antara (intermediate precision), yaitu ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang berbeda baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun waktunya;

c. Ketertiruan (reproducibility) merujuk pada hasil-hasil dari laboratorium yang lain [11].

Presisi seringkali diekspresikan dengan standar deviasi atau standar deviasi relative (RSD) dari serangkaian data. Data untuk menguji presisi dikumpulkan sebagai kajian-kajian lain yang berkaiatan dengan presisi linearitas atau akurasi. Biasanya replikasi 6-15 kali dilakukan pada sampel tunggal untuk setiap konsentrasi [11].

3. Batas deteksi (Limit of Detection, LoD)

Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. LoD merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan apakah analit di atas atau di bawah nilai tertentu. Defenisi yang paling umum digunakan dalam kimia analisis adalah bahwa batas deteksi merupakan kadar analit yang memberikan respon sebesar blanko ditambah dengan 3 simpangan baku blanko [11].

LoD seringkali diekspresikan sebagai suatu konsentrasi pada rasio signal terhadap derau (signal to noise ratio) yang biasanya rasionya 2 atau 3 dibading 1. ICH mengenalkan metode signal to noise ratio ini, meskipun demikian ICH juga menggunakan 2 metode pilihan lain untuk menentukan LoD, yaitu metode non instrumental visual dan dengan metode perhitungan. Metode non instrumental visual digunakan pada teknik kromatografi lapis tipis dan pada metode titrimetri                

[11]. LoD juga dapat menghitung berdasarkan pada standar deviasi (SD) respon dan kemiringan( slope, S) kurva baku pada level yang mendekati LoD sesuai dengan rumus:

LoD = 3,3 (𝑆𝐷_𝑆) (1-1)

Standar deviasi respon dapat ditentukan berdasarkan pada standar deviasi blanko, pada standar deviasi residual dari garis regresi, atau standar deviasi intersep y pada garis regresi [11].

4. Batas kuantifikasi (Limit of Quantification, LoQ)

Batas kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang padat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. Sebagaimana LoD, LoQ juga diekspresikan sebagai konsentrasi (dengan akurasi dan presisi juga dilaporkan). Kadang-kadang rasio signal to noise ratio 10 : 1 digunakan untuk menentukan LoQ. Perhitungan LoQ dengan rasio signal to noise ratio merupakan aturan umum, meskipun demikian perlu diingat bahwa LoQ merupakan suatu kompromi antara konsentrasi dengan presisi dan akurasi yang dipersyaratkan. Jadi, jika konsentrasi LoQ menurun maka presisi juga akan menurun. Jika presisi tinggi dipersyaratkan, maka konsentrasi LoQ yang lebih tinggi yang dilaporkan [11]. 5. Spesifisitas

Spesifisitas adalah kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya kemponen-komponen lain dalam matriks sampel seperti ketidakmurnian, produk degradasi, dan komponen matriks [11]. ICH membagi spesifisitas dalam 2 kategori, yaitu:

a. Uji identifikasi, spesifisitas ditunjukkan dengan kemampuan suatu metode analis untuk membedakan antar senyawa yang mempunyai struktur molekul yang hampir sama;

b. Uji kemurnian atau pengukuran, spesifisitas ditunjukkan oleh daya pisah 2 senyawa yang berdekatan (sebagaimana dalam kromatografi). Senyawa-senyawa tersebut biasanya adalah komponen utama atau komponen aktif dan atau suatu pengotor. Jika dalam suatu uji terdapat pengotor maka metode uji harus tidak berpengaruh dengan adanya pengotor ini [11].

               

6. Linearitas

Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji secara langsung proposional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Linearitas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan respon (y) dengan konsentrasi (x). Linearitas dapat diukur dengan melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi yang berbeda-beda. Data yang diperoleh selanjutnya dapat ditentukan kemiringan (slope), intersep, dan koefisien korelasinya [11].

