PENCITRAAN DAN UJI BIODISTRIBUSI
99mTc-HYNIC-3E8 PADA
MENCIT YANG DIIMPLANTASI SEL KANKER LS174T
Siti Darwati
1dan Tae Sup Lee
21
Pusat Radioisotop dan Radiofarmaka, BATAN, Kawasan Puspiptek Serpong, Tangerang 15310
2
Laboratorium of Cyclotron Application, Korea Institute of Radiological and Medical Sciences (KIRAMS), Gongneung-Dong 215-4, Nowon-Gu, Seoul, 139-706
ABSTRAK
PENCITRAAN DAN UJI BIODISTRIBUSI 99mTc-HYNIC-3E8 PADA MENCIT YANG
DIIMPLANTASI SEL KANKER LS174T. Penggunaan antibodi monoklonal bertanda radioaktif baik untuk terapi maupun diagnostik pada kanker memperlihatkan kecenderungan yang meningkat dalam beberapa tahun belakangan ini. Pencitraan dengan akumulasi tumor yang tinggi disertai latar belakang yang rendah merupakan hasil yang diharapkan dalam penggunaan sediaan ini. Antibodi monoklonal seperti anti-TAG-72 (anti-tumor associated glycoprotein-72) bertanda radioisotop 125I telah banyak dievaluasi baik in-vitro maupun in-vivo dengan hasil yang memuaskan. Antigen TAG-72 terdapat pada kanker usus dan beberapa karsinoma lainnya. Beberapa antibodi terhadap antigen TAG-72 ini telah diproduksi meliputi antibodi monoklonal B72.3 generasi pertama) dan CC49 serta antibodi monoklonal yang dinamai AKA (generasi kedua) juga telah dapat diproduksi. Produk terbaru adalah antibodi monoklonal yang disebut 3E8 yang merupakan hasil teknologi “phage display” terhadap AKA. Tujuan penelitian ini adalah melakukan penandaan 3E8 menggunakan 99mTc dan selanjutnya dilakukan pencitraan tumor beserta uji biodistribusinya pada mencit gundul (nude mice) yang telah diimplantasi dengan sel kanker LS174T. Antibodi monoklonal bertanda radioaktif disiapkan dengan cara tak langsung menggunakan metoda HYNIC. Pencitraan dilakukan pada 6 dan 24 jam setelah pemberian
99m
Tc-HYNIC-3E8 kepada binatang percobaan, sedangkan uji biodistribusi dilakukan pada 2, 6 dan 24 jam setelah injeksi. Efisiensi penandaan yang tinggi diperoleh dengan rata-rata 99% dan kemurnian radiokimia rata-rata 98%. Pencitraan menghasilkan akumulasi yang terlokalisasi pada tumor. Data uji biodistribusi memberikan rasio tumor terhadap darah yang tinggi. Berdasarkan hasil tersebut diatas maka disimpulkan bahwa 99mTc-HYNIC-3E8 dapat disarankan sebagai sediaan radioimmunologi untuk mendeteksi tumor yang mengekspresikan antigen TAG-72.
Kata kunci : antibodi monoklonal, TAG-72, 3E8, radioimmunoterapi
ABSTRACT
IMAGING AND BIODISTRIBUTION OF 99mTc-HYNIC-3E8 IN NUDE MICE BEARING LS174T XENOGRAFT. There is an increasing interest in using radiolabeled monoclonal antibodies for therapeutic as well as diagnosis agent for cancers. Increasing tumor uptake with lower background was the aim of using this reagent. The antiTAG-72 (tumor associated glycoprotein–72) antibodies labeled with radioisotopes such as 125I has been evaluated both in-vitro and in-vivo resulting good results. The 72 antigen is expressed in colorectal cancer and some carcinomas. Several antibodies to the TAG-72 have been generated including BTAG-72.3 (first generation) followed by CC49 and AKA as the second generation. Recently, monoclonal antibody named 3E8 as a result from phage display technology to the AKA has successfully been produced. The purpose of this report is labeling 3E8 with 99mTc followed by tumor imaging and its biodistribution study in nude mice. The radiolabeled monoclonal antibody was prepared by indirect labeling using HYNIC method. Imaging was performed at 6h and 24h after administration of the 99mTc-HYNIC-3E8 into the animal while biodistribution study was carried out at 2h, 6h and 24h post injection. High radiolabeling yield at 99% with 98% radiochemical purity was obtained in the labeling process. Localized tumor uptake was shown on the images with tumor model
and biodistribution study gave high tumor to blood ratio at time dependent manner. Based on these results, it was concluded that the 99mTc-HYNIC-3E8 can be used for radioimmunodetection in TAG-72 antigen expressing tumors
Key words : monoclonal antibody, TAG-72, 3E8, radioimmunotherapy
1. PENDAHULUAN
Akhir-akhir ini terdapat peningkatan minat penggunaan makromolekul yang bertanda radioaktif untuk diagnosis kanker maupun untuk terapi. Berbagai metoda telah dipakai untuk mendapatkan hasil dengan akumulasi yang baik pada tumor. Salah satu metode yang dipakai adalah menggunakan fragmen antibodi monoklonal. Antibodi monoklonal tersebut dapat mengikat antigen pada tumor.
