EKSTRAKSI KOMPONEN BIOAKTIF DAUN KETEPENG CINA (Senna alata L.) MENGGUNAKAN METODE ULTRASONIK DAN MASERASI PADA BERBAGAI
KONSENTRASI PELARUT
EXTRACTION OF BIOACTIVE COMPONENTS OF KETEPENG CINA (Senna alata L.) LEAFS USING ULTRASONIC AND MACERATION METHODS
ON VARIOUS SOLUTION CONCENTRATIONS
Adnan Nur Avif a* dan Ardhi Billih Yaqhsa b
a Prodi Farmasi Politeknik Indonusa Surakarta Jl. K.H. Samanhudi No.31, Surakarta, Indonesia
b Fakultas Farmasi, Universitas Ahmad Dahan JL. Prof. Dr. Soepomo, S.H. Janturan Yogyakarta, Indonesia
*Email: adnan@poltekindonusa.ac.id
ABSTRAK
Ketepeng cina (Senna alata L.) merupakan salah satu spesies tanaman yang banyak tumbuh di daerah tropis yang daunnya memiliki berbagai komponen bioaktif yang telah digunakan sebagai obat tradisional untuk mengobati penyakit kulit. Ketepeng cina telah dibudidayakan di beberapa wilayah di Indonesia dan hasilnya di ekspor ke luar negeri untuk dijadikan bahan baku obat. Selama ini proses ekstraksi tanaman masih menggunakan metode maserasi, metode ini sederhana namun memiliki kelemahan dalam segi waktu sehingga membuatnya kurang efisien. Metode ekstraksi menggunakan gelombang ultrasonik menjanjikan proses ekstraksi yang lebih efisien dibandingkan dengan metode maserasi. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui perbedaan teknik ekstraksi dan konsentrasi pelarut terhadap konsentrasi senyawa fitokimia pada daun ketepeng cina. Desain penelitian menggunakan rancangan acak lengkap pola faktorial. Faktor pertama adalah teknik ekstraksi daun ketepeng cina (maserasi, ultrasonikasi) dan faktor kedua adalah konsentrasi pelarut/etanol (40%, 70%, 96%) Parameter pengamatan meliputi analisa kandungan senyawa total fenolik, flavonoid dan tanin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penggunaan teknik ultrasonikasi memberikan efisiensi dalam waktu ekstraksi dibandingkan teknik maserasi. Penggunaan etanol 70% menghasilkan konsentrasi senyawa total fenolik dan flavonoid yang lebih tinggi masing- masing (28,17 mgGA/g) dan (17,61 mgQE/g), namun konsentrasi tanin paling banyak dihasilkan oleh pelarut etanol 96% yaitu sebesar 6,78 mgAT/g.
Kata Kunci: Senna alata; ketepeng cina; ekstraksi; ultrasonik
ABSTRACT
Adnan Nur Avif and Ardhi Billih Yaqhsa. 2021. Extraction of Bioactive Components of Ketepeng Cina (Senna alata L.) Leafs Using Ultrasonic and Maceration Methods on Various Solution Concentrations
Ketepeng cina Senna alata L. is one of the plant species growing in the tropical climate whose leaves have various bioactive components.
It has been used as a traditional medicine to treat skin diseases. Ketepeng cina has been cultivated in several regions in Indonesia and the results are exported abroad to be used as medicinal raw materials. So far, the plant extraction process is still using the maceration method. This method is simple but has weaknesses in time consumption making it less efficient. The extraction method by ultrasonic waves promises more efficient extraction process than the maceration method. The purpose of this study was to determine the differences in extraction techniques and solvent concentration on the concentration of phytochemical constituents in ketepang cina leaves. The research design used a completely randomized design with two factorial patterns. The first factor was the technique of extracting Ketepeng cina leaves (maceration, ultrasonication), and the second factor was the concentration of solvent/ethanol (40%, 70%, 96%) The observation parameters included analysis of the content of total phenolic compounds, flavonoids, and tannins. The results showed that the use of the ultrasonication technique provided efficiency in extraction time compared to the maceration technique. The use of 70% ethanol resulted in higher concentrations of total phenolic and flavonoid compounds (28,17 mgGA/g) and (17,61 mgQE/g), but the highest concentration of tannins produced by 96% ethanol solvent was 6,78 mgAT/g.