7. Kisaran (range)

Kisaran suatu metode didefenisikan sebagai konsentrasi terendah dan tertinggi yang mana suatu metode menunjukkan akurasi, presisi, dan linearitas yang mencukupi. Kisaran-kisaran konsentrasi yang diuji tergantung pada jenis metode dan kegunaannya. Untuk pengujian komponen utama, maka konsentrasi baku harus diukur didekat atau sama dengan konsentrasi kandungan analit yang diharapkan [11].

8. Ketahanan

Ketahanan merupakan kapasitas metode untuk tetap tidak terpengaruh oleh adanya variasi parameter metode yang kecil. Ketahanan dievaluasi dengan melakukan variasi parameter-parameter metode seperti persentase pelarut organik, kekuatan ionik, suhu dan sebagainya. Suatu praktik yang baik untuk mengevaluasi ketahanan suatu metode adalah dengan menvariasi parameter-parameter penting dalam suatu metode secara sistematis lalu mengukur pengaruhnya pada pemisahan [11].

9. Kesesuaian sistem

Sebelum melakukan analisis setiap hari, seorang analis harus memastikan bahwa sistem dan prosedur yang digunakan harus mampu memberikan data yang dapat diterima. Hal ini dapat dilakukan dengan percobaan kesesuaian system yang didefenisikan sebagai serangkaian uji untuk menjamin bahwa metode tersebut dapat menghasilkan akurasi dan presisi yang dapat diterima. Persyaratan-persyaratan kesesuaian sistem biasanya dilakukan setelah dilakukannya pengembangan metode dan validasi metode [11].

               

2.5 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi Lapis Tipis adalah metode pemisahan yang dilengkapi plat tipis penyerap dan media selektif yang digunakan sebagai pembawa. Teknik ini dikembangkan pertama kali tahun 1938 oleh Ismailoff dan Scharaiber [17].

Teknik standar dalam melaksanakan pemisahan dengan KLT adalah sebagai berikut. Pertama kali lapisan tipis adsorben dibuat pada permukaan plat kaca dengan ukuran dan tebal plat bervariasi, tergantung penggunaanya. Larutan campuran senyawa yang akan dipisahkan diteteskan pada kira-kira 1,5 cm dari bagian bawah plat tersebut dengan menggunakan pipet mikro atau pada permukaan plat kaca dengan ukuran dan tebal plat bervariasi, tergantung penggunaanya. Larutan campuran senyawa yang akan dipisahkan diteteskan pada kira-kira 1,5 cm dari bagian bawah plat tersebut dengan menggunakan pipet mikro atau syringe. Zat pelarut yang terdapat pada sampel yang akan diteteskan tersebut dikembangkan dengan mencelupkannya pada tangki yang berisi campuran zat pelarut (eluen). Tinggi eluen dalam tangki harus lebih rendah dari letak spot sampel pada plat kromatografi. Dengan pengembangan tersebut masing-masing komponen senyawa dalam sampel akan bergerak ke atas dengan kecepatan yang berbeda-beda [17].

Komponen yang terdapat dalam campuran akan terpisah karena terbawa oleh aliran pelarut. Perbedaan interaksi komponen sampel dengan fasa diam menyebabkan perbedaan waktu tambat. Perbedaan waktu tambat menyebabkan perbedaan kecepatan migrasi komponen dan perbedaan kecepatan migrasi komponen yang menyebabkan pemisahan komponen [17].

2.5.1 Fasa Diam

Fasa diam pada KLT berupa plat tipis (adsorben) yang ditebarkan pada suatu plat, yang berfungsi sebagai permukaan penyerap. Fasa diam yang umum digunakan adalah padatan dengan kehalusan dan polaritas tertentu. Kepolaran fasa diam harus disesuaikan dengan polaritas analit yang akan dipisahkan [17].

Macam-macam fasa diam diantaranya silika gel, alumina, kieselguhr (tanah diatom) dan selulosa. Dari keempat jenis fasa diam tersebut yang paling banyak                

dipakai adalah silika gel yang terbagi atas dua jenis, yaitu silika gel G yang mengandung 13 % kalium sulfat dan silika gel PF yang ditemukan belakangan ini yang dibuat sedemikian rupa sehingga senyawa organik yang terikat pada plat ini dapat mengadakan fluoresensi, sehingga visualisasinya dapat dikerjakan dengan menempatkan plat yang telah dikembangkan di dalam ruangan gelap atau dengan sinar ultraviolet yang bergelombang pendek [17].

