BAB III. BAHAN DAN METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan selama dua bulan mulai Juli sampai dengan Agustus 2010. Pemeliharaan ayam broiler dimulai dari Day Old Chick (DOC) dilakukan di kandang unggas FKH IPB sampai ayam berumur 42 hari. Pengujian titer antibodi IBD dilakukan di laboratorium Terpadu dan laboratorium Imunologi, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain, lampu, sprayer, penyekat, buku catatan, syringe 3 ml, syringe 1 ml, alat tulis (label dan pulpen), pisau, tempat makan, tempat minum, plastik, selotip, cooling box, timbangan, tabung reaksi, sentrifuse, microplate dengan dasar bentuk V, microtip, micropipette, chamber, inkubator, tabung eppendorf, freezer dan ELISA reader. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Day Old Chick (DOC) ayam pedaging, larutan desinfektan, formalin, alkohol, kapas, sekam, air gula, vitamin Chickofit, vaksin IBD Blend strain Winterfield 2512, virus IBD isolat lapang (dalam hal ini tidak diketahui strainnya), vaksin ND live (tetes), vaksin ND killed (injeksi), pakan berupa konsentrat, air minum, koksidiostat, kandang dan kelengkapannya, sampel (serum), dan IBD ELISA kit (Biocheck).
3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Rancangan Penelitian
Ayam yang digunakan pada penelitian ini berjumlah 104 ekor. Ayam dibagi menjadi dua kelompok, masing-masing kelompok terdiri atas 52 ekor. Sepuluh ekor dari masing-masing kelompok dilakukan pengambilan darah (serum) dan pengamatan terhadap patologi anatomi (bursa Fabricius, limpa, otot dada dan paha) pada hari pertama. Kelompok pertama (K1) merupakan kelompok yang divaksin IBD Blend Strain Winterfield 2512 dengan dosis penuh dan kelompok kedua (K2) merupakan kelompok yang tidak divaksinasi (kontrol).
Vaksinasi IBD dan ND dilakukan sejak ayam umur sehari. Dua kelompok ayam tersebut diberi air gula dan vitamin Chickofit dengan konsentrasi 1 ml dalam 2 liter air minum selama 3-4 hari. Kedua kelompok tersebut diberikan vaksin ND live (tetes) dan ND killed (injeksi) dengan dosis 0.1-0.2 ml tiap tetes. Selanjutnya ayam kelompok pertama (K1) diberikan vaksin aktif IBD Blend Strain Winterfield 2512 dengan dosis penuh (0.1 ml). Vaksinasi dilakukan melalui tetes mata (eye drop).
Setiap pagi dilakukan pengamatan gejala klinis disertai dengan penimbangan sisa pakan, pemberian pakan baru dan air minum. Air minum dicampur dengan koksidiostat setiap dua hari sekali. Saat ayam berumur 14, 28, dan 42 hari, ayam tersebut dipotong sebanyak sepuluh ekor untuk diamati gambaran patologi anatominya. Organ yang diamati yaitu bursa Fabricius, limpa, otot paha, dan otot dada.
Uji tantang dilakukan pada hari ke-28. Sepuluh ekor ayam dari masing-masing kelompok ditantang. Ayam tersebut ditantang dengan virus IBD aktif isolat lapang sebanyak 0.1 ml/ekor (105TCID50) melalui oral dan intra kloaka.
3.3.2 Pengambilan Sampel
Sampel darah diambil secara acak dari masing-masing kelompok sebanyak sepuluh sampel pada hari ke-1, 14, 28, dan 42. Pengambilan darah sebanyak 0.5 ml pada hari ke-14 dengan menggunakan syiringe 1 ml, sedangkan pengambilan darah hari ke-28 dan 42 sebanyak minimal 0.5 ml menggunakan syringe 3 ml. Pengambilan darah pada hari ke-42 dilakukan baik terhadap kelompok yang ditantang maupun yang tidak ditantang. Tiap sampel diberi nomor kelompok dan nomor urut pengambilan. Sampel disimpan di refrigerator. Setelah didiamkan selama 24 jam, serum yang diperoleh dipisahkan dengan darah dan disimpan pada suhu -20°C (di dalam freezer) hingga pemeriksaan titer dilakukan.