PENDAHULUAN
Ketepeng cina merupakan salah satu tanaman yang tumbuh di daerah beriklim tropis sehingga banyak sekali dijumpai di Indonesia. Tanaman ketepeng cina memiliki daun majemuk dengan daun bunga berwarna kuning berbentuk tandan (Gambar 1). Daun dari tanaman ini banyak dimanfaatkan sebagai obat tradisional oleh masyarakat Afrika dan Asia untuk pengobatan penyakit kulit1,2. Ketepeng cina telah banyak dibudidayakan di Kalimantan, dan simplisia daun ini dijual untuk memenuhi kebutuhan pasar luar negeri3. Daun ketepeng cina mengandung berbagai macam senyawa kimia yang sangat bermanfaat bagi manusia di antaranya steroid, flavonoid, antraquinon, antron dan masih banyak yang lainnya4. Flavonoid dan antraquinon daun ketepeng cina berfungsi sebagai penangkal radikal bebas di dalam tubuh dan sebagai anti kanker5. Toksisitas ekstrak daun ketepeng cina telah diuji terhadap mencit dengan dosis 250-1000 mg/kg berat badan, hasilnya tidak ditemukan adanya perubahan pada hati dan ginjal hewan uji6,7.
Gambar 1. Daun dan bunga dari tanaman ketepeng cina.
Figure 1. The leaves and flowers of the Senna alata.
Proses ekstraksi senyawa aktif dari tanaman herbal masih banyak menggunakan metode maserasi.
Metode ekstraksi ini relatif mudah namun mempunyai beberapa kelemahan antara lain waktu proses yang panjang, penggunaan pelarut yang banyak dan kebutuhan area kerja yang luas yang bila ditinjau dari aspek keberlanjutannya kurang efektif8. Salah satu metode ekstraksi yang dapat dikembangkan adalah menggunakan
dapat mempercepat proses pelepasan komponen bioaktif dalam bagian tanaman ke dalam pelarutnya9.
Efektivitas proses ekstraksi ditentukan oleh pemilihan jenis pelarut yang digunakan10. Pemilihan pelarut harus mempertimbangkan faktor lingkungan, ekonomi dan peraturan yang berlaku11. Penentuan pelarut proses ekstraksi ditentukan oleh jenis senyawa yang akan diekstrak berdasarkan polaritasnya12 Peraturan industri farmasi mensyaratkan bahwa ekstrak herbal hanya boleh mengandung pelarut yang aman (air, etanol, etil asetat)13. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan teknik ekstraksi daun ketepeng cina menggunakan metode ultrasonikasi dan maserasi pada berbagai tingkat konsentrasi etanol sebagai pelarut terhadap kadar total fenolik, flavonoid dan tanin ekstrak.
BAHAN DAN METODE Bahan
Penelitian dilakukan di laboratorium kimia Politeknik Indonusa Surakarta dan di laboratorium kimia farmasi Universitas Ahmad Dahlan Yogyakarta. Daun ketepeng cina diperoleh dari daerah Boyolali, Jawa Tengah. Semua reagen yang digunakan adalah pro analis, reagen Folin-Ciocalteu, etanol, NaOH, Na2CO3, reagen Folin-Denis, buffer fosfat, NaNO2, AlCl3, K3[Fe(CN)6], FeCl3, asam trikloroasetik, (Merck), standar asam tanat (TA), standar asam galat (GA), dan standar quersetin (QE) (Sigma Aldrich) dan akuades (Jaya Sentosa).
Metode
Persiapan sampel
Daun ketepeng cina dikeringkan menggunakan oven pada suhu 50°C selama 24 jam hingga kadar air
≤ 10%. Selanjutnya daun ketepeng cina kering dihaluskan menggunakan blender (philips HR-2116) dan diayak lolos 60 mesh. Sampel kemudian disimpan dalam pendingin dan siap digunakan untuk diekstraksi.
Ekstraksi daun ketepeng cina
Sebanyak 10 g serbuk daun ketepeng cina kering direndam menggunakan 200 ml etanol konsentrasi 40%, 70%, dan 96%. Proses maserasi dilakukan di dalam wadah kaca diletakkan di tempat yang gelap untuk menghindari paparan sinar matahari. Proses maserasi berlangsung selama 5 hari disertai pengadukan per 12 jam dengan cara membolak-balik wadah.