2.5.2 Fasa Gerak

Fasa gerak dalam KLT adalah suatu cairan baik pelarut organik atau non organik, baik dalam bentuk campuran maupun pelarut murni yang digunakan untuk mengelusikan komponen sampel. Campuran pelarut dianjurkan hanya dipakai satu kali pengembangan saja sebab susunannya mudah berubah akibat salah satu komponennya menguap [17].

Faktor yang perlu diperhatikan dalam pemilihan fasa gerak antara lain harus mempunyai sifat mengalir yang tinggi, kemurnian yang tinggi, kelarutan, polaritas dan pengaruh sifat adsorben yang digunakan. Fasa gerak harus mudah melarutkan sampel campuran pada waktu pemisahan dilakukan, tetapi tidak bereaksi dengan adsorben [17].

2.5.3 Penotolan

Sampel yang merupakan campuran senyawa yang akan dipisahkan, dilarutkan dalam pelarut yang mudah menguap, misalnya kloroform atau zat pelarut lain yang serupa, yang mempunyai titik didih antara 50-100o_{C. Larutan sampel}

tersebut diteteskan pada plat menggunakan pipet mikro atau syringe. Jumlah sampel yang harus diusahakan sekecil mungkin dengan meneteskan berulang kali, dengan dibiarkan mengering sebelum tetesan berikutnya dikerjakan [17].

2.5.4 Pengembangan

Pengembangan dilakukan dengan mencelupkan dasar plat KLT yang telah dideteksi pada sampel dalam sistem pelarut. Pemilihan sistem pelarut yang dipakai didasarkan atas prinsip like dissolves like, yang berarti untuk memisahkan sampel yang bersifat non polar digunakan sistem pelarut yang bersifat non polar                

juga [17]. Proses pengembangan akan lebih baik bila ruangan pengembangan tersebut telah jenuh dengan uap sistem pelarut, terdapat 2 macam teknik elusi yang umum dikenal, yaitu:

1. Teknik Elusi Menaik (ascending)

Pada teknik ini fasa gerak akan bergerak kearah dengan gaya kapiler melalui lapisan adsorben yang diletakkan miring. Teknik elusi ini sederhana dan peralatan tersedia secara komersial sehingga lebih banyak digunakan [17]. 2. Teknik Elusi Menurun (descending)

Pada teknik ini pelarut ke bawah melalui lapisan adsorben yang diletakkan vertikal dengan perantara kertas saring. Biasanya digunakan untuk senyawa yang lambat gerakannya. Teknik ini menggunakan peralatan yang kompleks sehingga jarang digunakan dalam KLT [17].

2.5.5 Visualisasi

Visualisasi dimaksudkan untuk melihat komponen penyusun yang sudah terpisah setelah proses pengembangan [17]. Visualisasi dapat dikerjakan dengan 2 cara, yaitu:

1. Visualisasi sacara kimia

Dengan pereaksi penampak noda yang khas untuk setiap senyawa. Pereaksi ini disemprotkan pada plat tipis, sehingga warna tertentu dapat terlihat secara visual [17].

2. Visualisasi secara fisika

Dengan pengamatan bercak menggunakan sinar ultra violet. Pengamatan dapat terjadi karena fasa diam pada plat KLT mengandung indikator fluorosensi yaitu senyawa yang dapat memancarkan sinar radiasi energi (sinar tampak pada panjang gelombang 400-800 nm). Ketika menyerap energi yang lebih rendah, maka plat akan berwarna apabila disinari pada panjang gelombang yang tepat. Noda pada plat akan timbul sebagai pemadaman fluorosensi. Indikator yang ditambahkan hanya sekitar 1 % dan pada umumnya tidak ikut berperan dalam proses pemisahan senyawa [17].