Antigen TAG-72 (tumor associated glycoprotein) merupakan suatu molekul kanker dengan berat molekul tinggi yang diekspresikan pada kanker usus, payudara dan indungtelur. Molekul ini jarang didapati pada jaringan normal. Antigen ini pertama kali diekstraksi dari sel kanker usus LS174T [1].
Beberapa antibodi terhadap antigen TAG-72 meliputi B72.3 sebagai antibodi monoklonal generasi pertama yang diproduksi melalui imunisaai mencit dengan sel kanker metastasis payudara (2), tetapi antibodi monoklonal ini mempunyai waktu hidup yang pendek. Generasi kedua dari antibodi monoklonal ini diproduksi melalui imunisasi mencit dengan antigen TAG-72 yang dimurnikan secara ekstraksi dari sel LS174T pada kanker manusia yang disebut CC49 [1]. Hasilnya memberikan penyidikan target yang efisien, namun karena antibodi monoklonal ini mempunyai fraksi rantai berat yang berasal dari mencit maka dalam pengunaannya memberikan efek yang disebut
human anti mouse antibodi (HAMA) yang signifikan. Antibodi ini menghasilkan afinitas sekitar 20-30 kali lebih tinggi dari B72.3 bila digunakan radioisotop 131I untuk penandaannya [1].
Upaya untuk mendapatkan afinitas yang tinggi telah dilakukan dengan memproduksi AKA, yang merupakan monoklonal antibodi
humanized dari CC49 [3]. Antibodi monoklonal anti-TAG-72 produk terbaru saat ini dinamakan 3E8, yang merupakan hasil rekayasa teknik
phage display dengan randomisasi terhadap asam amino residu 95-99 pada daerah fraksi berat antibodi (heavy chain regions HCDRs)3 pada AKA [3]. Antibodi monoklonal 3E8 ini
memberikan afinitas 23 kali lebih tinggi dibandingkan dengan AKA, dan juga memberikan penyidikan tumor yang baik bila digunakan radioisotop 125I.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melakukan pencitraan tumor dengan memakai kamera gamma dan uji biodistribusi pada mencit gundul yang telah diimplantasi sel kanker LS174T menggunakan 3E8 bertanda 99m
Tc. Penandaan 3E8 dengan radioisotop 99m
Tc dilakukan dengan cara tak langsung memakai metode HYNIC sebagai pengkelat fungsi ganda dan tricine sebagai koligand.
2. BAHAN DAN METODE
Bahan yang dipakai mencakup sel kanker LS174T dibeli dari ATCC, USA, antibodi monoklonal 3E8 (KIRAMS, Korea), Na99mTcO4 didapat dari generator 99Mo/99mTc yang dibeli dari Mallindckrodt (USA).
Peralatan pemutar buatan Netria (UK), Capintec buatan AS. Semua bahan kimia dibeli dari Sigma. Mencit gundul (nude mice) Balb/c dibeli dari SLC Japan, ITLC-SG buatan Gelman. Peralatan Thin-Layer Chromatogram Scanner Aloka (Japan) yang tersambung dengan alat Autochro Data Module. Pencitraan tumor memakai Sophy γ Camera DSX rectangular.
2.1. Penyiapan 99mTc-HYNIC-3E8 dengan dengan metode tak langsung
Sebanyak 1 mL larutan Na99mTcO4 (25 mCi) ditambahkan ke dalam vial yang berisi kit kering tricine (Lampiran A). Vial ditutup secara hati-hati dengan penutup alumunium, kemudian dicampur dengan pengaduk vortex secara perlahan dan diputar dalam alat pemutar selama 30 menit di dalam glove box. Efisiensi penandaan ditentukan dengan kromatografi menggunakan ITLC-SG sebagai fase diam dan metil-etil-keton (MEK) sebagai fase gerak, sedangkan kemurnian radiokimia ditentukan menggunakan fase diam ITLC-SG dan larutan NaCl fisiologis (0,9%) sebagai
fase geraknya. Kromatogram yang terjadi dibaca dengan alat Thin-Layer Chromatogram Scanner Aloka (Japan) yang terhubung dengan Autochro Data Module. Selanjutnya, sebanyak 200 μl larutan 99mTc-tricine ditambahkan ke dalam konjugat HYNIC-3E8 (Lampiran B). Campuran disentrifuga selama satu menit menggunakan alat sentrifuga Beckman Microfuge E dan kemudian dikocok selama satu jam dengan alat pengocok magnet di dalam glove box. Radioaktivitas larutan diukur dengan alat Capintec dan kemudian efisiensi penandaan dievaluasi menggunakan ITLC-SG dengan fasa gerak dapar sitrat 0,1 M pH 5,2.