Proses ekstraksi dengan bantuan gelombang ultrasonik (UAE) dilakukan dengan cara merendam 10 g serbuk daun ketepeng cina kering menggunakan 200 ml etanol pada konsentrasi sesuai perlakuan (40%, 70%, 96%) di dalam ultrasonic bath (Branson M1800E-H), direndam selama 1 jam.
Setelah proses ekstraksi selesai, selanjutnya dilakukan penyaringan dengan kertas saring Whatman No 1. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dalam evaporator vakum putar pada suhu 40°C, sehingga diperoleh ekstrak kasar daun ketepeng cina. Ekstrak ini selanjutnya dianalisis kadar total fenolik, flavonoid, dan tanin.
Total fenolik.
Penentuan total fenolik dengan metode Folin–
Ciocalteau14 dengan sedikit modifikasi. Reagen Folin-Ciocalteu dilarutkan dengan akuades dengan perbandingan 1:9 (v/v) ke dalam 1,25 ml reagen Folin- Ciocalteu yang sudah dibuat ditambahkan 100 µL sampel. Setelah itu, diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang, kemudian ditambahkan 1 ml Na2CO3 (75 g/L). Selanjutnya diinkubasi selama 15 menit pada suhu 50°C dan didinginkan dengan cepat dalam wadah yang berisi air es. Absorbansi dibaca menggunakan spektrofotometer (Thermo GENESYS 10S UV-Vis) pada panjang gelombang 760 nm. Hasil pembacaan dibandingkan dengan kurva standar menggunakan asam galat.
Total flavonoid
Penentuan flavonoid dilakukan dengan metode spektrofotometri dengan reagen alumunium klorida15. Sebanyak 1 mL sampel dicampur dengan 4 mL akuades dan 0,3 mL larutan NaNO2 (10%). Setelah 5 menit, ditambahkan 0,3 mL larutan AlCl3 (10%), diikuti oleh 2 mL larutan NaOH (1%) diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Absorbansi dibaca menggunakan spektrofotometer (Thermo GENESYS 10S UV-Vis) pada panjang gelombang 510 nm. Hasil pembacaan dibandingkan dengan kurva standar menggunakan Quersetin.
Total tanin
Penentuan tanin dilakukan menggunakan metode follin-Ciocalteu16. Sebanyak 0,1 mL ekstrak dicampurkan dengan 0,5 mL reagen folin-Ciocalteu dan 1 mL larutan Na2CO3 (0,5% b/v) kemudian diencerkan hingga volume 10 ml menggunakan akuades. Larutan campuran diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit. Absorbansi dibaca menggunakan spektrofotometer (Thermo GENESYS 10S UV-Vis) pada panjang gelombang 745 nm. Hasil pembacaan dibandingkan dengan kurva
Rancangan percobaan
Dalam penelitian ini digunakan rancangan acak pola faktorial dengan perlakuan metode ekstraksi dan konsentrasi pelarut. Seluruh perlakuan diulang sebanyak tiga kali sehingga diperoleh 18 unit percobaan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi dengan menggunakan metode ultrasonikasi dan maserasi tidak memberikan perbedaan yang signifikan pada randemen ekstrak (Gambar 1), namun berdasarkan waktu ekstraksi metode ultrasonik lebih efisien dibandingkan dengan metode maserasi.
Fenomena tersebut disebabkan karena radiasi gelombang ultrasonik memberikan gaya dorong pelarut untuk memecah partikel sampel17. Dengan adanya gelombang ultrasonik terjadi pembentukan gelembung udara berukuran kecil pada pelarut yang kemudian akan terurai ketika mendekati permukaan partikel sampel disertai dengan perubahan bentuk gelembung. Perubahan bentuk gelembung udara tersebut menghantam partikel sampel dengan kecepatan yang sangat tinggi sehingga senyawa aktif akan dengan mudah keluar dari partikel pembawanya18.
Gambar 2. Hubungan dan konsentrasi pelarut terhadap rendemen ekstrak daun ketepeng cina.
Figure 2. Methods relation and concentration of solvent on yield of Senna alata leaves extract.
