ISSN: 2087-7706
PENGEMBANGAN BIOSENSOR ELEKTROKIMIA BERBASIS ENZIM
ASETILKOLINESTERASE UNTUK ANALISIS RESIDU PESTISIDA PADA
PRODUK PERTANIAN
Electerochemical Biocensor Development Based On The
Acetylcholinesterase Enzyme To Analyze of Pesticide Recidue on
Agriculture Products
MASHUNIDepartment of Chemistry , Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Haluoleo University (UNHALU), Kendari, Sulawesi Tenggara, 93231
ABSTRACT
Pesticide is one of dangerous chemical compounds in environment. Its existence has spread so it can cause negative effect for human. Pesticide compound is toxic in for nervous system so that a quick detection system is needed to protect human’s health and as a control for agricultural product. Therefore, we conducted a research of electrochemical biosensors development based on enzyme acetylcholinesterase in electrode to analyze pesticide residue so that a more superior and reliable biosensors can be obtained for pesticide residue analysis in foodstuff samples, especially for agricultural product. Residue analysis of carbamate and organophosphate in foodstuff sample requires a sensitive, selective, cheap-and-easy-operated, and quick-analyzed tools. A new research has been designed in making of biosensors electrode by using immobilization method of enzyme acetylcholinesterase (AChE) with the supporting materials of Acetate Selulose (AS) and Glutaraldehid (GA) in biosensor electrode connected with electrochemical transducer. Designed biosensors were characterized, including Nernst factor, the detection limit, response time, and period of use. Next, biosensors were tested in sample of vegetables and fruits. Expected result was a biosensor prototype with better work than pesticide determination with instrument of Gas Chromatography (GC) and High Pressure Liquid Chromatography (HPLC). Biosensor development offers low cost, accurate, quick analysis time, and sensitive to detect pesticide residue.
Keywords: : Pesticide, Biosensor, Electrochemical, Enzim, Sensitive
1
PENDAHULUAN
Perkembangan penemuan baru dibidang kimia, terutama pestisida di tahun 1940 an selain menimbulkan dampak positif, terutama dibidang pertanian yang ditandai dengan meningkatnya produksi pertanian, juga menimbulkan dampak negatif bagi makhluk hidup. Penggunaan pestisida sangat luas antara lain pada bidang kesehatan, pertanian dan kehutanan. Setelah perang dunia II, pestisida banyak digunakan dibidang pertanian yaitu dalam program green revolution yang bertujuan meningkatkan hasil
*) Corrresponding author:
E-Mail address: mashuni2696@yahoo.com
pertanian setinggi-tingginya melalui manipulasi genetik, peningkatan penggunaan air dan pupuk serta pengendalian hama dengan pestisida. Salah satu kelemahan penggunaan pestisida adalah matinya spesies non target, sehingga dapat merusak suatu ekosistem dan pemulihannya memerlukan waktu yang lama (Buchari et al., 1999).
Pestisida merupakan salah satu senyawa kimia berbahaya di lingkungan, yang paling besar jumlahnya terutama dalam tanah, air, atmosfer dan produk pertanian. Keberadaannya begitu meluas di lingkungan dan dapat menimbulkan polusi. World Health Organisation (WHO) dan program lingkungan Perserikatan Bangsa Bangsa memperkirakan
ada 3 juta orang yang bekerja pada sektor pertanian di negara-negara berkembang terkena racun pestisida dan 18.000 orang diantaranya meninggal setiap tahunnya (Sarjan, 2009).
Dalam beberapa dekade terakhir pemakaian pestisida didominasi oleh dua jenis insektisida yaitu senyawa karbamat dan organofosfat. Kedua senyawa tersebut banyak digunakan pada pengolahan pertanian karena kestabilannya yang rendah di lingkungan dibandingkan dengan senyawa organoklorin (Skadal et al., 1997; Pogacnik dan Franko, 2003).
Toksisitas pestisida karbamat dan organofosfat terhadap manusia dan hewan disebabkan oleh kemampuannya menghambat kelompok enzim hidrolase yang disebut esterase. Enzim asetilkolinesterase (AChE) sangat penting untuk sistem saraf pusat pada manusia dan serangga (Prieto-Simon et al., 2006).