2.2. Uji biodistribusi
Sembilan ekor mencit gundul Balb/c diinjeksi dengan sel LS174T masing-masing sebanyak 1x106 sel secara subkutan pada daerah paha. Tumor akan terjadi 2 minggu pasca injeksi dengan diameter sekitar 1-2 cm. Untuk uji biodistribusi, sebanyak 100μl/200μCi larutan antibodi monoklonal bertanda radioisotop diinjeksikan pada masing-masing mencit secara intra vena. Setelah 2, 6 dan 24 jam pasca injeksi, tiga mencit untuk masing masing kelompok dimatikan dengan cara dibius memakai eter. Organ-organ binatang tersebut dipisahkan kemudian ditimbang dan dicacah dengan pencacah sinar gamma. Hasilnya disajikan dalam bentuk persentase dosis keradioaktifan per gram jaringan (%ID/g) dan rasio cacahan pada tumor terhadap darah.
2.3. Pencitraan tumor
Dua ekor mencit gundul diinjeksi larutan 99m
Tc-tricin-HYNIC-3E8 pada vena ekor
masing-masing sebanyak 100μl/200μCi. Pencitraan dilakukan pada 6 jam dan 24 jam pasca injeksi dengan memakai alat Sophy γ Camera DSX rectangular.
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Penyiapan larutan antibodi monoklonal secara tak langsung pada penelitian ini mencakup penandaan tricine dengan 99mTc dan dilanjutkan dengan tahap penambahan larutan 99m
Tc-tricine tersebut kedalam konjugat HYNIC-3E8. Evaluasi hasil pada tahap pertama dilakukan dengan menggunakan metode kromatografi memakai ITLC-SG sebagai fase diam dan larutan MEK sebagai fase gerak (Gambar 1a). Sistem ini memberikan rendemen penandaan yang lebih besar dari 99% dihitung dari persentase cacahan hasil penandaan terhadap cacahan total.
Apabila digunakan ITLC-SG sebagai fase diam dan larutan NaCl fisiologis sebagai fase geraknya untuk uji kemurnian radiokimia pada senyawa tersebut diatas, maka didapat kemurnian radiokimia 98% atau perteknetat bebas 2% (Gambar 1b).
Evaluasi hasil penandaan pada tahap penambahan 99mTc-tricine kedalam larutan konjugat HYNIC-3E8 dilakukan dengan memakai kromatografi ITLC-SG dan dapar sitrat 0,1 M pH 5,2, disini didapat kemurnian antibodi monoklonal bertanda sebesar 99% (Gambar 1c).
cpm cpm cpm
Gambar 1a. Kromatogram Gambar 1b. Kromatogram Gambar 1c. Kromatogram 99m
Tc-tricine memakai ITLC- SG 99mTc tricine memakaiITLC-SG 99mTc-tricine- HYNIC-3E8 sebagai fase diam dan MEK sebagai fase diam dan NaCl memakai ITLC- SG sebagai fase gerak fisiologis sebagai fase gerak sebagaifase diam dan dapar
sitrat 0,1 M pH 5,2 sebagai fase gerak
Untuk melihat pencitraan tumor pada binatang percobaan, maka sediaan 99m Tc-tricine-HYNIC-3E8 diinjeksikan pada mencit gundul masing-masing sebanyak 100μl/200μCi per ekor. Pada pencitraan yang dilakukan 6 jam dan 24 jam pasca injeksi didapat hasil dengan akumulasi yang tinggi pada tumor (Gambar 2). Pada 24 jam pasca injeksi, pencitraan pada otot memberikan akumulasi latar belakang yang lebih rendah dibandingkan dengan penyidikan pada 6 jam setelah injeksi.