Pemilihan jenis dan konsentrasi pelarut mengacu pada prinsip “like disolve like”, dimana senyawa cenderung akan lebih banyak larut pada pelarut yang cocok. Pada Gambar 2. tampak bahwa konsentrasi pelarut memberikan pengaruh yang signifikan terhadap rendemen ekstrak yang dihasilkan. Penggunaan etanol 40% memiliki randemen tertinggi pada kedua metode ekstraksi, rendemen sebesar 32,03% dengan
maserasi sebesar 20,40%. Fenomena ini dimungkinkan karena penggunaan medium air yang lebih banyak dalam pelarut mempermudah proses perpindahan pelarutan komponen dalam daun ketepeng Cina.
Total Fenolik
Dari hasil pengukuran kadar total fenolik (Gambar 3) diketahui bahwa konsentrasi pelarut memberikan efek yang signifikan terhadap hasil fenolik yang didapatkan pada kedua metode. Tidak ada perbedaan nyata pada ekstraksi dengan pelarut 40%, namun pada konsentrasi 70% dan 96% didapatkan hasil yang berbeda nyata antar kedua metode ekstraksi. Metode ekstraksi memberikan dampak yang signifikan pada hasil total fenolik ekstrak daun ketepeng cina. Hasil ekstrak menggunakan bantuan gelombang ultrasonik menghasilkan konsentrasi total fenolik yang lebih tinggi pada konsentrasi pelarut 70%
dibandingkan dengan metode maserasi. Gelombang ultrasonik dapat membantu mengeluarkan senyawa fenolik dari sel daun dengan lebih baik dari pada hanya menggunakan perendaman biasa19.
Perbedaan konsentrasi pelarut pada kedua metode juga memberikan efek terhadap konsentrasi senyawa total fenolik yang dihasilkan. Konsentrasi total fenolik paling tinggi diperoleh dari penggunaan etanol pada konsentrasi 70% dengan menggunakan metode ultrasonikasi yaitu sebesar 28,17 mg GA/g. Fenomena ini dikarenakan jenis senyawa fenolik yang terdapat dalam daun ketepeng cina lebih mudah larut di dalam pelarut etanol konsentrasi 70%. Efek dari konsentrasi pelarut bergantung pada jenis senyawa fenolik yang terdapat dalam sampel20.
Gambar 3. Hubungan metode dan konsentrasi pelarut terhadap total fenolik ekstrak daun ketepeng cina Figure 3. Methods relation and concentration of solvent
on total phenolic of Senna alata leaves extract.
Dalam Gambar 4 diketahui pengaruh konsentrasi etanol terhadap kadar flavonoid ekstrak daun ketepeng cina. Etanol dengan konsentrasi 40% tidak memberikan pengaruh yang signifikan terhadap hasil flavonoid pada kedua metode. Perbedaan yang nyata dihasilkan ketika menggunakan etanol dengan konsentrasi 70% dan 96%. Kadar flavonoid tertinggi diperoleh dari pelarut 70% dengan metode ultrasonikasi yaitu sebesar 17,61 mgQE/g. Hasil terendah 9,03 mgQE/g didapatkan pada konsentrasi 40% menggunakan metode ultrasonik.
Hasil yang didapat dimungkinkan karena dalam sampel terdapat jenis flavonoid yang lebih mudah larut dalam etanol 70%. Fenomena yang sama juga dijumpai dalam penelitian yang dilakukan oleh Fu et al.21 yang melakukan analisa kandungan flavonoid dari daun kacang almond dengan pelarut etanol menggunakan bantuan gelombang ultrasonik dengan pelarut etanol (30-80%), didapatkan hasil bahwa ekstraksi menggunakan etanol 70% menghasilkan rendemen flavonoid paling tinggi dikarenakan dalam daun terdapat jenis senyawa flavonoid yang mudah larut dalam pelarut biner.
Gambar 4. Hubungan metode dan konsentrasi pelarut terhadap flavonoid ekstrak daun ketepeng cina..
Figure 4. Methods relation and concentration of solvent on flavonoid of Senna alata leaves extract.
Tanin
Dari Gambar 5. diketahui bahwa metode ekstraksi tidak memberikan perbedaan yang signifikan terhadap kadar tanin pada masing-masing konsentrasi pelarut.