               

2.5.6 Faktor Retardasi (Rf)

Faktor retardasi (Rf) menyatakan perbandingan jarak bercak dengan jarak

rambat eluen [17].

Rf = _{Jarak yang ditempuh oleh pelarut} Jarak yang ditempuh substansi (1-2)

Nilai Rf berkisar pada rentang 0-1. Suatu senyawa dikatakan identik dengan

standarnya jika Rf senyawa tersebut sama atau mendekati Rf standar. Semakin

besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa

tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan dua sampel yang berbeda di bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar bila

senyawa tersebut kurang polar dan berinteraksi dengan adsorben polar dari plat kromatografi lapis tipis [17].

2.5.7 Keunggulan KLT

Senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap serta terlalu labil untuk kromatografi cair dapat dianalisis dengan KLT. KLT dapat pula untuk pemeriksaan adanya zat pengotor dalam pelarut dan cocok digunakan bagi ahli kimia forensik untuk melakukan berbagai macam pemisahan. Proses KLT relatif lebih singkat dibandingkan kromatografi kertas. Preparasi sampel KLT lebih sederhana dan relatif murah [17].

2.5.8 Gangguan Pada Kromatografi Lapis Tipis

Noda atau bercak yang dihasilkan pada KLT tidak selalu bulat seperti yang diharapkan [17]. Hal-hal yang mungkin terjadi pada visualisasi KLT adalah: 1. Pengekoran (Tailing)

Pengekoran adalah bentuk noda yang tidak bulat (berekor) dapat disebabkan oleh pemisahan yang tidak sempurna, ketidakjenuhan chamber pada saat elusi (fasa gerak yang segera menguap), ketidaktepatan dalam memilih fasa gerak dan fasa diam [17].

2. Fronting

Fronting adalah timbulnya garis depan pelarut yang tidak rata pada lempeng

KLT. Hal ini disebabkan oleh suhu pada lapisan adsorben pada saat elusi                

tidak sama, sehingga aliran pelarut pergerakannya tidak sama pada lapisan adsorben, dan fasa gerak yang digunakan tidak sesuai dengan komponen sampel [17].

2.6 Gas Chromathography-Mass Spectrometer (GC-MS)

Gas chromathography (GC) adalah metode pemisahan yang digunakan untuk

menganalisis senyawa yang mudah menguap atau senyawa yang mudah diuapkan. Senyawa yang mudah terdegradasi oleh panas tidak dapat dianalisis dengan metode ini. Mass Spectrometer (MS) adalah suatu metode analisis instrumental yang dipakai untuk identifikasi dan penentuan struktur dari komponen sampel dengan cara menunjukkan massa relatif dari molekul komponen dan massa relatif hasil pecahannya [8].

Gas Chromathography-Mass Spectrometer merupakan gabungan metode

analisis antara GC dan MS. Dalam hal ini GC hanya berfungsi sebagai sarana pemisah tanpa dilengkapi dengan detektor sebagaimana GC pada umumnya, tetapi yang berfungsi sebagai detektornya adalah MS. Kemampuan dan aturan pemisahannya akan mengikuti aturan pada GC, demikian pula aturan fragmentasi dan pola spektrum massa akan mengikuti aturan MS. Dengan adanya gabungan kedua metode tersebut akan memberikan keuntungan yang lebih baik karena senyawa yang telah terpisahkan oleh GC dapat langsung dideteksi oleh MS. Detektor MS untuk kromatografi gas mempunyai beberapa keuntungan, antara lain yaitu penggunaan senyawa yang telah diketahui isotopnya sebagai standar meningkatkan ketelitian analisis serta pada resolusi tinggi dapat menentukan komposisi dasar dari senyawa yang dianalisis. Dengan adanya penggabungan kedua alat tersebut, maka GC-MS mampu memisahkan komponen-komponen dalam suatu analit sekaligus menentukan jenis komponen tersebut melalui spektrum massanya [8]. Berikut adalah instrumentasi komponen GC-MS:

               

Gambar 2.4 Instrumentasi Kromatografi Gas-Spektrometer Massa (Sumber: [10])

Prinsip kerja GC-MS adalah sampel yang berupa cairan diinjeksikan ke dalam injektor kemudian diuapkan. Sampel yang berbentuk uap dibawa oleh gas pembawa menuju kolom untuk proses pemisahan. Setelah terpisah, masing-masing komponen akan melalui ruang pengion dan dibombardir oleh elektron sehingga terjadi ionisasi. Fragmen-fragmen ion yang dihasilkan akan ditangkap oleh detektor dan dihasilkan spektrum massa [8].