Evaluasi in vivo sediaan 99m Tc-tricine-HYNIC-3E8 pada hewan uji mencit gundul dilakukan dengan mengamati biodistribusinya pada 2, 6 dan 24 jam pasca injeksi (Gambar 3). Data yang didapat ditampilkan dalam persen dosis injeksi per gram organ. Terlihat bahwa pada target tumor terdapat akumulasi yang tinggi. Selain itu, akumulasi yang tinggi
didapat pula pada organ limpa dan ginjal (masing-masing 16 % dan 14 % ID/g). Apabila dihitung rasio tumor terhadap darah pada selang waktu tersebut diatas, terlihat bahwa rasio tersebut meningkat seiring dengan berjalannya waktu (Gambar 4).
Dalam 2 jam pertama pada penelitian ini didapat akumulasi yang tertinggi pada darah diikuti oleh ginjal dan limpa, namun dengan pengeluaran dari darah (blood clearence) yang cepat selama selang waktu 6 jam dan 24 jam, maka akumulasi pada darah menjadi rendah. Hal ini dikelompokkan dalam akumulasi yang tidak spesifik.
Rasio akumulasi pada tumor terhadap darah terlihat meningkat seiring dengan berjalannya waktu pada selang 24 jam pasca injeksi (Gambar 4).
6 jam pasca injeksi 24 jam pasca injeksi
J J H H T T
6 jam pasca injeksi 24 jam pasca injeksi
Gambar 2. Pencitraan tumor dengan 99mTc-tricine-HYNIC-3E8 pada mencit gundul yang diimplantasi sel kanker LS174T, J= jantung, H= hati, T= tumor
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 Da rah Hati Paru Lim pa Ginj al Lam bung Usu s hal us Usu s bes ar Tiro id Otot Tulan g paha Tum or ( LS174T ) % ID /k g or ga n 2 Jam 6 Jam 24 Jam
Gambar 3. Uji biodistribusi larutan 99mTc-tricine-HYNIC-3E8 pada mencit yang diimplantasi sel kanker LS174T
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80 2H 6H 24H rasi o tu m o r te rh ad a p d ar a h
Gambar 4. Rasio akumulasi tumor terhadap darah untuk larutan 99mTc-tricine-HYNIC-3E8 pada mencit yang diimplantasi sel kanker LS174T pada 2, 6 dan 24 jam pasca injeksi
4. KESIMPULAN
Sediaan 99mTc-tricine-HYNIC-3E8 dapat dibuat dengan metode penandaan tak langsung dari antibodi monoklonal 3E8 dengan 99mTc menggunakan HYNIC sebagai pengkelat fungsi ganda dan tricine sebagai koligand, memberikan efisiensi 99% dan kemurnian radiokimia yang tinggi sebesar 98%. Pemberian sediaan tersebut kepada mencit gundul yang diimplantasi sel kanker LS174T memberikan akumulasi yang tinggi pada tumor. Pada uji biodistribusi didapat peningkatan rasio tumor terhadap darah seiring dengan berjalannya waktu pada selang 24 jam. Berdasarkan hasil penelitian di atas, maka disimpulkan bahwa sediaan 99m Tc-tricine-HYNIC-3E8 dapat digunakan sebagai sediaan untuk mendeteksi radioimun pada tumor yang mengekspresikan antigen TAG-72.
5. UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis mengucapkan terimakasih kepada Hong, J.H (KIRAMS) atas pemberian antibodi monoklonal 3E8 yang digunakan dalam penelitian ini.