Konsentrasi pelarut 40% dan 70% yang digunakan pada kedua metode tidak memberikan perbedaan yang berarti, namun pada pelarut 96% hasilnya sangat berbeda nyata.
Penggunaan bantuan gelombang ultrasonik memberikan hasil kadar tanin yang tidak berbeda secara signifikan dari penggunaan metode maserasi. Perolehan kadar
tanin yang kecil dikarenakan dalam ketepeng cina hanya terdapat sedikit tanin yang sebanding dengan asam tanat. Hasil yang serupa juga dijumpai pada penelitian yang dilakukan oleh Benchaachoua22 yang melakukan analisa flavonoid dan tanin dari ekstrak daun Silybum Marianum didapatkan hasil konsentrasi tanin lebih rendah dibandingkan dengan konsentrasi flavonoid.
Gambar 5. juga menunjukkan bahwa konsentrasi tanin tertinggi diperoleh pada kondisi pelarut dengan konsentrasi 96% yaitu sebesar 6,78 mgAT/g dibandingkan dengan etanol pada konsentrasi 40% yang hanya 3,62 mgAT/g. Perbedaan hasil tanin dalam ekstrak disebabkan oleh perbedaan polaritas pelarut yang digunakan. Polaritas dari pelarut sangat menentukan randemen dari senyawa kimia yang diperoleh23. Dikarenakan tanin merupakan senyawa fenolik yang terpolimerisasi dengan berat molekul tinggi yang membentuk kompleks dengan protein pada tanaman sehingga kelarutannya lebih tinggi dalam pelarut etanol pada konsentrasi yang tinggi 24.
Gambar 5. Hubungan metode dan konsentrasi pelarut terhadap tanin ekstrak daun ketepeng cina.
Figure 5. Methods relation and concentration of solvent on tanin of Senna alata leaves extract.
KESIMPULAN
Metode dan konsentrasi pelarut berpengaruh terhadap konsentrasi senyawa fenolik, flavonoid dan tanin daun ketepeng cina. Metode ekstraksi menggunakan gelombang ultrasonik lebih efisien dalam penggunaan waktu dibandingkan dengan metode maserasi.
Penggunaan etanol 70% menghasilkan konsentrasi senyawa total fenolik dan flavonoid yang lebih tinggi masing-masing (28,17 mgGA/g) dan (17,61 mgQE/g), namun konsentrasi tanin paling banyak dihasilkan oleh
pelarut etanol 96% yaitu sebesar 6,78 mgAT/g. Data yang diperoleh dapat digunakan oleh masyarakat untuk menentukan nilai ekonomis proses ekstraksi daun ketepeng cina.
UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Politeknik Indonusa Surakarta atas dana penelitian yang diberikan dalam bentuk Hibah Penelitian Dosen 2019.
DAFTAR PUSTAKA
1. Menteri Kesehatan Republik Indonesia. Keputusan Menteri Kesehatan Tentang Formularium Ramuan Obat Tradisional Indonesia. Kementrian Kesehatan Republik Indonesia;
2017:1-135.
2. Fatmawati S, Yuliana, Purnomo AS, Abu Bakar MF.
Chemical constituents, usage and pharmacological activity of Cassia alata. Heliyon. 2020;6(7):e04396.
3. Mahdalena Z, Norhalimah. Analisis titik impas usahatani tanaman ketepeng cina (cassia alata l) pada PT. srikaya sega utama Banjarbaru. ziraa’ah. 2017;42(3):164-168.
4. Hennebelle T, Weniger B, Joseph H, Sahpaz S, Bailleul F.
Senna alata. Fitoterapia. 2009;80(7):385-393.
5. Raffa D, Maggio B, Raimondi MV, Plescia F, Daidone G.
Recent discoveries of anticancer fl avonoids. Eur J Med Chem. 2017;142:213-228.
6. Roy S, Ukil B, Lyndem LM. Acute and sub-acute toxicity studies on the effect of Senna alata in Swiss Albino mice.
Cogent Biol. 2016;2(1).
7. Ugbogu AE, Okezie E, Atasie OC. Toxicity evaluation of the aqueous stem extracts of Senna alata in wistar rats.
Am J Biomed Res. 2016;4(4):80-86.