2.6.1 Komponen Gas Chromathography-Mass Spectrometer (GC-MS)

Pada prinsipnya kromatografi gas-spektrometri massa terdiri dari 4 komponen utama yaitu:

1. Gas Chromathography

Prinsip mekanisme kromatografi gas adalah cuplikan diinjeksikan ke dalam injektor kemudian diuapkan hingga cuplikan berubah menjadi uap atau gas. Cuplikan yang berbentuk gas dibawa oleh gas pembawa dengan laju alir yang konstan masuk dalam kolom pemisah. Komponen-komponen sampel akan terpisah pada saat melewati kolom karena adanya perbedaan daya adsorpsi fasa diam terhadap komponen-komponen sampel. Komponen yang sudah terpisah akan didorong oleh fasa gerak untuk bergerak di sepanjang kolom berupa pita-pita [8].

Setelah sampel dipisahkan menjadi komponen-komponennya, masing-masing komponen tersebut akan keluar dari kolom bersama fasa gerak. Konsentrasi komponen tersebut dapat diukur dengan suatu detektor yang akan menghasilkan                

sinyal dan dikirim ke pencatat. Komponen-komponen dari sampel yang telah terpisahkan akan menghasilkan kurva-kurva karena masing-masing komponen tersebut ditahan pada kolom dalam waktu berbeda-beda. Lamanya waktu suatu komponen ditahan oleh kolom adsorpsi merupakan ciri khas komponen yang disebut sebagai waktu retensi atau waktu tambat [8].

Untuk analisis kualitatif secara kromatografi gas, parameter hasil pemisahan yang digunakan adalah waktu retensi. Waktu retensi sejak penyuntikan hingga terbentuknya puncak maksimum, sifat ini merupakan ciri khas cuplikan dan fasa cair pada suhu tertentu. Dengan menggunakan aliran yang tepat dan pengendalian suhu, waktu retensi dapat terulang dalam batas 1% dan dapat digunakan untuk mengidentifikasi tiap puncak. Beberapa senyawa mungkin mempunyai waktu retensi yang sama atau berdekatan, tetapi tiap senyawa hanya mempunyai satu waktu retensi saja [8]. Pada kromatografi gas, pada umumnya ada 5 komponen utama yaitu:

a. Gas Pembawa

Fungsi utama gas pembawa adalah untuk memindahkan analit dari injektor menuju detektor. Syarat mutlak gas pembawa pada kromatografi gas adalah lembam dari segi kimia dan mempunyai kemurnian yang tinggi. Paling banyak digunakan sebagai gas pembawa adalah helium, argon, nitrogen, atau campuran argon dan metana. Aliran gas pembawa ini harus tetap selama operasional dan laju aliran gas sebelum masuk ke kolom bersama uap sampel diatur oleh sebuah pengatur tekanan yang dilengkapi dengan meter tekanan [8].

b. Gerbang Suntik

Sampel yang dapat dianalisis dengan metode kromatografi gas pada umumnya berbentuk cairan. Akan tetapi, sampel berbentuk padat dan gas juga dapat dianalisis dengan memakai sistem pemasuk sampel yang khusus. Sampel berbentuk cair yang telah dipreparasi diinjeksikan ke dalam gerbang udara. Volume yang diinjenksikan bervariasi mulai dari 0,01-20 µL. pada gerbang suntik yang terpenting adalah program temperatur. Pengaturan temperatur pada gerbang suntik harus di atas suhu titik didih komponen yang                

terkandung dalam cuplikan, biasanya diatur sampai 50 o_{C di atas titik didih}

komponen [18]. Apabila temperatur terlalu tinggi komponen cepat menguap, tetapi dapat menyebabkan terjadinya penguraian komponen. Begitu juga sebaliknya, apabila temperatur di bawah titik didih komponen dalam cuplikan dapat menyebabkan pengendapan / penumpukan pada gerbang suntik. Analisis senyawa yang mudah menguap atau yang mempunyai titik didih yang rendah misalnya senyawa ester / eter, maka gerbang suntik kromatografi gas dapat dilengkapi dengan head space dan autosampler [8].