6. DAFTAR PUSTAKA
1. MURARO, R., KUROKI, M.,
WUNDERLICH, D., POOLE, D.J., COLCHER, D., THOR, A., GREINE, J.W., SIMPSON, J.F., MOLINOLO, A.,
NOGUCHI, P. AND SCHLOM, J.,
Generation and characterization of B72.3
second generation monoclonal antibodies reactive with the tumor-associated glycoprotein 72 antigen. Cancer Res 48, (1988) 4588-4596
2. COLCHER, D., HORAN, H.P., NUTI, M. AND SCHLOM, J., A spectrum of monoclonal antibodies reactive with human mammary carcinoma tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 78,(1981) 3199-3201
3. YOON, S.O., LEE,T.S., KIM, S.J., JANG, M.H., KANG, Y.J., PARK,J.H., KIM. K.S., LEE, H.S., RYU, C.J., GONZALES, N.R., KASHMIRI, S.V.S., LIM, S.M., CHOI, C.W. AND HONG, H.J., Construction, Affinity Maturation, and Biological Charactrization of Anti-tumor Associated Glycoprotein-72 Humanized Antibody, The Journal of Biological Chemistry 281 (11)(2006) 6985-6992
4. NGAI, W.M. AND REILLY, R.M., A Simple Method to Determine the Immunoreactiviy of Radiolabeled Monoclonal Antibodies to the TAG-72 Antigen, Appl. Radiat. 44 (9) (1993) 1193-1197
5. LINDMO, T., BOVEN, E., CUTTITTA, F., FEDORKO, J. AND BUNN, P.A. Jr., Determination of the Immunoreactive Fraction of Radiolabeled Monoclonal Antibodies by Linear Extrapolation to Binding at Infinite Antigen Excess. Journal of Immunological Methods 72 (1984) 77-89
7. LAMPIRAN
7.1. Penyiapan lyofilisasi kit tricine/SnCl2
(Lee, T.S)
Sebanyak 98 mL aquades dideoksigenasi dengan memanaskan dan mendinginkan di bawah gas Argon di dalam labu Erlenmeyer bersih dan kering yang berisi 3,6 gram (N-[Tris(hydroxymethyl) methyl]glycine). Nilai pH larutan diatur pada 7,1 menggunakan NaOH 0,1 N. Labu dialiri gas Argon selama 60 menit dan kemudian ditutup rapat. Sebanyak 80 mL larutan SnCl2.2H2O (50 mg/mL) di dalam HCl 0,1 N yang dideoksigenasi ditambahkan ke dalam larutan Tricine tersebut. Satu mililiter larutan Tricine/SnCl2 ditransfer kedalam vial yang berisi gas Argon kemudian dibekukan pada -78oC, selanjutnya dilakukan lyofilisasi. Kandungan akhir adalah 36 mg Tricine dan 0,04 mg SnCl2 pada pH 7,1.
7.2. Penyiapan konjugat HYNIC-3E8
( Lee, TS,)
Larutan A dibuat dengan melarutkan 15.9
μg HYNIC (BM=262) di dalam
dimethylsulphoxide (DMSO) sehingga konsentrasi akhir adalah 64 mg/mL. Larutan B dibuat dengan melarutkan 10 mg antibodi 3E8 di dalam 1 mL bufer posfat salin 0,1 M (pH=7,8). Sebanyak 1 mL larutan A ditambahkan ke dalam larutan B kemudian dikocok dengan alat vortex pada temperatur kamar. Pengocokan dilanjutkan secara perlahan selama 5 jam di dalam kamar gelap. Dialysis dengan bufer sitrat salin 10 mM (pH=5,2) dilakukan selama 24 jam dengan penggantian bufer sebanyak 5 kali. Volume akhir dibuat serendah mungkin dengan alat Centricon-30. Konsentrasi akhir diatur menjadi 10mg/mL dengan bufer sitrat pH = 5,2. Kemudian dibuat aliquot 1 mg/0,1 mL di dalam tabung Eppendorf dan disimpan pada temperatur -20oC.
8. DISKUSI
Yana Sumpena-PTNBR BATAN :
1. Koreksi untuk penyuntikan (induksi sel kanker) pada otot paha dilakukan subkutan atau intramuscular, bukan secara intravena.
2. LS174T merupakan jenis kanker apa?
Siti Darwati:
1. Ya, terima kasih.
2. LS174T adalah cell line yang diekstraksi dari kanker usus metastasis manusia.
Rochestri Sofyan-PTNBR BATAN:
Penelitian ini sangat menarik karena dilakukan di Korea. Apakah cell line LS174T ini tersedia di PRR? Dan apakah uji pada sel kanker dapat dilakukan di PRR?
Siti Darwati:
Penelitian dilakukan di Korea Selatan. Cell line LS174T tidak tersedia di PRR. Uji sel kanker belum dapat dilakukan di PRR.
Iim Halimah-PTNBR BATAN:
1. Mencit gundul maksudnya mencit tersebut digunduli seluruhnya? Mengapa harus demikian? 2. Sel kanker LS174T diperoleh dari mana?
Siti Darwati:
1. Mencit gundul adalah terjemahan dari nude mice yaitu mencit yang telah dihilangkan sel kekebalannya sehingga dapat digunakan untuk implantasi sel kanker.
2. Sel LS174T didapat dari ATCC.
Azmairit Aziz-PTNBR BATAN:
1. Apa yang dimaksud mencit gundul? 2. Dari mana diperoleh sel kanker?
3. Apakah cell line LS174T terdapat di PRR? 4. LS174T jenis kanker apa?
Siti Darwati:
ditumbuhkan sel kanker. 2. Dari perusahaan Amerika.
3. Tidak, karena belum punya fasilitasnya tetapi akan direncanakan untuk pembuatan fasilitasnya. Uji sel kanker belum dapat dilakukan.
4. Sel untuk kanker usus.