Untuk kepentingan kesehatan dan lingkungan, pada umumnya negara-negara di dunia telah mengontrol penggunaan pestisida pada bidang pertanian. Beberapa organisasi mengatur batas maksimum residu pestisida pada konsumsi air minum dan pangan bagi manusia dan hewan. Beberapa diantaranya adalah the Food and Agricultural Organisation (FAO), the World Health Organisation (WHO), the European Community (EU). Salah satu kebijakan yang dikeluarkan oleh the EU adalah memonitor batas konsentrasi total pestisida yang diperbolehkan tidak melebihi 0,5 µg/L (Prieto-Simon et al., 2006).
Analisis pestisida yang sudah sering dilakukan adalah dengan kromatografi gas (GC) atau kromatografi cair tekanan tinggi (HPLC). Environmental Protection Agency (EPA) telah melakukan analisis kandungan beberapa residu pestisida karbamat (karbofuran dan karbaril) dengan HPLC pada air dan makanan. Limit deteksi masing-masing senyawa karbamat tersebut adalah 2,0 ppb dan 1,5 ppb (Velasco-Garcia et al., 2003; Mehrvar dan Abdi, 2004)
Sekarang ini sedang dikembangkan analisis pestisida dengan biosensor. Analisis pestisida dengan biosensor dapat menghasilkan respon yang cepat, selektif, sensitif dan sederhana (Velasco-Garcia et al., 2003; Mehrvar dan Abdi, 2004)
Biosensor adalah peralatan analitik yang merupakan penggabungan antara komponen biologi (enzim) dan transduser fisika untuk mendeteksi suatu senyawa target. Enzim yang digunakan adalah yang dapat bereaksi secara selektif dengan substrat. Biosensor memiliki sensitivitas dan selektivitas yang tinggi, kecepatan respon, pengoperasiannya yang mudah, maka biosensor menjadi suatu peralatan penting untuk mendeteksi komponen kimia dan biologi, obat-obatan, makanan dan monitoring lingkungan (Baeumner, 2003; Amine et al., 2006; Renedo et al., 2007; Tudorrache dan Bala, 2007).
Dalam penelitian ini akan didesain prototipe biosensor elektrokimia untuk analisis senyawa pestisida golongan karbamat. Oleh karena membran elektroda merupakan tempat timbulnya potensial atau arus yang dihasilkan oleh reaksi yang dikatalisis oleh enzim yang terdapat pada membran elektroda dengan larutan yang dianalisis maka parameter membran elektroda sangat menentukan kinerja dari biosensor. Desain biosensor pestisida menggunakan membran enzim asetilkolinesterase (AChE) dan kolin oksidase (ChO) yang diimmobilisasikan dengan bahan pendukung selulosa asetat (SA) dan glutaraldehid (GA).
BAHAN DAN METODE
Bahan yang digunakan adalah kawat perak, KCl, kawat tembaga, kawat platina, kawat timah, enzim asetilkolinesterase (AChE), enzim kolin oksidase (ChOx), Selulosa Asetat
(SA), Glutaraldehid (GA), asetilkolin klorida, pestisida karbamat (karbofuran), NaH2PO4.H2O, Na2HPO4.12H2O, aseton, etanol,
aquades, parafilm, sedangkan
Preparasi sampel sayur dan buah.
Sampel sayur dan buah masing-masing sebanyak 10 gram diblender dengan 50 ml metanol selama 2 menit atau sampai terbentuk bubur yang homogen. Setelah itu sampel disaring kemudian ampasnya dibilas dua kali dengan etanol masing-masing sebanyak 10 ml. Filtrat dikumpulkan, selanjutnya dievaporasi sampai volumenya kurang lebih 20 ml. Evaporasi dilakukan dalam bath pada suhu 50 oC.
Pembuatan larutan standar. Penyiapan
larutan NaH2PO4. H2O 0,2 M (larutan A) dan
Selanjutnya dari larutan A dan larutan B dibuat masing-masing larutan buffer fosfat pH 8,0. Larutan standar substrat asetilkolin klorida dibuat dalam pelarut buffer fosfat pH 8,0 pada konsentrasi 1 x 10-3 M - 1 x 10-9 M.
Selanjutnya larutan standar pestisida karbofuran 1 x 10-1 M disiapkan dengan
menimbang secara teliti karbofuran kemudian dilarutkan dengan etanol dalam labu ukur 100 ml diencerkan sampai tanda batas. Terhadap larutan ini kemudian dilakukan pengenceran sampai konsentrasi 1 x 10-2 M -
1 x 10-9 M. Penyiapan larutan KCl 0,1 M,
dilakukan dengan melarutkan 0,7445 gram KCl ke dalam aquades pada labu ukur 100 ml selanjutnya diencerkan dengan aquades hingga tanda batas.