8. Chemat F, Rombaut N, Fabiano-Tixier A-S, Pierson JT, Bily A, 1.1. Green Extraction: From Concepts to Research, Education, and Economical Opportunities. In:
Chematand F, Strube J, eds. Green Extraction of Natural Products Related Titles Handbook of Plant Food Food and Industrial Bioproducts and Natural Food Flavors and Colorants Marketing of Natural Cosmetic Natural Products in Chemical. willey Verlag GmbH and CO; 2015:1-36.
9. Vinatoru M, Mason TJ, Calinescu I. Ultrasonically assisted extraction (UAE) and microwave assisted extraction (MAE) of functional compounds from plant materials.
TrAC - Trends Anal Chem. 2017;97:159-178.
10. Yulianti D, Susilo B, Yulianingsih R. Pengaruh lama ekstraksi dan konsentrasi pelarut etanol terhadap sifat fisika-kimia ekstrak daun stevia (stevia rebaudiana bertoni m.) Dengan metode microwave assisted extraction (MAE).
J Bioproses Komod Trop. 2014;2(1):35-41.
Obat.; 2000.
12. Silva BV da, Barreira JCM, Oliveira MBPP. Natural phytochemicals and probiotics as bioactive ingredients for functional foods : Extraction , biochemistry and protected-delivery technologies. Trends Food Sci Technol.
2016;50:144-158.
13. Makanan BPO dan. Perturan Kepala Badan Pengawas Obat Dan Makanan Tentang Persyaratan Mutu Obat Tradisional.;
2014.
14. Darniadi S, Ifie I, Ho P, Murray BS. Evaluation of total monomeric anthocyanin, total phenolic content and individual anthocyanins of foam-mat freeze-dried and spray-dried blueberry powder. J Food Meas Charact.
2019;13(2):1599-1606.
15. Ji YB, Ru X, Yu M, et al. Extraction and determination of total flavonoids in jujube by alcohol extraction Extraction.
IOP Conf Ser Earth Environ Sci. Published online 2017.
16. Saxena V, Mishra G, Saxena A, Kr K. A comparative study on quantitative estimation of tannins in terminalia chebula, terminalia belerica, terminalia arjuna and saraca indica using spectrophotometer. Asian J Pharm Clin Res.
2013;6:5-6.
17. Tiwari BK. Ultrasound: A clean, green extraction technology. Trends Anal Chem. 2015;71:100-109.
18. Saleh IA, Vinatoru M, Mason TJ, Abdel-azim NS, Aboutabl EA, Hammouda FM. Ultrasonics Sonochemistry A possible general mechanism for ultrasound-assisted extraction (UAE) suggested from the results of UAE of chlorogenic acid from Cynara scolymus L . (artichoke) leaves. Ultrason - Sonochemistry. 2016;31:330-336.
Fabiano-Tixier AS, Abert-Vian M. Ultrasound assisted extraction of food and natural products. Mechanisms, techniques, combinations, protocols and applications. A review. Ultrason Sonochem. 2017;34:540-560.
20. Diem Q, Elisa A, Tran-nguyen PL. Effect of extraction solvent on total phenol content, total flavonoid content, and antioxidant activity of Limnophila aromatica. J Food Drug Anal. 2013;22(3):296-302.
21. Fu J, Xiao H, Yu S, Wu H, Berenjian A, Song Y. Response Surface Optimized Ultrasonic Assisted Extraction of Total Flavonoids from Walnut Leaves and In Vitro Antibacterial Activities. Am J Biochem Biotechnol. 2017;13(4):176-188.
22. Benchaachoua A, Bessam HM, Saidi I, Bel-abbes S. Effects of Different Extraction Methods and Solvents on the Phenolic Composition and Antioxidant Activity of Silybum marianum Leaves Extracts. Int J Med Sci Clin Invent.
2018;5(03):3641-3647.
23. Sun C, Wu Z, Wang Z, Zhang H. Effect of Ethanol / Water Solvents on Phenolic Profiles and Antioxidant Properties of Beijing Propolis Extracts. Evidence-Based Complement Altern Med. 2015;2015.
24. Mailoa MN, Mahendradatta M, Laga A, Djide N. Tannin Extract Of Guava Leaves (Psidium guajava L) Variation With Concentration Organic Solvents. Int J Sci Technol Res. 2013;2(9):106-110.