c. Termostat Oven

Termostat oven berfungsi untuk mengatur temperatur kolom. Pengaturan kolom pada kromatografi gas sangat penting sebab pemisahan komponen terjadi di dalam kolom, yang sangat dipengaruhi oleh temperatur di dalam oven [8].

d. Kolom

Kolom merupakan bagian yang sangat penting dalam kromatografi gas sebab pemisahan terjadi di dalam kolom. Efesiensi kolom dalam kromatografi secara umum berkaitan dengan lamanya waktu komponen atau molekul yang dianalisis berada dalam kolom yang dikenal dengan waktu tambat [8]. Syarat kolom yang baik adalah:

1. Tidak mudah menguap; 2. Stabil pada pemanasan; 3. Lembam; dan

4. Tetapan fisik diketahui [8].

Pengaturan temperatur kolom tergantung pada komponen yang ada pada cuplikan. Apabila cuplikan mengandung beberapa komponen analit yang memiliki rentang titik didih lebar, sebaiknya menggunakan temperatur terprogram. Sedangkan apabila cuplikan hanya mengandung satu komponen analit, maka cukup dengan pengaturan stabilitas suhu yang cukup memisahkan analit dari komponen lain dalam cuplikan dengan waktu yang tidak terlalu lama. Pengaturan temperatur kolom tidak boleh melebihi temperatur maksimum yang disyaratkan pada ketentuan jenis kolom yang                

digunakan, karena dapat menyebabkan column bleeding dan kerusakan pada fase diam. Secara umum kolom kromatografi gas terbagi atas 2 jenis, yaitu kolom terpaking (packed column) dan kolom kapiler (capillary column). Kolom terpaking terbuat dari gelas atau logam yang tahan karat atau dari tembaga, alumunium dan nikel. Panjang kolom jenis ini 2-3 m dengan diameter dalam 1,5 cm sedangkan diameter kolom kapiler adalah 0,3-0,5 mm dengan panjang 25-60 m. fase diamnya berupa cairan tipis yang melapisi dinding bagian dalam pipa tersebut. Kolom kapiler lebih banyak digunakan saat ini karena menghasilkan resolusi atau daya pisah yang baik. Penentuan jenis fase diam yang berupa cairan tergantung pada aplikasi tingkat kepolaran analit yang dianalisis [8].

e. Detektor

Ciri detektor yang dikehendaki adalah kepekaan tinggi, kelinearan tanggapannya lebar, tanggap terhadap semua jenis senyawa, kuat, tidak peka terhadap perubahan aliran, suhu, dan harganya murah. Pada kromatografi gas spektrometer massa, spektrometer massa merupakan detektor dari kromatografi gas [8].

2. Interface

Interface adalah bagian yang menghubungkan antara kromatografi gas

dengan spektrometer massa pada kondisi hampa udara yang tinggi. Tujuan utama dari interface adalah menghilangakan gas pembawa tanpa menghilangkan analit.

Interface yang ideal dapat memindahkan analit secara kuantitatif, mengurangi

tekanan dan laju alir ke suatu tingkat yang dapat ditangani oleh spektrum massa [8].