Pembuatan larutan enzim AChE dan ChO. Enzim AChE dari Electrophorus
electricus Sigma 1,17 mg dengan aktivitas 425,94 unit per mg padatan dilarutkan dalam pelarut 9,0 ml buffer fosfat pH 8,0 dan 1 ml KCl 0,1 M. Enzim ChOx dari Alcaligenes sp
lyophilized Sigma sebanyak 3,3 mg dengan aktivitas 15 unit per mg padatan dilarutkan dalam pelarut 9,0 ml buffer fosfat pH 8,0 dan 1 ml KCl 0,1 M.
Pembuatan selulosa asetat 5%, 10%, 15% dan glutaraldehid 15%. Selulosa
Asetat (SA) 5%, 10% dan 15% dibuat dengan menimbang masing-masing 0,5 gram, 1,0 gram dan 1,5 gram SA. Selanjutnya masing-masing SA dilarutkan dengan aseton 10 ml. Larutan Glutaraldehid (GA) 15% yang digunakan pada penelitian ini adalah produksi Aldrich Sigma dari larutan ini dibuat pengenceran sehingga didapatkan 15%.
Pembuatan membran Biosensor.
Membran dibuat dari enzim
asetilkolinesterase (AChE) dan kolin oksidase (ChOx) yang diimmobilisasikan pada bahan
pendukung selulosa asetat (SA) dan glutaraldehid (GA) dengan komposisi seperti pada Tabel 1.
Tabel 1 Komposisi biosensor pestisida
Komposisi Membran
Selulosa
Asetat (SA) hid (GA) Glutaralde (IU/ml) AChE (IU/ml) ChO 5 % 15 % 49,83
03 4,95 10 % 15 %
15 % 15 %
Disain elektroda biosensor tipe kawat terlapis. Badan elektroda dibuat dari kawat
tembaga panjang 7 cm dengan diameter 1 cm disambungkan dengan kawat platina (Pt) panjang 2,0 cm berdiameter 0,4 mm kemudian dipatri menggunakan kawat timah. Selanjutnya dimasukkan ke dalam tip biru dengan posisi kawat platina (Pt) menonjol keluar 1,5 cm digunakan sebagai badan elektroda. Pada masing-masing badan elektroda dililitkan plastik parafilm sebagai perekat kawat Cu dan kawat Pt. Bagian ujung elektroda yaitu kawat Pt dicelupkan dalam larutan homogen selulosa asetat. Setelah lapisan selulosa asetat terbentuk, elektroda dibilas dengan aquades sebanyak tiga kali. Selanjutnya pada bagian kawat Pt yang telah dilapisi membran selulosa asetat dicelupkan dalam larutan glutaraldehid selama enam jam setelah itu elektroda dibilas buffer fosfat pH 8,0 maka terbentuk elektroda membran (Em), selanjutnya Em dicelupkan dalam buffer fosfat pH 8,0 yang mengandung enzim asetilkolinesterase dan enzim kolin oksidase selama 48 jam. Elektroda membran (Em) yang belum digunakan tetap dicelupkan ke dalam buffer fosfat pH 8,0 pada temperatur 4 0C.
Pengukuran Batas Deteksi Biosensor Pestisida. engukuran potensial substrat
Asetilkolin klorida dengan inhibitor pestisida karbofuran dengan cara elektroda biosensor yang telah dibuat sebelum dipakai terlebih dahulu dicelupkan dalam larutan buffer fosfat pH 8,0 kemudian elektroda biosensor digunakan untuk mengukur potensial substrat asetilkolin klorida dengan konsentrasi 10-3 M
yang telah ditambahkan larutan karbofuran dengan konsentrasi bervariasi dari 10-3 – 10-9
M. Pengukuran respon biosensor seperti Gambar 1.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini menggunakan transduser elektrokimia dengan metode potensiometrik. Analisis pada metode potensiometrik, kesetimbangan lokal terjadi pada antarmuka sensor. Potensial elektroda dan potensial membran diukur, selanjutnya informasi tentang suatu sampel didapatkan dari perbedaan potensial antara dua elektroda.