Tabel 1 Rancangan Penelitian
Hari ke- Jumlah Ayam Perlakuan K1 K2
1 52 1. Vaksinasi IBD dosis penuh
(0.1 ml) dan ND tetes + ND suntik
1. Vaksin ND tetes tetes + ND
suntik
2. Pengambilan sampel serum (10 ekor)
3. Nekropsi 10 ekor
pengamatan PA
(BF, limpa, otot dada dan paha)
(10 ekor)
3. Nekropsi 10 ekor
pengamatan PA
(BF, limpa, otot dada dan paha)
14 42 1. Pengambilan sampel serum
(10 ekor)
2. Nekropsi 10 ekor
pengamatan PA
(BF, limpa, otot dada dan paha)
1. Pengambilan sampel serum
(10 ekor)
2. Nekropsi 10 ekor
pengamatan PA
(BF, limpa, otot dada dan paha)
28 32 1. Pengambilan sampel serum
(10 ekor)
2. Nekropsi 10 ekor
pengamatan PA (BF, limpa, otot dada dan paha)
3. Challenge (10 ekor)
1. Pengambilan sampel serum
(10 ekor)
2. Nekropsi 10 ekor
pengamatan PA (BF, limpa, otot dada dan paha)
3. Challenge (10 ekor)
42T- 10 1. Pengambilan sampel serum
(10 ekor)
2. Nekropsi 10 ekor
pengamatan PA (BF, limpa, otot dada dan paha)
1. Pengambilan sampel serum
(10 ekor)
2. Nekropsi 10 ekor
pengamatan PA (BF, limpa, otot dada dan paha)
42T+ 10 1. Pengambilan sampel serum
(10 ekor)
2. Nekropsi 10 ekor
pengamatan PA (BF, limpa, otot dada dan paha
1. Pengambilan sampel serum
(10 ekor)
2. Nekropsi 10 ekor
pengamatan PA (BF, limpa, otot dada dan paha
3.3.3 Pembacaan Scoring Perubahan Patologi Anatomi
Persentase (%) menunjukkan bahwa banyaknya jumlah ayam yang mengalami perubahan patologi anatomi dari sepuluh ekor ayam yang dinekropsi.
3.3.4 Prosedur Pengukuran Titer Antibodi dengan Uji ELISA
Serum yang diperoleh dari pengambilan darah pada hari ke-1, 14, 28, dan ke- 42 diukur titer antibodinya terhadap IBD. Pengukuran titer antibodi dilakukan dengan teknik indirect ELISA yaitu menggunakan microplate yang telah dicoating antigen virus IBD untuk mendeteksi keberadaan antibodi pada hewan coba. ELISA dapat digunakan untuk mendeteksi antibodi atau antigen baik secara kualitatif maupun kuantitatif. Bahan yang harus disediakan yaitu satu paket ELISA kit yang terdiri dari ELISA plate, dilution buffer, kontrol positif, kontrol
negatif, washing solution, diluent sample, conjugate, substrat ABTS, stop solution, dan record sheet.
Sampel diencerkan 100 kali dengan perbandingan 3 µl serum dan 300 µl buffer pengencer. Sampel dimasukkan ke dalam semua pada microplate kecuali pada sumur A1, A2, A3, H10, H11, dan H12. Sumur A1, H10, dan H12 diisi dengan kontrol negatif sebanyak 100 µl. Sumur A2, A3, dan H11 diisi dengan kontrol positif sebanyak 100 µl. Plate yang telah berisi sampel diinkubasi selama 30 menit pada suhu 27 °C . Sementara itu, dilakukan pengenceran washing solution dengan perbandingan 1:20, yaitu 20 ml dari washing solution dilarutkan dalam 380 ml aquades. Washing solution dimasukkan ke dalam plate dan didiamkan selama tiga menit, kemudian dibuang. Pencucian ini dilakukan sebanyak tiga kali kemudian plate dikeringkan. Kemudian conjugate ditambahkan sebanyak 100 µl pada ELISA test plate dan dicampur dengan cara menggoyang plate secara pelan-pelan. Plate diinkubasi selama 30 menit pada suhu 27 °C. Setelah itu dilakukan pencucian kembali seperti langkah sebelumnya. Selanjutnya pada masing-masing sumur ditambahkan 100 µl substrat ABTS dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 27 °C. Stop solution ditambahkan sebanyak 100 µl pada masing-masing sumur (well ELISA test plate). Tahap terakhir pembacaan hasil dilakukan pada microplate reader dengan panjang gelombang 405 nm.
Hasil pembahasan ELISA reader berupa angka-angka yang disebut dengan Optical Density (OD). Titer antibodi dihitung berdasarkan nilai S/P (Sample value related to positif value). Rumus S/P yang dapat digunakan adalah sebagai berikut.
S/P = Sampel OD – Rataan OD kontrol negatif
Rataan OD kontrol positif – Rataan OD kontrol negative
Berdasarkan nilai S/P dihitung titer antibodinya dengan rumus sebagai berikut. Log10 titer = 1.35 x Log10 S/P + 3.425
Status antibodi IBD ditentukan dengan mengacu pada ketentuan brosur yang disertakan dalam ELISA kit (Tabel 2).
Tabel 2 Ketentuan hasil interpretasi titer antibodi terhadap IBD dengan metode ELISA
Titer Antibodi Status Antibodi IBD
<3000 ELISA Unit Kurang protektif
3000-6000 ELISA unit Protektif