3. Mass Spectrometer

Prinsip kerja dari spektrometri massa adalah sampel diuapkan dalam keadaan vakum kemudian dialirkan menuju ruang pengion. Di ruang pengion sampel ditembak dengan arus partikel berenergi tinggi menghasilkan ion dengan kelebihan energi (radikal ion) yang bisa memecah dan tidak bisa memecah. Ion yang bisa memecah disebut ion induk (parent ion), ion induk akan memecah menjadi ion positif, negatif dan pecahan yang netral. Ion negatif akan tertarik ke                

anoda untuk dinetralkan dan dihisap oleh pompa vakum bersama-sama dengan fragmen netral. Sedangkan partikel bermuatan positif menuju ke tabung analisator, partikel-partikel ini dibelokkan oleh medan magnet sehingga lintasannya melengkung [8].

Dalam spektrometer massa, hanya ion-ion positif yang terdeteksi oleh spektrometer dan dipresentasikan sebagai tabel atau grafik yang memuat puncak m/z (massa/muatan) ion-ion yang intensitasnya tergantung pada kelimpahan relatif ion tersebut. Puncak spektrum tertinggi disebut sebagai base peak yang intensitasnya dianggap 100 %, sedangkan puncak-puncak dengan intensitas dari relatif dari berbagai nilai m/z dinamakan spektrum massa dan untuk setiap senyawa sifatnya sangat spesifik. Pecahnya suatu ion-ion atau molekul menjadi fragmen-fragmen bergantung pada kerangka karbon dan gugus fungsional yang ada. Oleh karena itu struktur dan massa fragmen memberikan petunjuk mengenai struktur molekul induknya [8].

4. Sistem Pengolah Data

Teknologi komputer sangat diperlukan untuk harmonisasi bekerjanya instrumen terpadu seperti GC-MS, dalam pengolahan atau penyuguhan data analisis. Selain itu, komputer juga berperan sebagai perangkat lunak yang menyimpan data analisis standar SRM (Standard Reference Material) sebagai pembanding terhadap data analisis analit hasil penentuan. Koleksi data analisis SRM yang ada pada perangkat lunak dikenal sebagai Standard Library Spectra. Identifikasi analit terhadap Standard Library Spectra dinyatakan dengan persen kemiripan dan keduanya dinyatakan identik jika komputer menilai persen keduanya diatas 90 % [8].

2.6.2 Fragmentasi

Di ruang pengion sampel ditembak dengan arus partikel berenergi tinggi menghasilkan ion dengan kelebihan energi (ion radikal) yang bisa memecah dan tidak bisa memecah. Ion yang bisa memecah disebut ion induk (parent ion), ion induk akan terfragmen menjadi ion positif, negatif dan fragmen netral. Ion negatif akan tertarik ke anoda untuk dinetralkan dan dihisap oleh pompa vakum bersama-               

sama dengan fragmen netral. Sedangkan partikel bermuatan positif menuju ke tabung analisator, partikel-partikel ini dibelokkan oleh medan magnet sehingga lintasannya melengkung [8]. Pada awalnya, ion radikal bergetar karena tidak stabil sehingga dengan adanya fragmentasi akan menyebabkan ion menjadi lebih stabil dan akhirnya ion induk bisa memecah [16]. Berikut ini adalah urutan ion yang mudah mengalami fragmentasi:

CH3+ < RCH2+ < R2CH+ < R3C+ < CH2=CH-CH2+ < C6H5 –CH2+ [16]

Metamfetamin yang mempunyai massa molekul relatif 149,23 dengan struktur pada gambar 2.6 mengalami fragmentasi sebagai berikut:

Gambar 2.5 Fragmen Metamfetamina

Metamfetamin mengalami fragmentasi sesuai dengan gambar 2.6, dengan spektrum utama yaitu 148, 91 dan 58 sebagai base peak (puncak tertinggi).

Gambar 2.6 Spektrum Massa Metamfetamina Sumber: [19]

Dibawah ini merupakan tabel yang memuat massa beberapa molekul yang hilang dalam fragmentasi baik itu ion radikal maupun fragmen netral.