Elektroda biosensor dibuat dari kawat platina (Pt) yang dilapisi membran selulosa asetat (SA) sebagai bahan pendukung, membran ini memiliki kestabilan yang baik terhadap berbagai macam zat kimia, dan
glutaraldehid (GA) yang berfungsi sebagai pengikat antara enzim dengan bahan
pendukung.
Gambar 1. Desain pengukuran respon biosensor Enzim yang diimmobilisasikan pada
membran elektroda biosensor adalah asetilkolinesterse (AChE) dan enzim kolin oksidase (ChO). Enzim yang paling banyak digunakan untuk mendeteksi senyawa pestisida adalah enzim kolinesterase. Hasil desain biosensor diuji responnya dengan potensiometer.
Metode analisis yang spesifik bagi penentuan kuantitatif suatu unsur atau molekul dalam jumlah renik pada suatu sampel selalu dihadapkan pada limit deteksi yang dinyatakan dengan suatu konsentrasi terendah dari suatu zat yang dapat ditentukan. Penentuan limit deteksi suatu elektroda dapat dilakukan dengan membuat garis singgung pada fungsi linier yang Nernstian dan non Nernstian. Titik potong kedua garis diekstrapolasikan ke sumbu x sehingga dapat diperoleh konsentrasi limit deteksi. Hasil penentuan limit deteksi elektroda biosensor yang telah didisain dapat dilihat pada Gambar 2 sampai gambar 4.
Dari hasil ekstrapolasi terhadap sumbu x yaitu – log [karbofuran] diperoleh limit deteksi biosensor dengan komposisi membran SA 5%, GA 15% adalah 10-7,5 M (≈ 0,00221
ppm atau 2,2 ppb. Limit deteksi biosensor dengan komposisi membran SA 10%, GA 15% adalah 10-7,8 M (≈ 0,00221 ppm) dan limit
deteksi biosensor dengan komposisi membran SA 15%, GA 15% adalah 10-7,2 M (≈ 0,0221 ppm). y = -32.24x + 13.74 R2 = 0.8453 y = 0.9x + 265.23 R2 = 0.8322 0 50 100 150 200 250 300 350 400 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 log [karbofuran] mV
Gambar 2 Limit deteksi biosensor untuk komposisi membran SA 5%, GA 15% pada konsentrasi substrat 10-3 M (A)
y = -32.43x - 5.46 R2 = 0.9307 y = 1.1x + 253.83 R2 = 0.784 0 50 100 150 200 250 300 350 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 log [karbofuran] mV
Gambar 3. Limit deteksi biosensor untuk komposisi membran SA 10%, GA 15% pada konsentrasi substrat 10-3 M (B)
y = -20.21x + 61.98 R2 = 0.8565 y = 0.25x + 213.22 R2 = 0.9868 0 50 100 150 200 250 300 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 log [karbofuran] mV
Gambar 4. Limit deteksi biosensor untuk komposisi membran SA 15%, GA 15% pada konsentrasi substrat 10-3 M (C)
Pada Gambar 2 – 4 hasil ekstrapolasi terhadap sumbu x -yaitu – log [karbofuran] diperoleh limit deteksi biosensor 10-7,2 - 10 -7,8 M (≈ 0,0221 - 0,00221 ppm). Limit deteksi
terendah didapatkan dari komposisi membran elektroda dengan bahan pendukung selulosa asetat 15% dibandingkan limit deteksi hasil disain biosensor lainnya. Hal ini disebabkan karena zat pendukung membran yaitu SA konsentrasinya lebih tinggi dari komposisi membran lainnya yaitu 15%. Tingginya konsentrasi selulosa asetat menyebabkan lapisan pori-pori membran semakin mampat sehingga kesetimbangan terganggu menyebabkan limit deteksi biosensor menurun. Immobilisasi enzim AChE dan ChO pada bahan pendukung selulosa asetat dan glutaraldehid dapat dilakukan dalam pembuatan membran biosensor pestisida. Membran selulosa asetat memiliki kestabilan yang baik terhadap berbagai macam zat kimia, mempunyai kekuatan mekanik yang baik sehingga tahan tehadap tekanan tinggi dan selektif sehingga dapat menahan materi yang sangat kecil. Biosensor yang didasarkan pada prinsip inhibisi enzim dapat digunakan secara luas untuk mendeteksi suatu analit seperti komponen pestisida dan logam berat. Pemilihan sistem enzim/analit didasarkan pada kenyataan bahwa analit toksik ini menghambat fungsi normal enzim. Pada umumnya, pengembangan sistem biosensing ini mengandalkan pengukuran kuantitatif pada aktivitas enzim sebelum dan sesudah direaksikan atau dikontakkan dengan suatu analit target. Limit deteksi secara lengkap untuk masing masing komposisi membran biosensor dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Hasil Kinerja Biosensor Tipe Membran Komposisi Membran Kinerja Biosensor GA SA Limit Deteksi (LD) A 15% 5% 10-7,5 M B 10% 10-7,8 M C 15% 10-7,2 M
SIMPULAN
Kinerja biosensor yang telah dianalisis dengan alat Potensiometer menunjukkan bahwa untuk komposisi membran SA 5% dan GA 15% diperoleh limit deteksi 10-7,5 M, untuk
SA 10% dan GA 15% diperoleh limit deteksi 10-7,8 M, untuk SA 15% dan GA 15% diperoleh
limit deteksi 10-7,2 M. Limit deteksi 10-7,8 M
tersebut sebanding dengan 0,0022 ppm atau 2,2 ppb. Kemampuan unjuk kerja biosensor meliputi spesicisitas yang tinggi dan sensitivitas, kecepatan respon, biaya yang relatif murah, peralatan yang relatif kompak, dan pengoperasian peralatan yang mudah dan aman, maka biosensor menjadi suatu peralatan yang penting untuk mendeteksi komponen biologi dan kimia pada bidang kesehatan, pangan dan monitoring lingkungan. Sementara itu gabungan transduser elektrokimia dengan suatu enzim sebagai komponen biologi menyebabkan penggunaannya menjadi luas. Sebagaimana alat ukur instrumen lain seperti GC dan HPLC yang mempunyai limit deteksi karbamat sebesar 2 ppb, maka biosensor hasil disain dapat diaplikasikan untuk mendeteksi pestisida dengan lebih efisien karena dapat dibawa ke lapangan.
UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Dit. P2M-Ditjen DIKTI atas pembiayaan penelitian ini melalui Hibah Penelitian Strategis Nasional pada tahun anggaran 2009 – 2010.
DAFTAR PUSAKA
Amine, A., Mohammadi, H., Bourais, I. and Palleschi, G. 2006. Enzyme Inhibition-Based Biosensors for Food Safety and Environmental Monitoring.
Baeumner, A. 2003. Biosensor for Environmental Poltatants and Food Contaminants. Anal
Bioanal Chem. 377 : 434 – 445.
Buchari, Arka, I., Putra, K.G.D., Dewi, I.G.A.K. 1999.
Kimia Lingkungan. FMIPA. Univ. Udayana. Bali.
Mehrvar, M. and Abdi, M. 2004. Recent Developments, Charachteristics and Potential Applications of Electrochemical Biosensors.
Analytical Science. 20 : 1113 – 1126.
Pogacnik, L., Franko, M. 2003. Detection of Organophosphate and Carbamate Pesticides in Vegetable Samples by a Photothermal Biosensor. Biosnsors and Bioelekctronics. 18 : 109.
Prieto-Simon, B., Campas, M., Andreescu, S. and Marty, J. 2006. Trends in Flow-based Biosensing Syatems for Pesticide Assessment. Sensors. 6 : 1161 – 1186.
Renedo, O.D., Alonso-Limillo, M.A. and Martinez, M.J. 2007. Recent Developments in the Field of Screen-Printed Electrodes and their Related Applications. Talanta. 73 : 202 – 219.
Sarjan, M. 2009. Perlindungan Tanaman dari
Serangan Hama Melalui Pendekatan Teknologi Non-Kimiawi Sintetis. Makalah disajikan dalam
Pidato Pengukuhan Jabatan Guru Besar dalam Hama Tumbuhan Fakultas Pertanian Universitas Mataram, Mataram 12 Pebruari 2009.
Skadal, P., Nunes, G.S., Yamanaka, H., Ribeno, M.L. 1997. Detection of Carbamate Pesticides in Vegetable Samples Using Cholinesterse-based Biosensors. Electroanalysis. 9 :1083-1087. Tudorache, M. and Bala, C. 2007. Biosensors Based
on Screen-Printing Technology, and their Applications in Environmental and Food Analysis. Anal Bioanal Chem. 388 : 565 – 578. Velasco-Garcia, M.N. and Mottram, T. 2003.
Biosensors Technology Addressing Agricultural Problems. Automation and Emerging Technologies. 84 (1) : 1 – 12.