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 0 2 0 0 0 4 0 0 0 6 0 0 0 8 0 0 0 m/ z--> A b u n d a n c e S c a n 5 0 (1 .2 6 4 min ): JA K B A R 1 0 7 .D \ d a ta .ms 5 8 .1 9 1 .0 4 4 .1 7 3 .0 _{1 0 4 .0}1 1 5 .0 1 3 4 .1 1 4 7 .0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 0 2 0 0 0 4 0 0 0 6 0 0 0 8 0 0 0 m/ z--> A b u n d a n c e

# 4 5 3 9 9 : B e n ze n e e th a n a min e , N ,.a lp h a .-d ime th yl- $ $ P h e n e th yla min e , N ,.a lp h a .-d ime th yl- $ $ D e o xye p h e d rin e $ $ E p h e d rin e , d e o xy- $ $ 2 -M e th yla min o -1 -p h e n ylp ro p a n e $ $ A n a d re x $ $ D e so xye p h e d rin e $ $ D e so xyn $ $ M e th a mp h e ta min e $ $ M e th e d rin e $ $ M e th yla mp h e ta min e $ $ 5 8 .0 9 1 .0 3 0 .0 _{4 2 .0} 1 3 4 .0 7 7 .0 1 1 5 .0 1 5 .0 1 0 3 .0 1 4 8 .0 91 CH3 CH3 H N 58                

Tabel 2.1 Daftar Jumlah Massa yang Hilang Jumlah

Massa [1]

Ion Radikal dan Fragmen Netral yang Hilang

[2]

Keterangan [3]

1 H• _{Lebih banyak terdapat pada ion}

dalam senyawa amina dan aldehid

15 CH3• Mudah hilang pada karbon

kuartener 17 OH• _{or NH}

3

18 H2O Mudah hilang pada alkohol

sekunder dan tersier

19/20 F•_{/HF Fluorida}

28 CO Keton atau asam

29 C2H5•

30 CH2O Senyawa aromatik metileter

31 CH3O• Metil ester 31 CH3NH2 Amina sekunder 32 CH3OH Metil ester 33 H2O + CH3 35/36 Cl•_{/HCl Klorida} 42 CH2=C=O Asetat

43 C3H7• Mudah hilang pada kelompok

isopropyl

43 CH3CO• Metil keton atau asetat

43 CO + CH3• 44 CO2 Ester 45 CO2H• Asam karboksilat 46 CO + H2O 57 C4H9• 60 CH3COOH Asetat 73 (CH3)3Si• Trimetisilil eter

90 (CH3)3SiOH Trimetisilil eter

Sumber: [16] 2.6.3 Teknik Analisis

2.6.3.1 Teknik Multiple Ion Monitoring (MIM) atau SCAN

Dengan menggunakan teknik MIM, didapatkan hasil Total Ion

Chromatogram (TIC), dengan absis sebagai waktu tambat sedangkan ordinatnya

merupakan limpahan relatif (abundance) ion molekulnya. Masing-masing kromatogram menghasilkan spektrum massa suatu senyawa yang dianalisis dan                

dapat dibandingkan dengan data spektrum massa standar yang ada pada data pustaka. Analisis dengan teknik MIM memerlukan senyawa yang memiliki kadar relatif besar, karena molekul senyawa yang terfragmentasi memerlukan adanya sisa ion molekul yang utuh. Hal ini diperlukan untuk mendapatkan kemiripan senyawa yang lebih besar dari 90 % dengan senyawa yang ada pada data pustaka [16].

2.6.3.2 Teknik Selected Ion Monitoring (SIM)

GC-MS dengan teknik SIM didapatkan dari hasil TIC dengan spektrum massa suatu komponen yang mempunyai puncak-puncak fragmen secara keseluruhan, yang akan diseleksi puncak fragmen ion molekul (m/z) secara selektif berdasarkan kelimpahannya. Hasilnya akan diperoleh 3 puncak fragmen ion molekul (m/z) yang mempunyai kelimpahan tinggi. Teknik SIM akan menghasilkan data puncak yang lebih tajam dan selektif sehingga akan meningkatkan kepekaan detektor. Oleh karena itu, teknik SIM dapat digunakan untuk analisis dengan kadar yang kecil dan sangat bermanfaat untuk pengukuran kuantitatif suatu komponen di dalam sampel yang mengandung banyak campuran senyawa [16].